Les auteurs tiennent à remercier les anciens membres de la Banque laboratoire: Sam-Kyu Kim, Kathryn Plichta et Victoria Miranda-Thompson pour leurs contributions à l&#39;amélioration de plusieurs de ces protocoles. Nous reconnaissons l&#39;appui National Science Foundation (subventions IOS-0840932 et 0724978 IOS) à SP Stock.

1. Sol de prélèvement des échantillons <ol><li> Considérez couvrant une superficie minimale de 2 - 4 m 2 pour chaque site d&#39;échantillonnage. </li><li> Prélever des échantillons de sol à une profondeur d&#39;au moins 15 cm (Figure 4). </li><li> Prenez au moins 5 échantillons aléatoires dans ce domaine. </li><li> Prendre 3 sous-échantillons par échantillon. Selon l&#39;objectif de l&#39;étude, soit combiner les sous-échantillons ou les garder séparés. </li><li> Placer chaque échantillon dans un sac en plastique. Considérez double ensachage pour éviter les fuites d&#39;échantillons (Figure 4). </li><li> échantillons d&#39;étiquettes avec un marqueur à encre indélébile. Inclure les informations suivantes pour chaque site d&#39;échantillonnage: l&#39;information du site (y compris localité / région / nom et coordonnées GPS site d&#39;information), la date, l&#39;habitat, la végétation associée, la température, l&#39;altitude, etc REMARQUE: Le cas échéant, recueillir et / ou d&#39;enregistrer la présence d&#39;insectes ou autres invertébrés récoltés à l&#39;échantillon pour identification ultérieure. Ils peuvent représenter natur potentielhôtes al EPN. </li><li> Outils de collecte propres entre les échantillons par lavage à l&#39;eau et / ou les désinfecter avec 70% d&#39;éthanol ou d&#39;eau de Javel à 0,5%. </li><li> Conserver les échantillons dans un refroidisseur (8-15 ° C) pendant le transport vers le laboratoire. </li><li> Prendre une partie de l&#39;échantillon de sol pour analyse afin d&#39;obtenir des informations sur la composition du sol, la texture, l&#39;humidité, la conductivité électrique ou d&#39;autres paramètres relatifs au sol souhaitées. </li></ol> . 2 nématode Isolement à partir des échantillons de sol: Technique de l&#39;insecte-appâts <ol><li> Enlevez tous les débris (c&#39;est à dire., Roches, des morceaux de bois ou d&#39;écorce, feuilles, etc.) Recueillies avec vos échantillons pour éviter la contamination par des micro-organismes saprophytes. </li><li> Ajouter de l&#39;eau pour humidifier le sol et faciliter la circulation des nématodes. REMARQUE: Utilisez un vaporisateur d&#39;augmenter lentement le niveau du sol de l&#39;humidité. </li><li> Placer environ 200 à 250 ml d&#39;un sol humide dans un récipient en plastique propre avec un couvercle. </li><li> Ajouter appâts insectes. Considérons 5 à 10 insectes à la surface du sol de chaque échantillon (figure 5). </li><li> Couvrir le récipient avec un couvercle et tournez récipients à l&#39;envers. </li><li> Maintenir les récipients dans l&#39;obscurité et à température ambiante (généralement 22-25 ° C). </li><li> Vérifiez tous les récipients 2 - 3 jours et enlever les insectes morts. REMARQUE: ajouter insectes sains supplémentaires pour chaque conteneur pour plus d&#39;appâtage de l&#39;échantillon de sol. </li><li> Retirer les insectes morts des conteneurs. NOTE: Les cadavres avec une brune ou ocre coloration sont généralement parasités par steinernematids, alors que la brique rouge à violet foncé cadavres sont parasités par heterorhabditids. </li><li> Rincer cadavres dans l&#39;eau stérile. </li><li> Placez cadavres dans un piège blanc modifié pour la récupération des nématodes progéniture (voir la procédure ci-dessous). </li></ol> Piège Blanc modification:. 3 nématode récupération de cadavres infectés <ol><li> Placez le haut de 50 (ou 60) mm de diamètre. Boîte de Petri dans un plat plus grand (100 mm). </li><li> Définir un péchépapier filtre circulaire GLE (Whatman n ° 1) à l&#39;intérieur du petit plat. </li><li> La place des cadavres sur le papier filtre du plus petit plat s&#39;assurer que les cadavres ne se touchent pas les uns des autres pour éviter toute contamination. </li><li> Remplissez le extérieure (plus grande) boîte de Pétri avec ca. 20 ml d&#39;eau distillée stérile. Ne pas ajouter de l&#39;eau dans le plat qui contient les cadavres. </li><li> Couvrir la grande boîte de Pétri et son contenu avec le couvercle (Figure 6). </li><li> Étiqueter plats en conséquence. Ajoutez les informations suivantes: nom nématodes (espèces / isolé), la date de l&#39;infection (infection de date a été fixée) et la date de piège (il s&#39;agit de la date à laquelle le piège est mis en place). </li><li> Gardez piège à température ambiante jusqu&#39;à la levée des stades juvéniles infectieux (JI) se produit. Ce processus peut prendre entre 10 - 25 jours selon les espèces et / ou souche considérée nématodes. </li><li> l&#39;eau de récolte avec JI en enlevant le plus grand plat du piège et verser de l&#39;eau par des nématodes dans un bécher. </li><li> Permettre aux nématodes à décanter au fond de la beaker. Ce processus peut prendre quelques minutes. </li><li> Versez de l&#39;eau avec précaution, en s&#39;assurant que les nématodes restent dans le fond du récipient. </li><li> Rincer les nématodes en ajoutant plus d&#39;eau et permettant nématodes à décanter. Cette étape peut être répétée 2 à 3 fois jusqu&#39;à ce que l&#39;eau est propre. </li><li> Placer nématodes en suspension dans un flacon de culture tissulaire (250 ml). Maintenir la concentration de la suspension à 1000 - 3000 nématodes / ml. </li><li> fiole de magasin avec des nématodes en suspension dans une chambre froide ou dans l&#39;incubateur entre: 10 - 20 ° C. REMARQUE: consultez flacons stockés périodiquement la durée de vie de l&#39;EPN est variable. Habituellement steinernematids peuvent être stockés pour les 6 - 12 mois sans la nécessité de repiquage, alors que heterorhabditids peuvent nécessiter plus de contrôles périodiques. </li></ol>

<ol>
	<li>Bedding, R. A., Akhurst, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+the+detection+of+insect+parasitic+rhabditid+nematodes+in+soil.">A simple technique for the detection of insect parasitic rhabditid nematodes in soil.</a> Nematologica. 21, 109-110 (1975).</li><li>Boemare, N. E., Akhurst, R. A., Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -. H., Stackebrandt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. In The Prokaryotes. , 473-488 (2007).</li><li>Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Entomopathogenic Nematology. , (2002).</li><li>Gaugler, R., Kaya, H. 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K., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entomopathogenic+nematodes.">Entomopathogenic nematodes.</a> Annual Review of Entomology. 38, 181-206 (1993).</li><li>Kaya, H. K., Stock, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Techniques in insect nematology. In Manual of techniques in insect pathology. , 281-324 (1997).</li><li>Lacey, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of techniques in invertebrate pathology. , (2012).</li><li>McCoy, C. W., Shapiro-Ilan, D., Duncan, L., Nguyen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entomopathogenic+nematodes+and+other+natural+enemies+as+mortality+factors+for+larvae+of+Diaprepes+abbreviatus+(Coleoptera:+Curculionidae).">Entomopathogenic nematodes and other natural enemies as mortality factors for larvae of Diaprepes abbreviatus (Coleoptera: Curculionidae).</a> Biological Control. 19, 182-190 (2000).</li><li>Meyling, N. V., Eilenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+and+distribution+of+soil+borne+entomopathogenic+fungi+within+a+single+organic+agroecosystem.">Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem.</a> Agriculture, ecosystem., &amp; environment. 113, 336-341 (2006).</li><li>Poinar, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Taxonomy and biology of Steinernematidae and Heterorhabditidae. In: Entomopathogenic Nemtaodes in Biological. , 23-61 (1990).</li><li>Stock, S. P., Gress, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+phylogenetic+relationships+of+entomopathogenic+nematodes+(Steinernematidae+and+Heterorhabditidae)+from+the+Sky+Islands+of+southern+Arizona.">Diversity and phylogenetic relationships of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae) from the Sky Islands of southern Arizona.</a> Journal of invertebrate pathology. 92, 66-72 (2006).</li><li>Stock, S. P., Hunt, D. J., Grewal, P. S., Ehlers, R. U., Shapiro-Ilan, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nematode+morphology+and+systematics.">Nematode morphology and systematics.</a> Nematodes as biological control agents. CAB International Publishing. , 3-43 (2005).</li><li>Stock, S. P., Goodrich&#8211;Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entomopathogenic+nematodes+and+their+bacterial+symbionts:+The+inside+out+of+a+mutualistic+association.">Entomopathogenic nematodes and their bacterial symbionts: The inside out of a mutualistic association.</a> Symbiosis. 46, 65-75 (2008).</li><li>Stuart, R. J., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patchiness+in+populations+of+entomopathogenic+nematodes.">Patchiness in populations of entomopathogenic nematodes.</a> Journal of Invertebrate Pathology. 64, 39-45 (1994).</li><li>White, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+obtaining+infective+nematode+larvae+from+cultures.">A method for obtaining infective nematode larvae from cultures.</a> Science. 66, 302-303 (1927).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Cette démonstration est le premier des deux présentations qui décrivent un certain nombre de techniques qui sont couramment utilisés pour l&#39;étude de l&#39;EPN et de leurs bactéries symbiotiques. Ces techniques constituent des étapes clés de la mise en place réussie des cultures de l&#39;EPN dans le laboratoire et constituent également la base pour d&#39;autres essais biologiques qui emploient EPN comme organismes modèles pour la recherche. Diverses études de sol de l&#39;EPN ...

Beaucoup de nématodes sont associés avec des insectes, et leurs interactions hôte vont de bénéfique à préjudiciable. Ici, nous nous concentrons sur un groupe de nématodes qui sont des agents pathogènes d&#39;insectes, aussi connu comme nématodes entomopathogènes (ou EPN). Deux familles de nématodes appartiennent à ce groupe de nematodes: Steinernematidae et Heterorhabditidae 11,13. Leur effet pathogène est en effet conféré par leur interaction avec les bactéries entériques facultatives anaérobies (bactéries Xenorhabdus associent steinernematids et bactéries Photorhabdus associer à heterorhabditids) 2. Les bactéries sont vectorisés d&#39;un insecte hôte à un autre par la seule étape sans nématodes vivant, le mineur infectieux de la troisième étape (également connu sous le nom dauer juvénile, juvénile infectieux ou IJ), qui vit dans le sol. Une fois à l&#39;intérieur de l&#39;insecte, les nématodes libèrent les bactéries dans l&#39;hémolymphe de l&#39;insecte, qui tuent l&#39;hôte de l&#39;insecte par septicémie massif. Les bactéries aussidégrader les tissus de l&#39;insecte et deviennent la source de nourriture des nématodes, ce qui leur permet de mûrir et de se multiplier. Habituellement, une ou deux générations de nématodes adultes sont produits dans le cadavre d&#39;insecte. La descendance des dernières réassocie génération adulte avec quelques cellules bactériennes dans un plus spécialiser de manière que leur relation nutritionnel précédente, et de nourrir ces cellules dans leurs intestins comme ils se déplacent hors de la carcasse de l&#39;insecte dans le sol où ils attendront un autre insecte à parasiter 6,11,14 (Figure 1). Depuis leur découverte en 1927, l&#39;EPN ont été considérés comme des alternatives valables aux pesticides chimiques, car ils peuvent parasiter un large éventail d&#39;insectes qui sont nuisibles agricoles 3,4,5. Cependant, au cours des deux dernières décennies, ces nématodes et leurs bactéries symbiotiques ont été reconnus comme un système modèle pour l&#39;étude malléable aspects biologiques, écologiques et évolutifs de l&#39;hôte microbe INTERACTIONns 14. Le but de cette présentation est de montrer les méthodes et les techniques les plus couramment utilisées pour l&#39;échantillonnage et l&#39;isolement de l&#39;EPN sol. Une variété d&#39;outils est disponible et peut être utilisé pour prélever des échantillons de sol, y compris: carottiers du sol, truelles, pelles post-trous, tarières, des tubes d&#39;échantillonnage, pelles à la main, entre autres (figure 2). Selon le but de l&#39;étude, deux stratégies d&#39;échantillonnage peuvent être envisagées: a) stratifié, b) un échantillonnage aléatoire (Figure 3). L&#39;échantillonnage stratifié est habituellement utilisé dans le cadre d&#39;une étude intensive dans une zone déterminée ou démarquée sur une période de temps donnée. En général, un transect est démarquée et des échantillons de sol sont prélevés à des intervalles prévus dans le transect sur ​​une période de temps (figure 3A) 15. L&#39;échantillonnage aléatoire est généralement utilisé lorsqu&#39;on se concentre sur une vaste zone. Cette stratégie d&#39;échantillonnage a été utilisée pour étudier la diversité des EPN felon une grande surface ou d&#39;une région géographique (figure 3B) 12. Un certain nombre de facteurs peut être considéré en fonction de l&#39;objet de l&#39;étude, y compris un large éventail de hauteurs, textures de sol et des habitats (p. ex., Les champs cultivés, les forêts, les pâturages, parcs, bords de mer, les zones riveraines, etc.) Nous montrons la technique de l&#39;insecte-appâts, qui a été initialement décrit par Literie et Akhurst 1 et représente une alternative simple et sélective pour la récupération de l&#39;EPN à partir d&#39;échantillons de sol. Il s&#39;agit d&#39;une procédure sélective qui est basée sur la prémisse que les nématodes (stade IJ) seront attirés par un insecte hôte et parasitent il. Cette technique peut également être envisagée pour l&#39;isolement d&#39;autres agents pathogènes tels que les insectes, les champignons et les bactéries 8,10. Nous démontrons également la technique de piège blanc modifié qui est utilisé pour récupérer la descendance des nématodes chez des hôtes d&#39;insecte infectées 7,14. Il s&#39;agit d&#39;un effort rencontréhod qui offre l&#39;avantage de récupérer un «propre» nématode progéniture libre de débris des cadavres d&#39;insectes dégradantes. Enfin, les techniques décrites et présentées dans cet article correspondent à ceux conçus et / ou réalisés dans notre laboratoire ainsi que ceux décrits par divers collègues et collaborateurs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1119">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:309px;">Company</td>
			<td style="width:241px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:299px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:271px;">Galleria mellonella</td>
			<td style="width:309px;">Timberline</td>
			<td style="width:241px;">http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG</td>
			<td>for insect baiting technique</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:271px;">Filter Paper, 55mm Grade 1 Cellulose</td>
			<td style="width:309px;">Whatman/VWR</td>
			<td>28450-048</td>
			<td>infection chamber and White trap assembly</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">60 x 15 mm Petri Dishes</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td>infection chamber and White trap assembly</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">100 x 15 Petri Dishes</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td style="width:241px;">25384-088</td>
			<td>infection chamber and White trap assembly</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">ZIPloc Plastic Bags</td>
			<td style="width:309px;">Ace Hardware or local hardware store</td>
			<td style="width:241px;">N/A</td>
			<td>soil sampling</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:271px;">Mechanical Pipettor P1000, P200 ml</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td>89130-562; 89130-566&#160;</td>
			<td>infection chamber and White trap assembly</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">pippetor tips 1000ml, 200 ml</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td style="width:241px;">16466-004 ; 53510</td>
			<td>infection chamber and White trap assembly</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Bleach</td>
			<td style="width:309px;">Ace Hardware or local hardware store</td>
			<td>N/A</td>
			<td>soil sampling , desisnfecting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Sodium Hypochlorite</td>
			<td style="width:309px;">Ace Hardware or local hardware store</td>
			<td>N/A</td>
			<td>soil sampling , desisnfecting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">70% Ethyl alochol</td>
			<td style="width:309px;">AAPER</td>
			<td>17212945</td>
			<td>soil sampling , desisnfecting</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:271px;">Shovels</td>
			<td style="width:309px;">Ace Hardware or local hardware store</td>
			<td style="width:241px;">N/A</td>
			<td>soil sampling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Tubular soil sampler</td>
			<td>Accuproducts</td>
			<td style="width:241px;">N/A</td>
			<td>soil sampling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Soil Probe, long handle</td>
			<td>Nupla&#160;</td>
			<td style="width:241px;">PRB4T 69401 Classic</td>
			<td>soil sampling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Measuring tape</td>
			<td style="width:309px;">Ace Hardware or local hardware store</td>
			<td style="width:241px;">N/A</td>
			<td>soil sampling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Flagging tape, various colors</td>
			<td style="width:309px;">Ace Hardware or local hardware store</td>
			<td style="width:241px;">N/A</td>
			<td>soil sampling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">tissue culture flasks</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td style="width:241px;">Falcon, 29185-304&#160;</td>
			<td>White trap, collection of EPN</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:271px;">wash bottles, Polyethylene, Wide Mouth</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td>16650-107</td>
			<td>White trap, collection of EPN</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

soil sampling and isolation of entomopathogenic nematodes (steinernematidae, heterorhabditidae)

Les nématodes entomopathogènes (aka EPN) représentent un groupe de nématodes terricoles qui parasitent une grande variété d&#39;insectes. Ces nématodes appartiennent à deux familles: Steinernematidae et Heterorhabditidae. Jusqu&#39;à présent, plus de 70 espèces ont été décrites dans le Steinernematidae et il ya environ 20 espèces dans le Heterorhabditidae. Les nématodes ont un partenariat mutualiste avec des bactéries Enterobacteriaceae et ensemble, ils agissent comme un puissant complexe insecticide qui tue un grand nombre d&#39;espèces d&#39;insectes. Ici, nous nous concentrons sur les techniques les plus courantes en considération pour la collecte de l&#39;EPN du sol. La deuxième partie de cette présentation se concentre sur la technique de l&#39;insecte-appâts, une approche largement utilisée pour l&#39;isolement de l&#39;EPN à partir d&#39;échantillons de sol, et la technique de piège Blanc modifié qui est utilisé pour la récupération de ces nématodes des insectes infectés. Ces méthodes et ces techniques sont les principales étapes pour la mise en place réussie de l&#39;EPN culteres dans le laboratoire et également former la base pour d&#39;autres essais biologiques qui considèrent que ces nématodes comme organismes modèles pour la recherche dans d&#39;autres disciplines biologiques. Les techniques présentées dans cette présentation correspondent à ceux exécutés et / ou conçu par les membres du SP Stock laboratoire ainsi que ceux décrits par différents auteurs.

Sol de prélèvement des échantillons Troisième stade juvéniles infectieux de l&#39;EPN sont les seules étapes de vie libre dans le cycle de vie de ces nématodes qui se trouvent dans le sol (figure 1). Par conséquent, la collecte des échantillons de sol est une méthode très efficace pour récupérer de ces nématodes. Figure 4 montre un profil de sol indiquant la profondeur à laquelle les échantillons doivent être prises. La préservation de l&#3...

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Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae, Heterorhabditidae

Les nématodes entomopathogènes sont des vers ronds terricoles qui parasitent une grande variété d&#39;insectes. Nous démontrons méthodes d&#39;échantillonnage utilisées pour l&#39;isolement de ces nématodes dans le sol au moyen de deux techniques: l&#39;appâtage des insectes et le piège blanc modifié, pour la récupération des nématodes à partir d&#39;échantillons de sol et de cadavres d&#39;insectes infectés, respectivement.

L&#39;échantillonnage du sol et isolement de nématodes entomopathogènes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to ...

soil-sampling-isolation-entomopathogenic-nematodes-steinernematidae

Research

JoVE Journal

Environment

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

24.7K vues.  University of Arizona.  Les nématodes entomopathogènes sont des vers ronds terricoles qui parasitent une grande variété d'insectes. Nous démontrons méthodes d'échantillonnage utilisées pour l'isolement de ces nématodes dans le sol au moyen de deux techniques: l'appâtage des insectes et le piège blanc modifié, pour la récupération des nématodes à partir d'échantillons de sol et de cadavres d'insectes infectés, respectivement. 

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Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes and soil organic matter formation to small-scale stable-isotope biomarker probing. Coupling multiple stable isotopes such as 13C with 15N, 18O or&#160;2H has the potential to reveal even more information about complex stoichiometric relationships during biogeochemical transformations. Isotope labeled plant material has been used in various studies of litter decomposition and soil organic matter formation1-4. From these and other studies, however, it has become apparent that structural components of plant material behave differently than metabolic components (i.e. leachable low molecular weight compounds) in terms of microbial utilization and long-term carbon storage5-7. The ability to study structural and metabolic components separately provides a powerful new tool for advancing the forefront of ecosystem biogeochemical studies. Here we describe a method for producing 13C and 15N labeled plant material that is either uniformly labeled throughout the plant or differentially labeled in structural and metabolic plant components.
Here, we present the construction and operation of a continuous 13C and 15N labeling chamber that can be modified to meet various research needs. Uniformly labeled plant material is produced by continuous labeling from seedling to harvest, while differential labeling is achieved by removing the growing plants from the chamber weeks prior to harvest. Representative results from growing Andropogon gerardii Kaw demonstrate the system&#39;s ability to efficiently label plant material at the targeted levels. Through this method we have produced plant material with a 4.4 atom%13C and 6.7 atom%15N uniform plant label, or material that is differentially labeled by up to 1.29 atom%13C and 0.56 atom%15N in its metabolic and structural components (hot water extractable and hot water residual components, respectively). Challenges lie in maintaining proper temperature, humidity, CO2 concentration,&#160;and light levels in an airtight 13C-CO2 atmosphere for successful plant production. This chamber description represents a useful research tool to effectively produce uniformly or differentially multi-isotope labeled plant material for use in experiments on ecosystem biogeochemical cycling.

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

This method explains how to build and operate a continuous 13C and 15N isotope labeling chamber for uniform or differential plant tissue labeling. Representative results from metabolic and structural labeling of Andropogon gerardii are discussed.

Conception et l&#39;exploitation d&#39;un continu<sup&gt; 13</sup&gt; C et<sup&gt; 15</sup&gt; N Chambre pour uniforme ou différentiel étiquetage, métabolique et structurale, usine de production d&#39;isotopes étiquetage

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes ...

Recherche

Environnement

Integrated Field Lysimetry and Porewater Sampling for Evaluation of Chemical Mobility in Soils and Established Vegetation

Potentially toxic chemicals are routinely applied to land to meet growing demands on waste management and food production, but the fate of these chemicals is often not well understood. Here we demonstrate an integrated field lysimetry and porewater sampling method for evaluating the mobility of chemicals applied to soils and established vegetation. Lysimeters, open columns made of metal or plastic, are driven into bareground or vegetated soils. Porewater samplers, which are commercially available and use vacuum to collect percolating soil water, are installed at predetermined depths within the lysimeters. At prearranged times following chemical application to experimental plots, porewater is collected, and lysimeters, containing soil and vegetation, are exhumed. By analyzing chemical concentrations in the lysimeter soil, vegetation, and porewater, downward leaching rates, soil retention capacities, and plant uptake for the chemical of interest may be quantified. Because field lysimetry and porewater sampling are conducted under natural environmental conditions and with minimal soil disturbance, derived results project real-case scenarios and provide valuable information for chemical management. As chemicals are increasingly applied to land worldwide, the described techniques may be utilized to determine whether applied chemicals pose adverse effects to human health or the environment.

Field lysimetry and porewater sampling allow researchers to evaluate the fate of chemicals applied to soils and established vegetation. The goal of this protocol is to demonstrate how to install required instrumentation and collect samples for chemical analysis during integrated field lysimetry and porewater sampling experiments.

Lysimetry intégré sur le terrain et l&#39;eau interstitielle d&#39;échantillonnage pour l&#39;évaluation de la mobilité chimiques dans les sols et la végétation établie

Potentially toxic chemicals are routinely applied to land to meet growing demands on waste management and food production, but the fate of these chemicals ...

An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of phages infecting Arthrobacter hosts has been limited, perhaps due to the low success rate of many previous isolation techniques, resulting in an underrepresented group of Arthrobacter phages available for study. The enrichment technique described here, unlike many others, uses a filtered extract free of contaminating bacteria as the base for indicator bacteria growth, Arthrobactersp. KY3901, specifically. By first removing soil bacteria the target phages are not hindered by competition with native soil bacteria present in initial soil samples. This enrichment method has resulted in dozens of unique phages from several different soil types and even produced different types of phages from the same enriched soil sample isolate. The use of this procedure can be expanded to most nutrient rich aerobic media for the isolation of phages in a vast diversity of interesting host bacteria.

An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates

We present an enrichment protocol for the isolation of bacteriophages infecting bacteria in the Arthrobacter genus. This enrichment protocol produces fast and reproducible results for the isolation and amplification of Arthrobacter phages from soil isolates.

Une technique d&#39;enrichissement Optimisé pour l&#39;isolement de<em&gt; Arthrobacter</em&gt; Bactériophage Espèces de l&#39;échantillon du sol Isole

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of ...

Assaying Predatory Feeding Behaviors in Pristionchus and Other Nematodes

This protocol provides multiple methods for the analysis and quantification of predatory feeding behaviors in nematodes. Many nematode species including Pristionchus pacificus display complex behaviors, the most striking of which is the predation of other nematode larvae. However, as these behaviors are absent in the model organism Caenorhabditis elegans, they have thus far only recently been described in detail along with the development of reliable behavioral assays 1. These predatory behaviors are dependent upon phenotypically plastic but fixed mouth morphs making the correct identification and categorization of these animals essential. In P. pacificus there are two mouth types, the stenostomatous and eurystomatous morphs 2, with only the wide mouthed eurystomatous containing an extra tooth and being capable of killing other nematode larvae. Through the isolation of an abundance of size matched prey larvae and subsequent exposure to predatory nematodes, assays including both "corpse assays" and "bite assays" on correctly identified mouth morph nematodes are possible. These assays provide a means to rapidly quantify predation success rates and provide a detailed behavioral analysis of individual nematodes engaged in predatory feeding activities. In addition, with the use of a high-speed camera, visualization of changes in pharyngeal activity including tooth and pumping dynamics are also possible.

Assaying Predatory Feeding Behaviors in Pristionchus and Other Nematodes

Behavioral assays provide powerful tools for understanding neuronal function. Here we present several protocols for quantifying predatory feeding behavior found in the model nematode Pristionchus pacificus and its relatives. Additionally, we provide methods for analyzing predatory feeding adaptations including mouth structures and teeth.

Dosage Comportements Alimentation prédatrices dans<em&gt; Pristionchus</em&gt; Et d&#39;autres nematodes

This protocol provides multiple methods for the analysis and quantification of predatory feeding behaviors in nematodes. Many nematode species including ...

A Gusseted Thermogradient Table to Control Soil Temperatures for Evaluating Plant Growth and Monitoring Soil Processes

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a series of incubators. A temperature gradient is passively established across the surface of the table between the heated and cooled ends and is lost quickly at distances above the surface. Since temperature is only controlled on the table surface, experiments are restricted to shallow containers, such as Petri dishes, placed on the table. Welding continuous aluminum vertical strips or gussets perpendicular to the surface of a table enables temperature control in depth via convective heat flow. Soil in the channels between gussets was maintained across a gradient of temperatures allowing a greater diversity of experimentation. The gusseted design was evaluated by germinating oat, lettuce, tomato, and melon seeds. Soil temperatures were monitored using individual, battery-powered dataloggers positioned across the table. LED lights installed in the lids or along the sides of the gradient table create a controlled temperature chamber where seedlings can be grown over a range of temperatures. The gusseted design enabled accurate determination of optimum temperatures for fastest germination rate and the highest percentage germination for each species. Germination information from gradient table experiments can help predict seed germination and seedling growth under the adverse soil conditions often encountered during field crop production. Temperature effects on seed germination, seedling growth, and soil ecology can be tested under controlled conditions in a laboratory using a gusseted thermogradient table.

Traditional thermogradient tables create a range of temperatures across the surface. Welding gussets perpendicular to the surface of a thermogradient table will control temperature in depth increasing possible research applications.

Un tableau Gusseted thermogradient pour contrôler la température du sol pour l&#39;évaluation de la croissance des plantes et de suivi des processus de sol

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes in elevation are related to changes in near-surface soil carbonate (CaCO3) profiles. The objective is to describe a simple conceptual model and detailed protocol for repeatable field and laboratory measurements of these quantities. Here, accurate elevation is measured using a ground-based differential global positioning system (GPS); other data acquisition methods could be applied to the same basic method. Soil samples are collected from prescribed depth intervals and analyzed in the lab using an efficient and precise modified pressure-calcimeter method for quantitative analysis of inorganic carbon concentration. Standard statistical methods are applied to point data, and representative results show significant correlations between changes in soil surface layer CaCO3 and changes in elevation consistent with the conceptual model; CaCO3 generally decreased in depositional areas and increased in erosional areas. Maps are derived from point measurements of elevation and soil CaCO3 to aid analyses. A map of erosional and depositional patterns at the study site, a rain-fed winter wheat field cropped in alternating wheat-fallow strips, shows the interacting effects of water and wind erosion affected by management and topography. Alternative sampling methods and depth intervals are discussed and recommended for future work relating soil erosion and deposition to soil CaCO3.

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes in elevation are related to changes in near-surface soil carbonates. Repeatable methods for field and laboratory measurements of these quantities and data analysis methods are described here.

Mesure et cartographie des schémas d’érosion et de dépôt liées aux Concentrations de Carbonate du sol sous gestion agricole

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Wastewater Irrigation Impacts on Soil Hydraulic Conductivity: Coupled Field Sampling and Laboratory Determination of Saturated Hydraulic Conductivity

Since the early 1960s, an alternative wastewater discharge practice at The Pennsylvania State University has been researched and its impacts monitored. Rather than discharging treated wastewater to a stream, and thereby directly impacting the stream quality, the effluent is applied to forested and cropped land managed by the University. Concerns related to reductions in soil hydraulic conductivity occur when considering wastewater reuse. The methodology described in this manuscript, matching soil sample size with the size of the laboratory-based hydraulic conductivity measurement apparatus, provides the benefits of a relatively rapid collection of samples with the benefits of controlled laboratory boundary conditions. The results suggest that there may have been some impact of wastewater reuse on the soil&#39;s ability to transmit water at deeper depths in the depressional areas of the site. Most of the reductions in the soil hydraulic conductivity in the depressions appear to be related to the depth from which the sample was collected, and by inference, associated with the soil structural and textural differences.

Here we present a methodology which matches a soil sample size and a hydraulic conductivity measurement device to prevent the so-called wall flow along the inside of the soil container from being erroneously included in water flow measurements. Its use is demonstrated with samples collected from a wastewater irrigation site.

Impacts d’Irrigation des eaux usées sur la conductivité hydraulique du sol : échantillonnage sur le terrain et laboratoire de détermination de la conductivité hydraulique saturée couplées

Since the early 1960s, an alternative wastewater discharge practice at The Pennsylvania State University has been researched and its impacts monitored. ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The purpose of this manuscript is to provide detail on how to rapidly sample soil, rhizosphere, and endosphere of replicated field trials and analyze changes that may occur in the microbial communities due to sample type, treatment, and plant genotype. The experiment used to demonstrate these methods consists of replicated field plots containing two, pure, warm-season grasses (Panicum virgatum and Andropogon gerardii) and a low-diversity grass mixture (A. gerardii, Sorghastrum nutans, and Bouteloua curtipendula). Briefly, plants are excavated, a variety of roots are cut and placed in phosphate buffer, and then shaken to collect the rhizosphere. Roots are brought to the laboratory on ice and surface sterilized with bleach and ethanol (EtOH). The rhizosphere is filtered and concentrated by centrifugation. Excavated soil from around the root ball is placed into plastic bags and brought to the lab where a small amount of soil is taken for DNA extractions. DNA is extracted from roots, soil, and rhizosphere and then amplified with primers for the V4 region of the 16S rRNA gene. Amplicons are sequenced, then analyzed with open access bioinformatics tools. These methods allow researchers to test how the microbial community diversity and composition varies due to sample type, treatment, and plant genotype. Using these methods along with statistical models, the representative results demonstrate there are significant differences in microbial communities of roots, rhizosphere, and soil. Methods presented here provide a complete set of steps for how to collect field samples, isolate, extract, quantify, amplify, and sequence DNA, and analyze microbial community diversity and composition in replicated field trials.

Excavation of plant roots from the field as well as processing of samples into endosphere, rhizosphere, and soil are described in detail, including DNA extraction and data analysis methods. This paper is designed to enable other laboratories to use these techniques for the study of soil, endosphere, and rhizosphere microbiomes.

Isolement et analyse des communautés microbiennes dans le sol, rhizosphère et racines dans des expériences de graminée vivace

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Use of Principal Components for Scaling Up Topographic Models to Map Soil Redistribution and Soil Organic Carbon

Landscape topography is a critical factor affecting soil formation and plays an important role in determining soil properties on the earth surface, as it regulates the gravity-driven soil movement induced by runoff and tillage activities. The recent application of Light Detection and Ranging (LiDAR) data holds promise for generating high spatial resolution topographic metrics that can be used to investigate soil property variability. In this study, fifteen topographic metrics derived from LiDAR data were used to investigate topographic impacts on redistribution of soil and spatial distribution of soil organic carbon (SOC). Specifically, we explored the use of topographic principal components (TPCs) for characterizing topography metrics and stepwise principal component regression (SPCR) to develop topography-based soil erosion and SOC models at site and watershed scales. Performance of SPCR models was evaluated against stepwise ordinary least square regression (SOLSR) models. Results showed that SPCR models outperformed SOLSR models in predicting soil redistribution rates and SOC density at different spatial scales. Use of TPCs removes potential collinearity between individual input variables, and dimensionality reduction by principal component analysis (PCA) diminishes the risk of overfitting the prediction models. This study proposes a new approach for modeling soil redistribution across various spatial scales. For one application, access to private lands is often limited, and the need to extrapolate findings from representative study sites to larger settings that include private lands can be important.

Landscape processes are critical components of soil formation and play important roles in determining soil properties and spatial structure in landscapes. We propose a new approach using stepwise principal component regression to predict soil redistribution and soil organic carbon across various spatial scales.

Utilisation des principaux composants pour étendre les modèles topographiques pour mapper la Redistribution du sol et le sol carbone organique

Landscape topography is a critical factor affecting soil formation and plays an important role in determining soil properties on the earth surface, as it ...

Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method

Cellulose is the most abundant polymer on Earth generated by photosynthesis and the main load-bearing component of cell walls. The cell wall plays a significant role in plant growth and development by providing strength, rigidity, rate and direction of cell growth, cell shape maintenance, and protection from biotic and abiotic stressors. The cell wall is primarily composed of cellulose, lignin, hemicellulose and pectin. Recently plant cell walls have been targeted for the second-generation biofuel and bioenergy production. Specifically, the cellulose component of the plant cell wall is used for the production of cellulosic ethanol. Estimation of cellulose content of biomass is critical for fundamental and applied cell wall research. The Updegraff method is simple, robust, and the most widely used method for the estimation of crystalline cellulose content of plant biomass. The alcohol insoluble crude cell wall fraction upon treatment with Updegraff reagent eliminates the hemicellulose and lignin fractions. Later, the Updegraff reagent resistant cellulose fraction is subjected to sulfuric acid treatment to hydrolyze the cellulose homopolymer into monomeric glucose units. A regression line is developed using various concentrations of glucose and used to estimate the amount of the glucose released upon cellulose hydrolysis in the experimental samples. Finally, the cellulose content is estimated based on the amount of glucose monomers by colorimetric anthrone assay.

The Updegraff method is the most widely used method for the cellulose estimation. The main purpose of this demonstration is to provide a detailed Updegraff protocol for estimation of cellulose content in plant biomass samples.

Estimation de la teneur en cellulose cristalline de la biomasse végétale à l’aide de la méthode Updegraff

Cellulose is the most abundant polymer on Earth generated by photosynthesis and the main load-bearing component of cell walls. The cell wall plays a ...