Les auteurs remercient grandement Pierre Bourdoncle, Thomas et Louise Guilbert Rimbault du Fonds Cochin Imaging. Ce travail a été soutenu par l&#39;Inserm, le CNRS et la Ligue Nationale contre le Cancer (Equipe labellisée).

1. Préparation des lymphocytes T <ol><li> Préparer la souris primaire ou cellules T humaines comme décrit 10,11. </li><li> Cultiver les cellules T humaines dans un milieu complet RPMI avec 10% de sérum AB humain à une densité de 2-3 x 10 6 cellules / ml. NOTE: L&#39;utilisation de sérum de veau foetal (FCS) à la place du sérum humain peuvent induire la polarisation spontanée d&#39;une grande fraction de cellules T humaines en culture. Gardez ces cellules en culture pendant 4-5 jours, et autre processus à tout moment pendant cette période. </li><li> Maintenir les cellules T de souris dans du milieu RPMI complet supplémenté avec 10% de FCS à une densité cellulaire similaire. Utilisez immédiatement ou le lendemain, après une culture O / N à 37 ° C en présence de 10 ng / ml IL7. </li><li> Cultiver la lignée cellulaire T humaine CEM dans RPMI complet supplémenté avec 10% de FCS. </li></ol> 2. Chemokine Stimulation <ol><li> Laver 5 x 10 5 cellules par condition expérimentale en milieu HBSS chaud complété avec 10 mM HEPEs. Pour certaines expériences, co-transfection de cellules T humaines primaires la veille avec 2 pg pmaxGFP et 8 pg pcDNA3.1 + (vecteur vide, contrôle), PKCÇ kinase morts, ou des plasmides PAR6 N-terminaux. </li><li> Reprendre le culot cellulaire dans un milieu HBSS chaud-Hepes (utiliser 0,3 ml x nombre de conditions expérimentales). </li><li> Distribuez les cellules dans 1,5 ml microtubes. NOTE: En conséquence, un tube correspondant à une seule condition expérimentale contient 5 x 10 5 cellules dans 0,3 ml de milieu HBSS-HEPES. Pour certaines expériences, ajouter 500 nM Latrunculin A ou de véhicule (DMSO) et on incube les cellules pendant 30 min avant la stimulation de chimiokine. </li><li> Ajouter 10 à 500 ng / ml CCL19 ou chimiokine CXCL12 dans chaque tube. NOTE: Nous utilisons habituellement 10-200 chimiokine ng / ml pour les cellules T humaines. Cellules CEM ne expriment pas le récepteur CCR7 qui se lie CCL19. Par conséquent, les cellules CEM ne seront en mesure de répondre à une stimulation de CXCL12. En outre, utiliser des concentrations plus élevées de chimiokines (300-500 ng / ml) pour polariser les cellules T de souris. </li><li> Retourner les tubes à plusieurs reprises et les incuber dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant 8 à 10 min ou de cellules T primaires ou CEM, respectivement. </li><li> Arrêter le processus de polarisation en ajoutant à chaque tube 0,3 ml d&#39;une solution chaude contenant 2% de paraformaldehyde (PFA) et Hepes 10 mM dans du PBS. Retourner les tubes et les incuber à 37 ° C pendant 5 min. </li></ol> 3. colorations <ol><li> Transférer les cellules des microtubes à la cytométrie en flux tubes. </li><li> Remplir les tubes avec une solution complètement RT contenant 1% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA), 0,5 mM d&#39;EDTA et 10 mM de Hepes dans du PBS. </li><li> Centrifuger les tubes à 460 g pendant 4 min. </li><li> Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 100 ul d&#39;une solution contenant RT 5% de FCS dans du PBS. </li><li> Ajouter 5 ul de FITC-anti-HLA-ABC dans chaque tube, les vortex, et incuber pendant 30 min à température ambiante, à l&#39;abri de la lumière. </li><li> Laver les cellules une fois avec du PBS contenant 5% de FCS, unend fois avec du PBS seulement. </li><li> A RT: ajouter 500 ul de 1% de PFA, incuber pendant 10 min, puis laver les cellules avec une solution contenant 1% de BSA, 0,5 mM d&#39;EDTA et 10 mM de HEPES dans du PBS. </li><li> Jeter le surnageant, complètement remplir les tubes avec une solution de PBS contenant 0,2% de BSA, 0,1% de saponine, 0,5 mM d&#39;EDTA et 10 mM de Hepes (tampon de perméabilisation). </li><li> Laver les cellules deux fois dans ce milieu. </li><li> Retourner les tubes pour éliminer le milieu et Vortex les dissocier le culot cellulaire. </li><li> Ajouter 0,25 ug / ml TRITC-phalloïdine et / ou une dilution 1: 100 d&#39;anticorps anti-P-ERM à chaque tube, les vortex et incuber pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Laver les cellules avec le tampon de perméabilisation. Incuber avec un anticorps secondaire fluorescent si nécessaire. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans 200 ul de PBS et les transférer à des microtubes. REMARQUE: Les cellules sont prêts pour l&#39;acquisition. Sinon, tout en gardant un volume total maximal de 200 pi par tube, ajouter concentré PFA à une finale 1%concentration afin de préserver les colorations si les cellules ne sont pas à utiliser le même jour pour un traitement ultérieur. </li></ol> 4. Images acquisition et d&#39;analyse <ol><li> Allumer l&#39;appareil (voir le tableau des réactifs spécifiques / Équipement) et laissez-le se calibrer selon les instructions du fabricant. REMARQUE: Le logiciel INSPIRE été utilisé avec un objectif 40X (0,75 NA). Le logiciel IDEAS 3.0 a été utilisé pour tous les quantifications signalés. </li><li> Préparer une série de fenêtres d&#39;acquisition qui peuvent être sauvegardés dans un modèle pour de futures expériences. Dessinez histogrammes qui quantifient les valeurs de gradient de RMS. De la population &quot;In Focus&quot;, sélectionnés sur les RMS de l&#39;histogramme gradient, délimiter la population &quot;cellule unique&quot; sur un histogramme de la zone. Une fois que le tube de microcentrifugation a été inséré dans la machine, régler la puissance du laser, porte sur des cellules individuelles et d&#39;acquérir des lymphocytes T 5000. </li><li> Dans les idées molleslogiciel, ouvrez le fichier d&#39;acquisition et de créer un histogramme qui indique la valeur de la valeur RMS de gradient pour les images de champ lumineux (canal 1) obtenu pour chaque cellule individuelle. Dessinez une grille sur le gradient histogramme RMS qui considère cellules présentant RMS valeur gradient ci-dessus 57. NOTE: Le gradient RMS permet de prendre en compte dans l&#39;analyse uniquement les lymphocytes T qui sont dans le plan focal. Nous avons déterminé de manière empirique que les cellules individuelles présentant une valeur de gradient supérieure à RMS 57 sont dans le plan focal, et peuvent être considérés de façon précise. </li><li> Dans le / menu Analyse des Masques, créer un nouveau masque, appelé Erode (M01,2) du masque de la morphologie sur les images en fond clair M01, érodés de 2 pixels. Puis, dans l&#39;Analyse / menu Fonctions, créer une nouvelle fonctionnalité de la zone, calculé sur le masque Erode (M01,2). A partir des cellules sélectionnées dans la grille précédente, ouvrir un histogramme montrant la zone de cellules à l&#39;aide de ce masque nouvellement créé. La morphologie des masques qui sont disponibles par: NOTEdéfaut sont beaucoup plus grande que la taille réelle de la cellule. Ainsi, il est plus précis de l&#39;éroder jusqu&#39;à deux pixels. </li><li> Dessinez une porte sur les cellules T individuelles, à l&#39;exception des billes de calibration et de débris (petite zone) et les doublets (grande surface). Réglez cette porte à chaque acquisition. REMARQUE: Les variations de la taille des cellules auront une incidence sur la position de la porte. Comme les cellules T de souris sont plus petites que les cellules T humaines qui sont eux-mêmes plus petites que les cellules CEM, la surface de chaque type de cellule est proportionnelle à sa taille. </li><li> Considérant les cellules individuelles, de mise au point qui ont été fermée dans les étapes précédentes, ouvrez une parcelle points constituée de la Raw Max Pixel sur la coloration HLA-ABC (canal 2, axe des x) en fonction de la Raw Max Pixel sur la phalloïdine coloration (Channel 4, axe y). Créer un portail d&#39;exclure les événements fluorescentes non colorées ou saturés. Ouvrez deux histogrammes montrant la Raw Max Pixel pour HLA-ABC (canal 2) et phalloïdine (Channel 4) colorations. </li><li> Dans l&#39;analyse / menu Masques, createa nouveau masque, appelé Erode (M02,2) du masque de la morphologie des cellules HLA-ABC colorées (canal 2), érodés de 2 pixels. Puis, dans l&#39;Analyse / menu Fonctions, créer une nouvelle fonction consistant en le paramètre de circularité, calculé sur la Erode (M02,2). NOTE: Ce paramètre mesure la déviation de la forme de la cellule d&#39;un cercle. Par conséquent, une cellule T parfaitement ronde aura une valeur de circularité élevée tandis que les cellules polarisées allongés présentera un indice de circularité bas. </li><li> Par la suite, créer un autre histogramme qui rendra compte les valeurs de la fonction de circularité des cellules précédemment gated. Utilisez cet histogramme pour tracer directement la distribution d&#39;un individu, la population cellulaire de mise au point selon la valeur de la circularité de chaque cellule individuelle. </li><li> Au vu de la forme de l&#39;histogramme pour les cellules non stimulées, tracer une grille de cellules polarisées, à partir de la valeur de circularité la plus basse jusqu&#39;à la valeur limite de circularité où la plupart des cellules non stimuléessont tracées. Regardez l&#39;affichage des statistiques pour le pourcentage de cellules polarisées parmi la population fermée (Gated%). NOTE: Nous avons mis cette porte pour les valeurs de l&#39;indice circularité ci-dessous 13. </li><li> Afin de regarder la polarisation de la coloration de l&#39;actine dans les cellules, tracer un histogramme pour la Détail Lumineux valeur similarité R3, comparant la coloration HLA-ABC (canal 2) et la coloration de la phalloïdine (Channel 4). NOTE: Plus la valeur de cette fonction, plus superpose les deux colorations sont. </li><li> En utilisant la même stratégie de déclenchement comme précédemment, tracer une grille sur des cellules non stimulées pour la coloration distinct qui montre le pourcentage de cellules présentant une coloration de l&#39;actine polarisée. </li><li> Une fois terminé, le pourcentage de cellules présentant une ségrégation dans la distribution du CMH de classe I et de colorations phalloïdine, le pourcentage de cellules polarisées ainsi que les valeurs moyennes des indices circularité et la similitude de toutes les cellules ± SD sont présentés dans l&#39;correspStatistiques onding panneaux. </li></ol>

<ol>
	<li>Rossi, D., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+chemokines+and+their+receptors.">The biology of chemokines and their receptors.</a> Annu Rev Immunol. 18, 217-242 (2000).</li><li>Thelen, M., Stein, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+chemokines+invite+leukocytes+to+dance.">How chemokines invite leukocytes to dance.</a> Nat Immunol. 9 (9), 953-959 (2008).</li><li>Rougerie, P., Rho Delon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPases:+masters+of+T+lymphocyte+migration+and+activation.">GTPases: masters of T lymphocyte migration and activation.</a> Immunol Lett. 142 (1-2), 1-13 (2012).</li><li>Sanchez-Madrid, F., del Pozo, M. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification.">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. (9), 409 (2007).</li><li>James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+antigen+specific+CD4++T+cells+using+MHC+class+II+tetramers.">Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-plastin+phosphorylation:+a+novel+target+for+the+immunosuppressive+drug+dexamethasone+in+primary+human+T+cells.">L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).</li><li>Freeley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-plastin+regulates+polarization+and+migration+in+chemokine-stimulated+human+T+lymphocytes.">L-plastin regulates polarization and migration in chemokine-stimulated human T lymphocytes.</a> J Immunol. 188 (12), 6357-6370 (2012).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ne ont aucun intérêt financier concurrentes.

Grâce à une technologie récente des flux d&#39;imagerie de cytométrie une stratégie rapide et informative déclenchement d&#39;analyser des événements cellulaires et moléculaires induits par la stimulation de la chimiokine est présenté. A partir d&#39;une seule expérience, on peut obtenir deux types d&#39;informations: les changements dans la morphologie cellulaire induites par stimulation de la chimiokine et la distribution subcellulaire de protéines différentes pendant le processus de polarisation. Fait i...

Les chimiokines sont de petites protéines solubles qui attirent les cellules à des endroits spécialisés 1. Par conséquent, ils participent au positionnement correct de cellules dans les tissus, un rôle crucial dans le développement et la physiologie. Le système immunitaire ne fait pas exception à cette règle car il repose sur l&#39;action de nombreux différents types de cellules qui agissent de concert pour monter une réponse immunitaire efficace. En contrôlant la localisation spécifique d&#39;un type de cellule immunitaire dans un état donné, les chimiokines sont des pré-requis avant antigènes étrangers peuvent être détectés et neutralisés. Dans les lymphocytes T en particulier, les chimiokines se lient à des récepteurs spécifiques de surface qui, lors de l&#39;engagement, suscitent de nombreux signaux intracellulaires (élévation du calcium, la phosphorylation de ERK, activation GTPases Rho, augmentation des intégrines affinité et altérations du cytosquelette) qui favorisent motilité des cellules T 2,3. Au niveau cellulaire, on peut observer des altérations morphologiques induites par stimulation de chimiokine.Ces changements dans les formes cellulaires sont particulièrement dramatique dans les cellules T: les cellules T au repos ont une morphologie ronde bourrelet lorsque vous voyagez dans le flux sanguin. Cependant, la détection de la présence de chimiokines dans les sites inflammatoires ou à proximité des organes lymphoïdes va changer la forme des cellules T qui adoptent désormais une «main-miroir» morphologie typique composé d&#39;une forme bipolaire: un bord d&#39;attaque à l&#39;avant et un bord arrière, ou uropode, 4 à l&#39;arrière. En outre, les composants intracellulaires peuvent séparer dans ces deux régions opposées d&#39;une cellule T de polarisation pour maintenir la migration. Par exemple, les filaments d&#39;actine polymérisation augmente lors d&#39;une stimulation de chimiokine 5 actine polymérisée et se accumule à l&#39;avant d&#39;une cellule polarisée T 2. D&#39;autre part, plusieurs protéines telles que les protéines phosphorylées de la famille Ezrin-Radixin-Moesin (ERM) qui relient la membrane plasmique au cytosquelette d&#39;actine corticale, relocaliser au uropode de polarisationLes cellules T 6. Fait intéressant, nous et d&#39;autres avons montré que ce processus de polarisation est nécessaire pour la migration des cellules T. En effet, un traitement qui interfère avec la polarisation va inhiber la motilité cellulaire. Par exemple, l&#39;inhibition de l&#39;activité des membres de la protéine atypique kinases C (PKC) famille, PKCÇ et PKCι blocs T polarisation de la cellule et le processus de balayage de migration des cellules dendritiques 7. T polarisation cellulaire est également réglementée par GTPases Rho. Nous avons montré que la modulation de l&#39;activité de la protéine RhoA par Fam65b récemment décrit interfère avec les changements de cellules T de la morphologie et de leur capacité à migrer dans un dosage 6 Transwell. Comme polarisation est une étape préalable à la motilité cellulaire, il est donc crucial d&#39;être en mesure de quantifier comme un indicateur principal de réponses de chimiokines. modifications de la forme des cellules ont déjà été mesurés manuellement 8. Cependant, ce type de dosage est très chronophage, de sorte que seuls quelques-uns habituellementdizaines de cellules sont prises en compte. Ici, une nouvelle méthode est présentée à quantifier rapidement le degré de modifications de forme de lymphocytes T exposés à la chimiokine stimulation. Un flux d&#39;imagerie de cytométrie la technologie (voir le tableau des réactifs spécifiques / Équipement) est utilisée, qui combine les avantages d&#39;un cytomètre de flux et un microscope neuf pour quantifier efficacement la quantité de cellules polarisées dans différentes conditions de stimulation de chimiokine. En plus de la quantification des altérations morphologiques que l&#39;on peut mesurer robuste avec cette technologie, il est également possible d&#39;évaluer les changements dans la localisation subcellulaire de certaines protéines de chimiokine sur la signalisation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="569">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:140px;">Name of the material/Equipment</td>
			<td style="width:95px;">Company</td>
			<td style="width:80px;">Catalog number</td>
			<td style="width:255px;">Comments/Description (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:140px;">RPMI</td>
			<td style="width:95px;">Gibco</td>
			<td style="width:80px;">61870-010</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:140px;">Human serum AB</td>
			<td style="width:95px;">PAA</td>
			<td style="width:80px;">C11-021</td>
			<td style="width:255px;">Pre-heat to inactivate the complement.</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:140px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:95px;">PAN Biotech</td>
			<td style="width:80px;">P30-3300</td>
			<td style="width:255px;">Pre-heat to inactivate the complement.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:140px;">Human T cell nucleofactor kit</td>
			<td style="width:95px;">Lonza</td>
			<td style="width:80px;">VCA-1002</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:140px;">Murine IL7</td>
			<td style="width:95px;">Peprotech</td>
			<td style="width:80px;">217-17</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:140px;">HBSS</td>
			<td style="width:95px;">Gibco</td>
			<td style="width:80px;">14025-050</td>
			<td style="width:255px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:140px;">Hepes</td>
			<td style="width:95px;">Gibco</td>
			<td style="width:80px;">15630-056</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:140px;">Murine CCL19</td>
			<td style="width:95px;">Peprotech</td>
			<td style="width:80px;">250-27B</td>
			<td style="width:255px;">Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:140px;">Human CCL19</td>
			<td style="width:95px;">Peprotech</td>
			<td style="width:80px;">300-29B</td>
			<td style="width:255px;">Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.</td>
		</tr>
		<tr height="88">
			<td height="88" style="height:88px;width:140px;">Human CXCL12</td>
			<td style="width:95px;">Peprotech</td>
			<td style="width:80px;">300-28A</td>
			<td style="width:255px;">Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells.</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:140px;">PFA</td>
			<td style="width:95px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:80px;">157-8-100</td>
			<td style="width:255px;">This is a 8 % PFA solution in water. Mix volume to volume with 2X PBS to obtain a 4 % PFA solution in PBS.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:140px;">&#160;BSA</td>
			<td style="width:95px;">Sigma</td>
			<td style="width:80px;">A3059</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:140px;">Saponin</td>
			<td style="width:95px;">Fluka</td>
			<td style="width:80px;">84510</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:140px;">Alexa Fluor 594 phalloidin</td>
			<td style="width:95px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">A12381</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:140px;">FITC-anti-HLA-ABC antibody</td>
			<td style="width:95px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:80px;">IM1838</td>
			<td style="width:255px;">clone B9.12.1</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:140px;">Anti-P-ERM antibody</td>
			<td style="width:95px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:80px;">3149P</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:140px;">ImageStreamx Mark II</td>
			<td style="width:95px;">Amnis</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and robust analysis of cellular and molecular polarization induced by chemokine signaling

Les cellules répondent à la stimulation par la chimiokine perdre leur forme ronde dans un processus appelé polarisation, et en modifiant la localisation subcellulaire de nombreuses protéines. Techniques d&#39;imagerie classiques ont été utilisées pour étudier ces phénomènes. Cependant, ils doivent l&#39;acquisition manuelle de nombreuses cellules, suivie par une quantification du temps de la morphologie et de la co-localisation de la coloration de plusieurs dizaines de cellules. Ici, un procédé rapide et puissant est décrit à étudier ces phénomènes sur des échantillons constitués de plusieurs milliers de cellules en utilisant une cytométrie en flux de la technologie de formation d&#39;image qui combine les avantages d&#39;un microscope à celles d&#39;un cytomètre. Utilisation de lymphocytes T stimulés avec CCL19 et coloration pour les molécules MHC de classe I et de l&#39;actine filamenteuse, une stratégie de déclenchement est présenté simultanément à mesurer le degré de modifications de forme et l&#39;étendue de la co-localisation de marqueurs qui sont affectés par la signalisation de CCL19. En outre, cette stratégie de porte nous a permis de OBSERVe la séparation de l&#39;actine filamenteuse (à l&#39;avant) et phosphorylée Ezrin-Radixin-Moesin (phospho-ERM) protéines (à l&#39;arrière) dans les cellules T polarisées après CXCL12 stimulation. Cette technique est également utile pour observer l&#39;effet de blocage sur la polarisation de deux éléments différents: l&#39;inhibition de la polymérisation de l&#39;actine par un inhibiteur pharmacologique et l&#39;expression de mutants de la / voie de signalisation de la PKC atypique PAR6. Ainsi, la preuve montre que cette technique est utile d&#39;analyser les altérations morphologiques et redistributions de protéines.

Le premier exemple choisi ici concerne l&#39;utilisation de lymphocytes T primaires humains stimulés avec CCL19. Cependant, la même stratégie peut être utilisée avec des cellules T de souris primaires, des lignées de cellules T ou tout autre type sensible à la stimulation de chimiokine sur les cellules. La stratégie présentée ici de déclenchement comprend une série de fenêtres qui sélectionnent les événements ciblés, puis les cellules individuelles. Enfin la plage d&#39;intensité de fluorescence est su...

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Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

Analyse rapide et robuste de cellulaire et moléculaire de polarisation induite par des chimiokines de signalisation

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

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Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an effective invasin for human epithelial and endothelial cells. We have identified endothelial surface-located integrins as major receptors for Opc, a process which requires Opc to first bind to integrin ligands such as vitronectin and via these to the cell-expressed receptors1. This process leads to bacterial invasion of endothelial cells2. More recently, we observed an interaction of Opc with a 100kDa protein found in whole cell lysates of human cells3. We initially observed this interaction when host cell proteins separated by electrophoresis and blotted on to nitrocellulose were overlaid with Opc-expressing Nm. The interaction was direct and did not involve intermediate molecules. By mass spectrometry, we established the identity of the protein as &alpha;-actinin. As no surface expressed &alpha;-actinin was found on any of the eight cell lines examined, and as Opc interactions with endothelial cells in the presence of serum lead to bacterial entry into the target cells, we examined the possibility of the two proteins interacting intracellularly. For this, cultured human brain microvascular endothelial cells (HBMECs) were infected with Opc-expressing Nm for extended periods and the locations of internalised bacteria and &alpha;-actinin were examined by confocal microscopy. We observed time-dependent increase in colocalisation of Nm with the cytoskeletal protein, which was considerable after an eight hour period of bacterial internalisation. In addition, the use of quantitative imaging software enabled us to obtain a relative measure of the colocalisation of Nm with &alpha;-actinin and other cytoskeletal proteins. Here we present a protocol for visualisation and quantification of the colocalisation of the bacterium with intracellular proteins after bacterial entry into human endothelial cells, although the procedure is also applicable to human epithelial cells.

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &amp;#945;-actinin by Confocal Imaging

Neisseria meningitidis (Nm), a gram negative human-specific respiratory pathogen, can bind to human &alpha;-actinin. Here we present a protocol for visualisation of colocalisation of the bacterium with intracellular &alpha;-actinin after bacterial entry into human brain microvascular endothelial cells (HBMECs).

Visualisation et quantification des interactions intracellulaires des Neisseria meningitidis Et l&#39;homme α-actinine par imagerie confocale

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an ...

Recherche

Immunologie et infection

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1 Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached to a surface.2 Biofilm formation and development are commonly studied in the laboratory using batch systems such as microtiter plates or flow systems, such as flow-cells. These methodologies are useful for screening mutant and chemical libraries (microtiter plates)3 or growing biofilms for visualization (flow cells)4. Here we present detailed protocols for growing Staphylococcus aureus in two additional types of flow system biofilms: the drip flow biofilm reactor and the rotating disk biofilm reactor.
Drip flow biofilm reactors are designed for the study of biofilms grown under low shear conditions.5 The drip flow reactor consists of four parallel test channels, each capable of holding one standard glass microscope slide sized coupon, or a length of catheter or stint. The drip flow reactor is ideal for microsensor monitoring, general biofilm studies, biofilm cryosectioning samples, high biomass production, medical material evaluations, and indwelling medical device testing.6,7,8,9
The rotating disk reactor consists of a teflon disk containing recesses for removable coupons.10 The removable coupons can by made from any machinable material. The bottom of the rotating disk contains a bar magnet to allow disk rotation to create liquid surface shear across surface-flush coupons. The entire disk containing 18 coupons is placed in a 1000 mL glass side-arm reactor vessel. A liquid growth media is circulated through the vessel while the disk is rotated by a magnetic stirrer. The coupons are removed from the reactor vessel and then scraped to collect the biofilm sample for further study or microscopy imaging. Rotating disc reactors are designed for laboratory evaluations of biocide efficacy, biofilm removal, and performance of anti-fouling materials.9,11,12,13

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Protocols for utilizing open system flow biofilms with drip flow reactors and rotating disk reactors are presented in detail.

L&#39;utilisation des flux de goutte et des réacteurs de disque rotatif pour Staphylococcus aureus Analyse du biofilm

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes. The majority of them belong to the superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs). We have focused on characterizing arthropod kinin receptors from the tick and mosquito. Arthropod kinins are multifunctional neuropeptides with myotropic, diuretic, and neurotransmitter function. Here, a method for systematic analyses of structure-activity relationships of insect kinins on two heterologous kinin receptor-expressing systems is described. We provide important information relevant to the development of biostable kinin analogs with the potential to disrupt the diuretic, myotropic, and/or digestive processes in ticks and mosquitoes.
The kinin receptors from the southern cattle tick, Boophilus microplus (Canestrini), and the mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), were stably expressed in the mammalian cell line CHO-K1. Functional analyses of these receptors were completed using a calcium bioluminescence plate assay that measures intracellular bioluminescence to determine cytoplasmic calcium levels upon peptide application to these recombinant cells. This method takes advantage of the aequorin protein, a photoprotein isolated from luminescent jellyfish. We transiently transfected the aequorin plasmid (mtAEQ/pcDNA1) in cell lines that stably expressed the kinin receptors. These cells were then treated with the cofactor coelenterazine, which complexes with intracellular aequorin. This bond breaks in the presence of calcium, emitting luminescence levels indicative of the calcium concentration. As the kinin receptor signals through the release of intracellular calcium, the intensity of the signal is related to the potency of the peptide.
This protocol is a synthesis of several previously described protocols with modifications; it presents step-by-step instructions for the stable expression of GPCRs in a mammalian cell line through functional plate assays (Staubly et al., 2002 and Stables et al., 1997). Using this methodology, we were able to establish stable cell lines expressing the mosquito and the tick kinin receptors, compare the potency of three mosquito kinins, identify critical amino acid positions for the ligand-receptor interaction, and perform semi-throughput screening of a peptide library. Because insect kinins are susceptible to fast enzymatic degradation by endogenous peptidases, they are severely limited in use as tools for pest control or endocrinological studies. Therefore, we also tested kinin analogs containing amino isobutyric acid (Aib) to enhance their potency and biostability. This peptidase-resistant analog represents an important lead in the development of biostable insect kinin analogs and may aid in the development of neuropeptide-based arthropod control strategies.

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

This protocol provides instructions for clonal-cell line selection and a calcium bioluminescence assay to analyze the structure-activity relationships of synthesized arthropod neuropeptides on their cognate GPCRs. This assay can be used for receptor deorphanization and structure-activity relationship studies for synthetic analog design and peptide/drug-lead discovery.

Un test de bioluminescence calcium pour l&#39;analyse fonctionnelle des moustiques ( Aedes aegypti) Et cochez (<emRhipicephalus> microplus) G récepteurs couplés aux protéines

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

Imagerie de VIH-1 Enveloppe induite Synapse virologique et de signalisation sur bicouches lipidiques synthétiques

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

Une technique de microscopie TIRF en temps réel, imagerie simultanée du TCR et de ses associés protéines de signalisation

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is initiated by interaction of the pathogen with intestinal epithelial cells. This interaction leads to disruption of intercellular structures such as tight junctions (TJ). TJ ensure sealing of the epithelial layer to separate host tissue from gut lumen. Recent studies provide evidence that disruption of TJ by the parasitic protein EhCPADH112 is a prerequisite for E. histolytica invasion that is accompanied by epithelial barrier dysfunction. Thus, the analysis of molecular mechanisms involved in TJ disassembly during E. histolytica invasion is of paramount importance to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis. This article presents an easy model that allows the assessment of initial host-pathogen interactions and the parasite invasion potential. Parameters to be analyzed include transepithelial electrical resistance, interaction of EhCPADH112 with epithelial surface receptors, changes in expression and localization of epithelial junctional markers and localization of parasite molecules within epithelial cells.

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Human infection by Entamoeba histolytica leads to amoebiasis, a major cause of diarrhea in tropical countries. Infection is initiated by pathogen interactions with intestinal epithelial cells, provoking the opening of cell-cell contacts and consequently diarrhea, sometimes followed by liver infection. This article provides a model to assess the early host-pathogen interactions to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis.

Analyse de l&#39;altération de l&#39;épithélium Produit par<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Maladies infectieuses

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

Analyse rapide des aberrations chromosomiques dans les lymphocytes B de souris par PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality every year. The Influenza A and B assay was the first CLIA-waived molecular rapid flu test available. The Influenza A and B test works by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. Here, the performance of the Influenza A and B assay on frozen, archived nasopharyngeal swab (NPS) specimens stored in viral transport medium (VTM) were compared to a respiratory panel assay.
The performance of the Influenza A and B assay was evaluated by comparing the results to the respiratory panel reference method. The sensitivity for total influenza virus A was 67.5% (95% CI (CI), 56.6-78.5) and the specificity was 86.9% (CI, 71.0-100). For influenza virus B testing, the sensitivity and specificity were 90.2% (CI, 68.5-100) and 98.8% (CI, 68.5-100), respectively.
This system has the advantage of a significantly shorter test time than any other currently available molecular assay and the simple, pipette-free procedure runs on a fully integrated, closed, small-footprint system. Overall, the Influenza A and B assay evaluated in this study has the potential to serve as a point-of-care rapid influenza diagnostic test.

We describe a rapid, molecular-based Influenza A and B assay. The Influenza assay detects each target within 15 min by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. The Influenza A and B assay is user-friendly and required minimal hands-on time to perform.

Rapid Détection moléculaire et différenciation des virus grippaux A et B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research is deciphering how these dynamic protein complexes act to integrate signals from multiple sources in order to direct a specific biological response, and how this becomes deregulated in many disease settings. Despite the importance of this key biochemical mechanism, there is a lack of experimental techniques that can facilitate the specific and sensitive deconvolution of these multi-molecular signaling complexes.
Here this shortcoming is addressed through the combination of a protein complementation assay with a conformation-specific nanobody, which we have termed Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel technique facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any pair of interacting proteins, to the exclusion of un-complexed individual proteins and complexes formed with competing binding partners. 
The BiCAP technique is adaptable to a wide array of downstream experimental assays, and the high degree of specificity afforded by this technique allows more nuanced investigations into the mechanics of protein complex assembly than is currently possible using standard affinity purification techniques.

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

This manuscript describes the protocol for Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel method facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any two interacting proteins, while excluding un-complexed individual proteins as well as complexes formed with competing binding partners.

Dissection multi-signalisation Complexes protéiques par Purification d’affinité de complémentation bimoléculaire (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

A Murine Model of Dengue Virus-induced Acute Viral Encephalitis-like Disease

Dengue virus (DENV), an arthropod-borne virus transmitted by mosquitoes, may cause the severe disease known as dengue hemorrhagic fever, which is characterized by lethal complications due to plasma leakage, ascites, pleural effusion, respiratory distress, severe bleeding, and organ impairment. A few cases of DENV infection present neurological manifestations; however, studies have not explored DENV-induced neuropathogenesis further. In this study, we present a protocol to use an immunocompetent outbred ICR (Institute of Cancer Research) mouse for investigating the induction of central nervous system (CNS) infection with DENV, followed by the progression of acute viral encephalitis-like disease.

Here, we present a protocol for creating an immunocompetent ICR (Institute of Cancer Research) murine model of central nervous system infection to display the development of neuropathy. Monitoring acute viral encephalitic disorders by identical disease scores could be performed for showing dengue virus-induced neuropathy in vivo.