We thank Yumeng (Helen) Xia (Rutgers University) for manuscript editing. The work on BASL polarity formation is supported by grants from the U.S. National Institute of General Medical Sciences to J.D. (R01GM109080) and Rutgers University.

1. Construction du plasmide <ol><li> Générer les constructions par la technologie du clonage comme décrit précédemment 1,6. <ol><li> Tout d&#39;abord utiliser un ADN polymérase haute fidélité avec des amorces appropriées pour amplifier les séquences codantes de BASL, YDA et MPK6 et sous-clone dans les vecteurs d&#39;entrée. Trouver le protocole détaillé dans 7. </li><li> Pour générer les versions négatives dominantes de MPK6 et YDA (DNmpk6 8 et DNyda 4, respectivement), utiliser les plasmides de MPK6 et YDA entrée en tant que modèle et introduire les mutations ponctuelles par une méthode 9 mutagenèse dirigée. </li></ol></li><li> Pour construire les constructions pour les essais de tabac transitoires, effectuer LR standard (attL x attR de recombinaison) Réactions (procédure détaillée dans 7) pour intégrer BASL dans pH35CG 10, DNyda et DNmpk6 en pXNGW et pXCGW vecteurs 11, respectivement. <ol><li> Confirmez les plasmides résultants par la digestion enzymatique et séquençage. Une fois successful, transformer les constructions binaires dans la souche d&#39; Agrobacterium tumefaciens GV3101 12 et les cultiver sur des plaques de sélection à 28 ° C pendant 2 - 3 jours. </li></ol></li></ol> 2. Préparation de la solution d&#39; Agrobacterium Infiltration <ol><li> Inoculer quelques colonies d&#39;Agrobacterium fraîchement transformées dans 10 ml de milieu Luria-Bertani (LB) avec des antibiotiques appropriés (gentamicine 25 ug / ml, rifamycine 25 ug / ml de spectinomycine à 100 pg / ml pour pH35CG, pXNGW et pXCGW construit, les mêmes concentrations de la gentamycine et de la kanamycine rifamycine avec 50 pg / ml pour la p19 (exprimant des protéines contre silençage transgénique) 13. </li><li> Cultivez cultures d&#39;Agrobacterium dans un shaker C 28 ° à la vitesse de 200 tours par minute pendant environ 16 heures, puis de mesurer la DO 600 (estimé pour atteindre 1,5 à 1,8) (Figure 2A-B). Isoler les cultures à 2500 xg pendant 10 min. Re-suspendre et wash les culots cellulaires avec 10 mM de MgCl 2 (la solution d&#39;infiltration). </li><li> Isoler les cultures à nouveau et remettre en suspension les pastilles avec quantité appropriée de la solution d&#39;infiltration pour atteindre la DO finale 600 = 0,5 (figure 2C-D). Avant l&#39;infiltration de plantes, de laisser les mélanges de cellules à la température ambiante pendant 1-3 heures. Cette étape permet de maintenir l&#39;homéostasie cellulaire. </li></ol> 3. Plante du tabac et des feuilles Injection <ol><li> Utiliser des plants de tabac (Nicotiana benthamiana), cultivés 4-5 semaines d&#39;âge dans une chambre de croissance des plantes standard (23 ° C avec des cycles de / 8 h-16 h dark-light) 14 pour l&#39; injection de la feuille. Remarque: A ce stade, les plants de tabac ont généralement 6 feuilles (2 grandes, 2 moyennes et 2 petites). Les deux feuilles moyennes sont les plus optimales pour l&#39;injection de feuilles (les deux grands sont trop vieux, alors que les deux petits sont souvent trop jeunes). </li><li> Avant le jour de l&#39;infiltration, l&#39;eau de la Tobacplantes co pour saturer le sol. </li><li> Le jour d&#39;infiltration, pré-incuber les plantes dans l&#39;obscurité pendant 1-3 heures. Cette étape permet stomates dans l&#39;épiderme pour ouvrir largement, ce qui facilite grandement l&#39;Agrobacterium en pénétrant dans les cellules des feuilles épidermiques. </li><li> Utilisation de bandes de couleurs marquées avec des dates, drapeau des feuilles à infiltrer. Marquer les zones à infiltrées avec un sharpie noir épais (en option, les zones infiltrées sont visibles après avoir été infecté.). </li><li> Prenez des volumes égaux de l&#39;Agrobacterium remise en suspension et les mélanger dans une boîte de Pétri de 100 x 15 mm par douce tourbillonnant (Figure 2F). Note: Dans notre cas, nous avons mélangé 1 ml de p19 avec 1 ml de CFP-BASL, 1 ml de DNyda-NYFP et 1 ml de DNmpk-cYFP. </li><li> Dans le processus d&#39;infiltration, remplir un 3 ml seringue sans aiguille avec le mélange d&#39;infiltration (1 - 2 ml) et pousser sur le côté inférieur (abaxiale) de la feuille de tabac (figure 2F). Alors que l&#39;infiltration, il est utileà utiliser une main pour pousser et d&#39;autre part pour appuyer doucement sur le côté supérieur (adaxial, contre la force de poussée). Note: Une fois que le mélange d&#39;infiltration est injecté avec succès, les zones infectées seront facilement reconnaissables dans l&#39;épiderme. Cependant, l&#39;infiltration peut échouer en raison de l&#39;injection dure (de dommages aux tissus) ou insuffisante push (pas de pénétration de liquide). Pour chaque test, nous suggérons au moins deux injections dans deux feuilles indépendantes (à partir de différentes plantes). </li><li> Placer les plantes infectées de nouveau dans la chambre de croissance. En règle générale, les expressions de protéines sont détectables après 48 h infiltration suivante. </li></ol> 4. imagerie confocale <ol><li> A 48 heures après l&#39; infiltration, utiliser une perforatrice pour exciser un disque de feuille de la zone injectée (normalement 3 - 4 disques / zone peuvent être produites) (figure 2G). Utilisez des pinces pour transférer doucement les disques de feuilles à une diapositive (le côté abaxiale vers le haut) et les monter avec des gouttes d&#39;eau. Évitez d&#39;appuyer trop hard sur le feuillet de couverture , car les cellules comprimées / endommagées ne montrera pas bien sous le microscope confocal (Figure 2H). </li><li> Avant l&#39;imagerie confocale, analyser les échantillons montés sur un composé microscope epi-fluorescence pour vérifier les niveaux d&#39;expression. Remarque: D&#39;après notre expérience, les cellules qui présentent un niveau d&#39;expression intermédiaires sont mieux représentés sous le microscope confocal. </li><li> Commencez avec le 40X (NA 1.3) lentille sur un microscope confocal. Ajuster le coulisseau à la position désirée de sorte que les cellules exprimant des niveaux moyens de protéines fluorescentes restent au centre. Les spectres d&#39;excitation / émission de CFP et YFP sont 458 nm / 480-500 nm et 514 nm / 520-540 nm, respectivement. </li><li> Activez le bouton &quot;Live&quot; pour prévisualiser les images puis réglez l&#39;intensité du laser et le gain à puce pour le rapport intensité de fluorescence / bruit le plus équilibré. Pour améliorer la qualité d&#39;image, augmenter les pixels de balayage et / ou moyenne trame / ligne. Enfin, réglez le bouton de mise au point reach le plan focal médian et cliquez sur &quot;Capture&quot; pour prendre l&#39;image. Note: La PCP et les images YFP peuvent être capturées successivement ou simultanément en cochant ou désactiver l&#39;option de mode de balayage &quot;séquentiel&quot;, respectivement. </li><li> Lorsque Z projection est souhaitée pour la vue en profondeur des cellules, sélectionner le mode d&#39;imagerie &quot;xyz&quot;, définir la profondeur de la plage de balayage (10 - 15 um) et récupérer les images à partir du haut vers le bas de la cellule cible . Compiler les images obtenues avec le logiciel Leica en cliquant droit sur le fichier d&#39;image pour sélectionner &quot;renommer&quot; et d&#39;exporter des images sous forme de fichiers .tiff. </li><li> Photo 30 - 40 cellules pour l&#39;analyse de quantification. </li></ol> Traitement 5. Image et analyse de Quantification <ol><li> Utilisez le logiciel Fidji (http://fiji.sc/Fiji) pour traiter des images et effectuer la quantification. <ol><li> Tracer les graphes d&#39;intensité de fluorescence. <ol><li> Pour mieux visualiser si l&#39;expression CFP / YFP estuniformément répartie, utiliser Fidji pour démontrer la puissance du signal du CFP et YFP le long de la périphérie de la cellule. Pour ce faire, lancer la première Fidji puis sélectionnez &quot;Fichier&quot; et &quot;Ouvrir&quot; pour démarrer l&#39;image. Cliquez sur &quot;ligne&quot; dans le menu d&#39;outils et sélectionnez &quot;ligne segmentée&quot; par un clic droit. Décidez de la région d&#39;intérêt et tracer une ligne le long de la périphérie de la cellule pour tracer la PCP ou le signal YFP (figure 3A-C). Note: Fidji mesure la valeur d&#39;intensité de fluorescence absolue le long des lignes segmentées. </li><li> Sélectionnez le menu déroulant &quot;Analyser&quot; et &quot;Profil de la parcelle&quot; pour générer un graphique avec la position et l&#39;intensité des valeurs qui représentent les niveaux de CFP / YFP le long de la ligne segmentée. Si vous le souhaitez, dupliquer les valeurs d&#39;intensité (en sélectionnant le menu &quot;Copier&quot;) dans EXCEL ou un autre logiciel graphique pour générer des graphiques d&#39;intensité comparables. </li></ol></li><li> Quantifier degré de polarité. <ol><li> Prélever environ 20 représencellules tatives de 3 expériences répétées pour évaluer le degré de polarité du CFP et YFP dans les cellules de tabac. Calculer le degré de polarité sur la base du rapport de l&#39;intensité de fluorescence élevée (définie comme H) par rapport à la faible intensité de fluorescence (définie comme L). Remarque: La méthode de quantification est expliqué dans la Figure 3. <ol><li> Pour mesurer les valeurs de H et L, tracer une ligne segmenté le long de la région intéressée à la périphérie de la cellule (décrite ci-dessus), cliquez sur &quot;Analyser&quot; dans le menu déroulant, puis sélectionnez &quot;Mesure&quot;. Lorsqu&#39;une fenêtre &quot;Résultats&quot; apparaît, utiliser &quot;moyenne&quot; des valeurs pour effectuer la quantification. </li><li> A partir des cellules présentant une expression relativement uniforme de CFP et YFP, par exemple, CFP-BASL (figure 3A) ou YFP complétées de la co-expression de DNyda-NYFP et DNmpk6-cYFP (figure 3B), obtenir les valeurs H et L en mesurant deux choisis au hasard segments périphériques de longueur égale. </li> &lt;li&gt; A partir des cellules présentant l&#39; accumulation polaire évidente de protéines fluorescentes, dans ce cas, la co-expression de la PCP-BASL, DNyda-NYFP et DNmpk6-cYFP (figure 3C), collecter les valeurs H des régions périphériques avec des signaux de fluorescence enrichis et les Ls des régions à faible / pas d&#39;accumulation de fluorescence. </li><li> Réunir les rapports résultants de H / L de 20 cellules ensemble et essai pour la distribution normale. Calculer les valeurs de p par le test t de Student (pour la distribution normale) ou le test de Kolmogorov-Smirnov (KS) (pour la distribution non-normale). </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OCTOPUS,+a+polarly+localised+membrane-associated+protein,+regulates+phloem+differentiation+entry+in+Arabidopsis+thaliana.">OCTOPUS, a polarly localised membrane-associated protein, regulates phloem differentiation entry in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 139, 1306-1315 (2012).</li><li>Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+stomatal+meristemoids+reveals+new+component+of+asymmetric+cell+division+and+commonalities+among+stem+cell+populations+in+Arabidopsis.">Molecular profiling of stomatal meristemoids reveals new component of asymmetric cell division and commonalities among stem cell populations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23, 3260-3275 (2011).</li><li>Mouchel, C. F., Osmont, K. S., Hardtke, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRX+mediates+feedback+between+brassinosteroid+levels+and+auxin+signalling+in+root+growth.">BRX mediates feedback between brassinosteroid levels and auxin signalling in root growth.</a> Nature. 443, 458-461 (2006).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Utilisation générale et modifications possibles du système d&#39;expression transitoire pour le tabac transduction de signal: surexpression de la protéine fluorescente (FP) -tagged protéines dans l&#39;épiderme du tabac a été utilisé avec succès pour un examen rapide de la protéine localisation subcellulaire dans les cellules végétales. Cependant, l&#39; étude de la distribution de signalisation dynamique du complexe protéique in planta est un su...

Les protéines interagissent dans un des complexes de réseau et forment hiérarchiques complexes qui jouent un rôle central dans presque tous les processus biologiques qui se produisent dans un environnement cellulaire imprévisible. Cependant, du développement des plantes à des réponses de croissance, il y a eu un manque d&#39;outils pratiques qui peuvent non seulement rapidement, mais aussi efficacement identifier et surveiller ces événements de signalisation dynamiques au niveau subcellulaire. Le système d&#39;expression de protéine transitoire tabac épiderme des feuilles a appel des avantages pour la visualisation des protéines fluorescentes dans les cellules vivantes. Ce système fournit des semi - conditions in vivo qui permettent la modification des protéines post-traductionnelle et un examen rapide de la localisation des protéines. En examinant le signal complémenté YFP, le dosage de complémentation bimoléculaire fluorescente (BiFC) indique la possibilité d&#39;une interaction protéine-protéine dans les cellules végétales. Par rapport à d&#39; autres méthodes, par exemple, la levure deux hybrides (Y2H) et co-immunoprecipitation (Co-IP), BiFC fournit également un puissant moyen de visualiser les compartiments où les interactions protéine-protéine peuvent se produire au niveau subcellulaire. Parce que la division cellulaire asymétrique (ACD) maintient la tige population de cellules tout en générant de nouveaux types de cellules pour la formation de tissu / organe, il est un mécanisme indispensable pour la promotion de la multicellularité eucaryote. Le développement d&#39; Arabidopsis stomatique a été utilisé comme un système modèle pour l&#39; étude ACD dans les plantes. La cellule précurseur, cellule mère meristemoid, divise asymétriquement pour produire deux cellules filles différentes, un meristemoid (subit souches divisions cellulaires comme avant de se terminer dans une paire de cellules de garde) et une cellule de terre de la lignée stomatique (SLGC) (peut se diviser et se différencier en une cellule de revêtement), respectivement (figure 1). En stomatique ACD, le roman rupture des protéines de Asymétrie dans le Lineage stomatique (de BASL) est polarisé premitotically pour conduire asymétries de la division, qui incasymétrie physique lude et le destin des cellules d&#39;asymétrie 1. Une cascade MAPK composé du MAPKKK YODA et les MAPK, MPK3 et 6 est central pour la division des stomates motifs et sort adoption 2,3, 4,5. Récemment, Zhang et al. lié à la protéine de polarité BASL à la voie de signalisation MAPK YDA-Arabidopsis stomatique ACD 6. La voie YODA-MAPK canonique, par MPK3 / 6, phosphoryle BASL et active sa polarisation. Fonctions BASL phosphorylés comme un échafaudage et recrute YODA (YDA) et MPK3 / 6 pour former un complexe de protéines et de concentrer la signalisation au niveau du cortex cellulaire 6. Polarisation des composantes de MAPK et de la boucle de rétroaction positive entre BASL et la voie MAPK-YDA représente un nouveau mécanisme pour la protéine de polarisation dans les cellules végétales. Signalisation MAPK localement enrichi est supposé être étroitement liée à la différenciation du destin cellulaire dans stomatique ACD 6 (Figure 1). Un des key données expérimentales qui ont soutenu ce modèle provenaient des essais de tabac qui ont démontré la redistribution spatiale des MAPK induite par l&#39;expression de BASL 6. D&#39;une manière générale, il est facile de surveiller la signalisation MAPK où se produit parce que les molécules de MAPK ont souvent été trouvés partout à l&#39;intérieur d&#39;une cellule. Dans cette étude, nous avons utilisé le système split-YFP pour visualiser l&#39;interaction entre la kinase en amont et en aval les suggérer où le relais de signalisation se produit. Nous avons également étendu l&#39;utilisation du système BiFC par co-exprimant une troisième protéine (CFP-tagged) avec la paire YFP fendue (suggestive d&#39;interaction protéine-protéine) pour visualiser si et comment le YFP complété pourrait être modulée spatialement par la coopération protéine exprimée PCP. Ce faisant, nous avons démontré que la co-expression de la PCP-BASL induite réorganisation spatiale des interactions entre YDA et MPK6, de même la distribution à la structuration polarisée au niveau du cortex cellulaire de l&#39;épiderme du tabaccellules al. Ce système a donc le potentiel d&#39;être développé pour la surveillance des événements de signalisation dynamiques dans les cellules végétales dans des conditions où les cellules sont contestées par les stimuli internes ou externes (par exemple, co-expression d&#39;autres protéines, l&#39; application chimique, pathogène attaque ou changements environnementaux, etc. ).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phusion DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D/TOPO</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K2400-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit</td>
			<td>Agilent Technology</td>
			<td>200521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J106-2KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J673-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3632-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K4000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4014-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25x75mm Slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24x50 mm Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td>&#160;LAS AF Lite software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 x objective lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HCX&#160;Plan APO&#160;</td>
			<td>HCX&#160;Plan APO&#160;, NA 1.30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SORVALL 6+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole puncher</td>
			<td>Staples</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml falcon tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>21-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 5 Forceps</td>
			<td>Canemco &#38; Marivac</td>
			<td>205EQA-Spec</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging spatial reorganization of a mapk signaling pathway using the tobacco transient expression system

Visualisation des événements de signalisation dynamiques dans des cellules vivantes a été un défi. Nous avons élargi un système d&#39;expression transitoire établie, la complémentation fluorescente (BiFC) Essai biomolécules dans les cellules épidermiques du tabac, de l&#39;interaction protéine-protéine d&#39;essai pour surveiller la distribution spatiale de la transduction du signal dans des cellules végétales. Dans ce protocole, nous avons utilisé le test BiFC pour montrer que l&#39;interaction et la signalisation entre l&#39;Arabidopsis MAPKKK YODA et MAPK6 se produisent à la membrane plasmique. Lorsque le BASL de protéine d&#39;échafaudage a été co-exprimé, l&#39;interaction YODA-MAPK redistribué et spatialement co-polarisé avec CFP-BASL. Ce système d&#39;expression de tabac modifiée permet un examen rapide de signalisation localisation et dynamiques des changements (moins de 4 jours) et peut accueillir plusieurs de couleurs de protéines fluorescentes (au moins trois). Nous avons également présenté des méthodes détaillées pour quantifier la distribution des protéines (localisation spatiale asymétrique, ou «polarisation»;) Dans des cellules de tabac. Ce système d&#39;expression de tabac de pointe a un potentiel à être largement utilisé pour le test rapide des événements de signalisation dynamiques dans les cellules végétales vivantes.

Pour empêcher la mort cellulaire induite par la signalisation MAPK hyperactif, la kinase de versions inactives YDA (DNyda) et MPK6 (DNmpk6) ont été utilisés dans le test de co-expression dans des cellules de tabac. Ni l&#39;interaction entre DNyda et DNmpk6 révélé par BiFC ni CFP-BASL se modèle de distribution inégale générée (figure 3A-B). Toutefois, lorsque CFP-BASL a été introduit dans la paire d&#39;interaction DNyda-DNmpk6, à la fois des signaux YFP P...

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Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

Imagerie réorganisation spatiale d&#39;une voie de signalisation MAPK Utilisation du système d&#39;expression transitoire du tabac

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

The overall goal of this procedure is to visualize dynamic spatial distribution of protein

imaging-spatial-reorganization-mapk-signaling-pathway-using-tobacco

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K vues.  Rutgers, The State University of New Jersey. The overall goal of this procedure is to visualize dynamic spatial distribution of protein

Vidéo: Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilisation du système d&#39;électroporation Gene Pulser MXcell à transfecter des cellules primaires à haut rendement

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Recherche

Biologie

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Aide d&#39;un compteur de cellules automatisé pour simplifier les études d&#39;expression génique: Knockdown siRNA de l&#39;IL-4 dans l&#39;expression des gènes dépendant cellules Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Les articles inclus en paraffine et congelés de Drosophile</emMuscles adultes>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

Visualisation des Caenorhabditis elegans</emOuvrages cuticules> Utilisation du colorant lipophile Vital, Dii

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

Un workflow d&#39;imagerie à haute teneur pour étudier Grb2 complexes de signalisation par clonage d&#39;expression

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration efficace des plantes pour l&#39;expression transitoire de haut niveau de protéines recombinantes

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

Quantification temporelle d&#39;expression MAPK induite en simples cellules de levure

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past years, hydrodynamic gene delivery (HGD) has emerged as a simple, fast, safe and effective method for delivering transgenes into rodents. This technique relies on the force generated by the rapid injection of a large volume of physiological solution to increase the permeability of cell membranes of perfused organs and thus deliver DNA into cells. One of the main advantages of HGD is the ability to introduce transgenes into mammalian cells using naked plasmid DNA (pDNA). Introducing an exogenous gene using a plasmid is minimally laborious, highly efficient and, contrary to viral carriers, remarkably safe. HGD was initially used to deliver genes into mice, it is now used to deliver a wide range of substances, including oligonucleotides, artificial chromosomes, RNA, proteins and small molecules into mice, rats and, to a limited degree, other animals. This protocol describes HGD in mice and focuses on three key aspects of the method that are critical to performing the procedure successfully: correct insertion of the needle into the vein, the volume of injection and the speed of delivery. Examples are given to show the application of this method to the transient expression of two genes that encode secreted, primate-specific proteins, apolipoprotein L-I (APOL-I) and haptoglobin-related protein (HPR).

In vivo transfection of naked DNA by hydrodynamic gene delivery introduces genes into the tissue of an animal with minimal inflammatory response. Sufficient amounts of gene product are generated such that gene function and regulation as well as protein structure and function can be analyzed.

Expression transitoire de protéines par hydrodynamique Gene livraison chez la souris

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Mesure des taux métabolique dans<em&gt; Drosophila</em&gt; En utilisant Respirométrie

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.