Ce protocole peut être utilisé pour rationaliser l’isolement et l’identification des nématodes de Caenorhabditis de la nature et enregistrer des données écologiques et environnementales importantes associées à l’environnement naturel des nématodes. Les principaux avantages de cette technique sont son évolutivité et sa précision, qui sont rendues possibles en tirant parti des plates-formes de collecte de données mobiles, des bases de données basées sur le cloud et des fonctions de traitement de données standardisées. Pour commencer, identifiez un endroit pour étudier les nématodes de Caenorhabditis.
Pour créer un projet Fulcrum, créez un compte avec Fulcrum en ligne à l’aide d’un accord éducatif gratuit et ajoutez l’application d’échantillonnage sur le terrain des nématodes. Ajoutez ensuite l’application d’isolement des nématodes. Imprimez un ensemble d’étiquettes de code QR en tant que C-Labels pour suivre les collections et S-Labels pour suivre les isolements de nématodes.
Fixez les étiquettes C aux sacs en plastique Ziploc pour l’emballage. Conservez l’ensemble des étiquettes S pour une utilisation en laboratoire. Sélectionnez l’échantillonnage de champ de nématodes dans le menu déroulant de l’application mobile Fulcrum et appuyez sur plus pour démarrer un nouvel enregistrement dans le projet.
Prenez une photo du substrat. Appuyez sur le champ C-Label et choisissez numériser. Scannez le code-barres sur le sac de collecte à l’aide de l’appareil photo de l’appareil mobile, puis appuyez sur Terminé.
Appuyez sur le champ substrat et sélectionnez un type de substrat. Mesurez la température de surface du substrat à l’aide du thermomètre sans contact et enregistrez la valeur dans le champ de température du substrat. Mesurez et enregistrez également la température et l’humidité ambiantes.
Enregistrez et enregistrez dans Fulcrum en appuyant sur Enregistrer en haut à gauche de l’écran. Collectez une cuillère à soupe du substrat sans bâtons ni autres pièces dures en inversant le sac de collecte comme un gant pour ramasser le substrat, puis scellez le sac. Pour chaque sac Ziploc, notez le C-Label sur le sac et attachez un C-Label assorti au couvercle d’une plaque de 10 centimètres repérée avec des bactéries OP50.
Transférez une cuillère à soupe d’échantillon de chaque sac de collecte dans les assiettes en C à l’aide d’une cuillère en plastique propre. Dans l’application Fulcrum, choisissez Isolation des nématodes dans le menu de l’application. Ensuite, créez un nouvel enregistrement d’isolement en appuyant sur l’icône plus en bas à droite.
Appuyez sur le bouton de sélection pour trouver l’étiquette C associée à un échantillon. Appuyez sur l’icône de recherche. Appuyez ensuite sur l’icône de numérisation pour scanner le code QR C-Label.
Recherchez les nématodes sur la plaque C avec un microscope à dissection. Appuyez sur les vers dans le champ de l’échantillon pour enregistrer la présence de nématodes sur l’échantillon. Si aucun nématode n’est présent, parafilmer la plaque C et la jeter dans un bac à risque biologique.
Si des nématodes sont présents, isolez jusqu’à cinq nématodes de la plaque C et transférez chacun sur sa propre plaque S. Ensuite, appuyez sur le champ Plaques marquées S pour entrer la plaque S utilisée pour cette isolation. Appuyez sur le plus en bas à droite.
Appuyez sur S-Label, puis cliquez sur scan pour ouvrir la caméra de l’appareil, puis scannez le code QR S-Label sur la plaque S. Appuyez sur le bouton d’enregistrement en haut à droite une fois que toutes les informations ont été ajoutées correctement dans l’enregistrement d’isolement, puis parfilmez les plaques S avec des nématodes isolés et mettez-les de côté dans une zone désignée pour contenir les plaques S avec des nématodes. Connectez-vous au site Web Fulcrum et sélectionnez l’application d’isolation des nématodes.
Cliquez sur exporter pour télécharger un fichier zip contenant le s_labeled_plates d’isolement des nématodes. fichier csv. Accédez au modèle de génotypage d’isolat sauvage Google Sheet et copiez Google Sheet.
Placez les étiquettes S copiées à partir de l’isolement du nématode s_labeled_plates. colonne csv dans la feuille de génotypage. Vérifiez la prolifération des animaux sur des plaques S 48 heures après l’isolement.
Si une plaque S contient des animaux proliférants, entrez-en une dans la colonne de prolifération 48 de la feuille de génotypage, puis déplacez la plaque S dans une boîte étiquetée 48 heures de prolifération case un. Vérifiez à nouveau les plaques S qui ne proliféraient pas 48 heures après l’isolement à 168 heures après l’isolement. Si une plaque S prolifère maintenant, entrez-en une dans la colonne de prolifération 168 sur la feuille de génotypage, puis déplacez la plaque S dans une boîte étiquetée 168 heures de prolifération case un.
Filtrez le génotype dans Google Sheet pour n’inclure que les S-Labels dans une zone de prolifération à lyser, puis sélectionnez les colonnes S-Label via les nœuds de lyse. Imprimez une feuille de calcul de lyse pour chaque boîte de prolifération à lyser. Préparer 12 tubes à bandes de puits pour les échantillons à lyser.
Décapsulez un tube de bande et ajoutez huit microlitres de tampon de lyse à chaque bouchon avec un pipetter répétitif. Choisissez trois à cinq animaux à partir des plaques sources dans les positions de capuchon indiquées sur la feuille de travail de lyse. Répétez l’opération jusqu’à huit tubes à bande et placez les tubes à bande dans le congélateur à moins 80 degrés Celsius.
Retirez les ensembles de tubes à bande et exécutez le programme de lyse dans le thermocycleur. Ensuite, conservez les lysats à moins 80 degrés Celsius pendant une semaine. Retirez les tubes à bande du congélateur à moins 80 degrés Celsius et décongelez le matériau de lyse sur de la glace.
Pendant que le matériau de lyse est en train de décongeler, préparez les mélanges maîtres ITS2 et SSU dans des tubes séparés sur de la glace. Ajouter deux microlitres de lysat au puits approprié dans la plaque PCR avec une pipette multicanal à faible volume. Exécutez les PCR avec le programme de thermocyclage approprié et notez les étiquettes S qui donnent des produits DE PCR ITS2 ou SSU dans la feuille de génotypage.
Pour chaque échantillon positif ITS2, utilisez le produit ITS2 PCR restant pour le séquençage Sanger et obtenez les fichiers de sortie seq pour chaque S-Label à partir de la plate-forme de séquençage. Accédez au site Web NBCI BLAST dans un navigateur Web pour lancer la recherche BLAST. Pour les séquences de plaque S qui blast à une espèce de Caenorhabditis, entrez le genre complet et le nom d’espèce du blast supérieur dans la colonne ID de l’espèce.
Nommez les souches avec des noms uniques, en suivant les conventions de nomenclature Caenorhabditis et entrez les noms des souches dans la colonne Nom de la souche. Pour traiter les données, accédez au site Web Fulcrum et exportez les données brutes du projet à partir de la base de données Fulcrum. Ouvrez un nouveau script R et suivez les instructions de la vignette easyfulcrum pour traiter les données de collecte.
Dans NBCI BLAST, les résultats pour S-Label S-05554 montrent que le plus grand succès est Caenorhabditis briggsae. De plus, certains nématodes isolés nécessitent un effort supplémentaire pour le génotype. Par exemple, environ 2 % des isolats ne parviennent pas à s’amplifier avec l’ensemble d’amorces pcR SSU après la première tentative de lyse et doivent être utilisés pour s’assurer que le matériau de lyse convient à l’amplification avec l’ensemble d’amorces ITS2.
En suivant cette procédure, les chercheurs peuvent explorer les données écologiques et environnementales associées aux isolats de nématodes sauvages afin d’identifier les emplacements et les caractéristiques du substrat les plus susceptibles d’abriter des espèces de nématodes spécifiques.
