This work is supported by an R21 grant from the National Institutes of Health and by a grant from Hearing Research, Incorporated.

NOTE: Toutes les procédures et la manipulation des animaux respecté les lignes directrices en matière d&#39;éthique du NIH et exigences du protocole approuvées du soin et l&#39;utilisation des animaux Commission institutionnelle de l&#39;Université de Californie, San Francisco. 1. Préparation de l&#39;animal pour la chirurgie <ol><li> Effectuer des procédures chirurgicales dans un espace propre dédié. Autoclave tous les instruments de chirurgie, stériliser avec un stérilisateur de billes de verre avant la chirurgie. NOTE: Dans ce protocole, utilisez jour postnatal (10-12) P10-12 souris FVB. Différents âges et souches de souris peuvent être utilisés pour répondre aux besoins d&#39;un projet spécifique. Souris âgés de plus de P40 peut être difficile parce que l&#39;os de bulle devient plus difficile. </li><li> Anesthésier les souris avec une injection intraperitoneale d&#39;un mélange de chlorhydrate de kétamine (100 mg / kg), le chlorhydrate de xylazine (10 mg / kg) et d&#39;acépromazine (2 mg / kg). Commencer la préparation chirurgicale seulement après que l&#39;animal ne répond plus aux stimuli douloureux, tels que pincement de l&#39;orteil. Si nécessay, administrer une dose de rappel (un cinquième de la dose initiale) du cocktail anesthésiant pour restaurer le plan anesthésique d&#39;origine. REMARQUE: Prenez soin à cette étape parce que la plupart de la mortalité observée à cet âge est causée par surdose d&#39;anesthésique. </li><li> Couvrir les yeux de l&#39;animal avec une pommade ophtalmique de protection pour garder les yeux humides pendant l&#39;anesthésie, la suppression clin réflexe de l&#39;animal. </li><li> Placez la souris avec le cou étendu sur un coussin chauffant toute la procédure jusqu&#39;à ce que la souris est totalement éveillé, pour éviter post-anesthésie hypothermie. </li><li> Rasez la région post-auriculaire gauche avec un clipper et désinfecter avec 70% d&#39;éthanol et povidone-iode avant manipulation chirurgicale. </li></ol> 2. La procédure chirurgicale et Vector Injection <ol><li> Utiliser une approche post-auriculaire pour exposer la bulle tympanique. Incisez le tissu sous-cutané avec de petits ciseaux pour exposer le muscle post-auriculaire. Après la rétraction du tissu adipeux de the côté postérieur de l&#39;incision, séparer les muscles à droite et gauche perpendiculaire à l&#39;incision pour exposer l&#39;os temporal. Assurez-vous que cette incision est assez long pour travailler confortablement avec visualisation adéquate. </li><li> Perforer la bulle tympanique avec une aiguille G 25 et d&#39;élargir le trou si nécessaire avec une pince en pelant l&#39;épine dorsale pour permettre l&#39;accès à la tour basal de la cochlée, puis creuser suffisamment pour visualiser l&#39;artère stapédienne et la membrane de la fenêtre ronde (MLE) . </li><li> Piquer la gestion des déchets radioactifs doucement dans le centre avec une pipette borosilicate capillaire. Observez efflux fluide à travers la gestion des déchets radioactifs à ce point; ce est normal. Attendre jusqu&#39;à ce que l&#39;écoulement se est stabilisée (le fluide effluxed de la cochlée est séchée avec un papier filtre stérile). REMARQUE: Prenez soin lors de la tenue et de faire progresser l&#39;aiguille de verre afin que la perforation RWM est aussi faible que possible. Selon le microscope utilisé, détiennent les pipettes en utilisant un micromanipulateur ou à la main en utilisant une pipettetitulaire. </li><li> Préparer les pipettes d&#39;injection à l&#39;aide d&#39;une pipette extracteur de la même façon pipettes de patch-clamp sont préparés. Assurez-vous que le diamètre de la pointe est grande (environ 15 pm de diamètre) de sorte que le pipetage de virus et arrière se fait aisément. </li><li> Dresser 1-2 pi de AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP ou AAV2-GFP dans une pipette d&#39;injection. Après l&#39;efflux est stabilisé (5-10 min), micro-injection de ce volume fixe dans la rampe tympanique par le même trou préalablement faite dans RWM. </li><li> Sceller la niche RW rapidement après avoir retiré la pipette avec un petit bouchon de muscle et le fixer avec une petite goutte de colle de tissu placé sur le muscle pour éviter les fuites de la fenêtre ronde. REMARQUE: Sceller ce trou très bien après que l&#39;aiguille est enlevée avec un petit bouchon de muscle pour empêcher toute fuite de périlymphe de la cochlée-cette étape est essentielle pour préserver l&#39;audition. Le défaut de sceller complètement le MLE se traduira par la perte d&#39;audition au fil du temps. </li><li> Après l&#39;injection, couvrir letrou dans la bulle auditive avec le tissu adipeux, les muscles revenir post-auriculaires et les tissus adipeux à leur position normale et suturer la plaie en couches avec une suture absorbable chromique 6-0 ou plus petit. </li><li> Désinfectez la plaie avec de la povidone-iode. </li></ol> 3. Soins postopératoires <ol><li> Placez la souris dans une cage chaud et ne les laissez pas sans surveillance jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient complètement rétablis, puis replacez-les avec la mère. Il est recommandé de retirer le mâle de la cage avant de mettre les chiots de retour avec la mère. </li><li> Administrer sous-cutanée Carprofène (2 mg / kg) pour l&#39;analgésie postopératoire et toutes les 24 heures par la suite pour trois jours, pour gérer l&#39;inflammation et la douleur. Surveiller les animaux quotidiennement les signes de détresse, la perte de poids anormale, la douleur, ou une infection. Généralement par le 3 e jour après la chirurgie toutes les souris doivent agir normalement. Si des signes de détresse ou de maladie apparaissent dans une souris après la 3 e jour, envisager l&#39;euthanasie til la souris selon les directives institutionnelles. </li></ol> 4. L&#39;évaluation de la fonction cochléaire Après livraison viral en utilisant auditif du tronc cérébral (ABR) Recordings NOTE: La réponse du tronc cérébral (ABR) est un auditoire potentiel extrait de l&#39;activité électrique dans le cerveau continue et enregistré par l&#39;intermédiaire d&#39;électrodes placées sous le cuir chevelu évoquée. L&#39;animal est stimulé avec du son. L&#39;enregistrement résultant est constitué de cinq vagues qui reflètent l&#39;activité électrique des points successifs dans la voie auditive dans les 10 premières millisecondes après l&#39;apparition d&#39;un stimulus auditif. <ol><li> Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale d&#39;un mélange de chlorhydrate de kétamine et de chlorhydrate de xylazine comme décrit à la section 1.2 de ce protocole, à l&#39;exception sans acépromazine. </li><li> Placez la souris sur un coussin chauffant à travers le test d&#39;audition jusqu&#39;à ce que la souris est totalement éveillé, pour éviter post-anesthésie hypothermie. REMARQUE: Utilisezles stimuli sonores suivants dans cette expérience: cliquez (5 ms durée; 31 Hz taux de présentation). </li><li> Placez électrodes aiguilles sous-cutanés au sommet, au-dessous du pavillon de l&#39;oreille gauche (de référence), et en dessous de l&#39;oreille controlatérale (sol) et commencer ABRs enregistrement comme décrit précédemment dans une chambre insonorisée 27,28. Enregistrez formes d&#39;onde ABR dans cinq intervalles dB de niveau de pression sonore en baisse par rapport amplitude maximale. </li><li> Déterminer les seuils ABR postopératoire dès que quatre jours après l&#39;accouchement virale REMARQUE: Le seuil est définie comme le niveau de stimulation le plus bas auquel Réponse de pics pour les ondes I-V ont été clairement et de façon répétée présente sur une inspection visuelle. </li><li> Mesurer la vague I pour analyser l&#39;activité du nerf cochléaire. Le niveau de stimulation le plus bas qui produit un signal détectable ABR est défini comme le seuil. </li></ol> 5. Cochlear Transgene expression des protéines par immunofluorescence <ol><li> Anesthésier la souris par une surdose de intraperitoneal injection d&#39;un mélange de chlorhydrate de kétamine et de chlorhydrate de xylazine tel que décrit à la section 1.2 de ce protocole, à l&#39;exception sans acépromazine. </li><li> Décapiter la tête seulement après que l&#39;animal ne répond plus aux stimuli douloureux, tels que pincement de l&#39;orteil. </li><li> Disséquer la cochlée et le processus sur l&#39;ensemble de montage immunofluorescence comme décrit 26. Un protocole détaillé de l&#39;ensemble du montage cochléaire immunofluorescence en utilisant des anticorps anti-myosine 7a anti-VGLUT3 et est décrite dans Akil et al., 2013 29. </li><li> Pour l&#39;étiquetage des GFP, incuber les entiers montures cochléaires nuit à 4 ° C avec un anticorps de lapin anti-GFP au 1: 250 dilution. </li><li> Rincer la cochlée deux fois pendant 10 min avec du PBS et ensuite incuber pendant 2 heures à l&#39;anticorps de chèvre anti-IgG de lapin conjugué à Cy2 dilué à 1: 4000 dans du PBS. </li><li> Rincer la cochlée deux fois avec du PBS pendant 10 minutes et les incuber avec du DAPI pendant 15 min. </li><li> Monter la cochlée sur des lames de verre et observer under un microscope avec immunofluorescence confocale. </li></ol>

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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+cochlear+transgene+expression+mediated+by+recombinant+adeno-associated+virus.">Long-term in vivo cochlear transgene expression mediated by recombinant adeno-associated virus.</a> Gene Ther. 5 (2), 277-281 (1998).</li><li>Raphael, Y., Frisancho, J. C., Roessler, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral-mediated+gene+transfer+into+guinea+pig+cochlear+cells+in+vivo.">Adenoviral-mediated gene transfer into guinea pig cochlear cells in vivo.</a> Neurosci. Lett. 207 (2), 137-141 (1996).</li><li>Weiss, M. A., Frisancho, J. C., Roessler, B. J., Raphael, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+mediated+gene+transfer+in+the+cochlea.">Viral mediated gene transfer in the cochlea.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 15 (4=5), 577-583 (1997).</li><li>Pettis, R. M., Han, J. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracochlear+infusion+of+recombinant+adeno+associated+virus:+Analysis+of+its+dissemination+to+near+and+distant+tissues.">Intracochlear infusion of recombinant adeno associated virus: Analysis of its dissemination to near and distant tissues.</a> Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. 21, 673 (1998).</li><li>Konish, i. M., Kawamoto, K., Izumikawa, M., Kuriyama, H., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+guinea+pig+cochlea+using+adeno-associated+virus+vectors.">Gene transfer into guinea pig cochlea using adeno-associated virus vectors.</a> J. Gene Med. 10 (6), 610-618 (2008).</li><li>Kaplitt, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+gene+expression+and+phenotypic+correction+using+adeno-associated+virus+vectors+in+the+mammalian+brain.">Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain.</a> Nature Genetics. 8 (2), 148-154 (1994).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

Dans ce travail, nous décrivons en détail une technique qui peut être utilisé pour la thérapie génique cochléaire, dans le but de rétablir ou sauvetage fonction auditive normale qui est compromise par un défaut génétique. Comme il est généralement atraumatique, cette approche est sans danger pour le transfert de gènes cochléaire ou d&#39;autres thérapies moléculaires potentielles 30. D&#39;autres approches pour la thérapie cochléaire ont été décrits, y compris une approche ventrale ...

La thérapie génique a longtemps été suggérée comme un traitement potentiel pour la perte auditive génétique, mais le succès dans ce domaine est resté inaccessible 1. À ce jour, les méthodologies viralement médiation ont prédominé en raison de la capacité théorique de cibler des types cellulaires spécifiques dans la cochlée relativement inaccessible. Les deux adénovirus (AV) et le virus adéno-associé (AAV) ont été utilisés pour la livraison de gènes cochléaire. AAV sont avantageux dans la cochlée d&#39;un certain nombre de raisons. Ils sont des virus à réplication déficiente et peuvent transférer efficacement molécules transgéniques pour différents types de cellules, y compris les neurones, une cible importante pour un certain nombre de causes de la perte auditive. AAV entrée dans la cellule est médiée par des récepteurs spécifiques 2; Ainsi, le choix d&#39;un serotype particulier doit être compatible avec les types de cellules à une transduction. AAV peut effectivement transfection de cellules de cheveux 3 et intégrer dans le génome de l&#39;hôte, entraînant stable, expression à long terme de la transgenic protéines et le changement phénotypique dans la cellule 4. Bien que pas nécessairement avantageux pour des applications à court terme tels que la régénération des cheveux-cellulaire, l&#39;expression à long terme est très important pour le sauvetage stable de défauts génétiques. Parce que les AAV ne sont pas associés à une maladie humaine ou l&#39;infection et ne démontrent aucune ototoxicité 5,6,7, ils sont un candidat idéal pour une utilisation en thérapie génique pour les formes héréditaires de perte de 8 entendre. Transfert de matériel génétique exogène dans l&#39;oreille interne des mammifères en utilisant des vecteurs viraux a été étudié au cours de la dernière décennie et est en train de devenir une technique prometteuse pour le traitement des formes à la fois génétiques et acquis de la perte auditive neuf. La cochlée est potentiellement une cible idéale pour la thérapie génique pour plusieurs raisons: 1) son petit volume nécessite un nombre limité de virus nécessaire; 2) son isolement relatif des autres effets des limites des systèmes d&#39;organes secondaires; et 3) les chambres remplies de liquide faciliter viraleenvoi dans toute le labyrinthe 10, 11,12,13,14, 15. Des modèles murins de la surdité congénitale permettent une utilisation de plusieurs méthodes d&#39;étude pour suivre le développement de l&#39;oreille interne d&#39;une manière reproductible systématique. Alors que la petite taille de cochlée de souris ne présente une certaine difficulté chirurgicale, la souris sert un modèle extrêmement important dans l&#39;étude de la perte auditive génétique, avec plusieurs avantages expérimentaux sur les autres espèces 16. Des modèles de souris permettent d&#39;évaluer un éventail de caractéristiques à travers l&#39;analyse de liaison génétique, la collecte d&#39;observations morphologiques détaillées, et la simulation de scénarios pathogènes; en tant que tels, ils sont de bons candidats pour la thérapie génique à médiation virale. De vastes études génétiques chez les souris combinées avec les avancées technologiques ont permis de générer des souris génétiquement modifiées de façon reproductible dans les laboratoires 17,18, 19, 20,21. AILLEURSe, il existe de nombreux modèles à la fois pour acquises et héréditaires auditives phénotypes de perte chez la souris, ce qui permet des tests rigoureux dans ce modèle animal 22, 23,24. Ainsi, la correction auditive en utilisant la thérapie génique virale médiation dans un modèle de souris est une première étape appropriée dans la recherche d&#39;un remède pour la maladie humaine. Nous avons précédemment montré que les souris transgéniques dépourvues de glutamate transporteur vésiculaire 3 (VGLUT3) naissent sourds en raison du manque de la libération de glutamate à l&#39;IHC ruban synapse 25. Étant donné que cette mutation ne conduit pas à une dégénérescence primaire des cellules ciliées sensorielles, ces souris mutantes sont potentiellement un excellent modèle pour tester dans laquelle la thérapie génique pour cochléaire surdité congénitale. A ce jour, un certain nombre de techniques de délivrance viraux pour la thérapie génique cochléaire ont été décrites, y compris autour de diffusion de la membrane de fenêtre, l&#39;injection de la membrane de fenêtre ronde et la livraison via une cochléostomie. Il ya puissanteial avantages et les inconvénients de chacune de ces approches neuf. Nous rapportons ici une méthode chirurgicale pour la livraison de gènes à médiation virale de l&#39;oreille interne VGLUT3 KO souris à travers la membrane de la fenêtre ronde (MLE). La méthode d&#39;injection RWM post-auriculaire est peu invasive avec une excellente conservation de l&#39;audience, et est relativement rapide. Comme nous l&#39;avons déjà publié, dans un effort pour restaurer l&#39;audition dans ce modèle de souris, un vecteur AAV1 portant le gène de VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) a été introduit dans la cochlée de ces souris sourds au jour postnatal 12 (P! @), Résultant en la restauration de l&#39;audition 26. Audience chez les souris KO VGLUT3 a été vérifiée par la réponse du tronc cérébral (ABR), tandis que l&#39;expression de la protéine transgénique a été vérifiée par immunofluorescence (IF). Cette méthodologie démontre ainsi que la thérapie génique à médiation virale peut corriger un défaut génétique qui serait sinon résultats de la surdité.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="803">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">Name</td>
			<td style="width:177px;">Company</td>
			<td style="width:161px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:111px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">Ketamine</td>
			<td style="width:177px;">Butler Schein</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">Xylazine</td>
			<td style="width:177px;">AnaSed</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:355px;">Acepromazine</td>
			<td style="width:177px;">Provided by UCSF LARC</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:355px;">Carprofen analgesia</td>
			<td style="width:177px;">Provided by UCSF LARC</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:355px;">Betadine</td>
			<td style="width:177px;">Betadine Puredue Pharma</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex)</td>
			<td style="width:177px;">Alcon</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">Heating pad</td>
			<td style="width:177px;">Braintree scientific, inc.</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">25G needle</td>
			<td style="width:177px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:161px;">305127</td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:355px;">Borosilicate capillary pipette</td>
			<td style="width:177px;">World precision instruments, inc.</td>
			<td style="width:161px;">1B100F-4</td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">Suture PDS*plus Antibacterial</td>
			<td style="width:177px;">Ethicon</td>
			<td style="width:161px;">PDP149</td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">Tissue glue (Vetcode)</td>
			<td style="width:177px;">Butler Schein</td>
			<td align="right" style="width:161px;">31477</td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">Rabbit Anti-GFP antibody</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">A11122</td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissecting microscope&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>MZ95</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flaming/ Brown Micropipette&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Puller Model P-97&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TDT BioSig III System&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;Tucker-Davis Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surgical method for virally mediated gene delivery to the mouse inner ear through the round window membrane

La thérapie génique, utilisé pour réaliser la récupération fonctionnelle de surdité neurosensorielle, promet d&#39;accorder une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et génétiques sous-jacents qui contribuent à la perte d&#39;audition. Introduction de vecteurs dans l&#39;oreille interne doit être fait d&#39;une manière qui distribue largement l&#39;agent tout au long de la cochlée, tout en minimisant les blessures aux structures existantes. Ce manuscrit décrit une approche chirurgicale post-auriculaire qui peut être utilisé pour la thérapie cochléaire de la souris en utilisant moléculaire, pharmacologique, et la livraison virale à des souris de jour postnatal 10 ans et plus par l&#39;intermédiaire de la membrane de la fenêtre ronde (MLE). Cette approche chirurgicale permet la livraison rapide et directe dans la rampe tympanique tout en minimisant la perte de sang et d&#39;éviter la mortalité animale. Cette technique consiste négligeable ou pas de dommages aux structures essentielles de l&#39;oreille interne et moyenne ainsi que les muscles du cou tout en préservant totalement audience. Pour démontrer l&#39;efficacité de cette technique chirurgicale, la glutam vésiculairetransporteur mangé trois KO (VGLUT3 KO) chez la souris sera utilisé comme un exemple d&#39;un modèle de souris de la surdité congénitale qui récupère entendu après la livraison de VGLUT3 à l&#39;oreille interne en utilisant un virus adéno-associé (AAV-1).

Pour vérifier les caractéristiques techniques et l&#39;utilité de l&#39;approche post-auriculaire pour la thérapie moléculaire cochléaire, AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP et AAV2-GFP ont été livrés à des souris P10-12 oreille interne via le MLE. Cette approche démontre l&#39;expression du transgène avec succès dans les cellules ciliées internes (IHC) (VGLUT3 Figure 1 et la GFP Figure 2 et la GFP figure 3A), les cellules ciliées externes (CCE) (GFP Figure 2)...

Watch this Scientific Journal Video about Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane at JoVE.com

Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane

The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane.

Méthode chirurgicale pour Virally Mediated Gene livraison à l&#39;oreille de la souris intérieure à travers la membrane de fenêtre ronde

Gene therapy, used to achieve functional recovery from sensorineural deafness, promises to grant better understanding of the underlying molecular and ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.1K vues.  University of California, San Francisco. The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane. 

Vidéo: Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, inflammatory and metabolic conditions, using in vivo fluorescence microscopy. A closed cranial window is placed over the left parieto-occipital cortex of the mice. Local microcirculation is recorded in real time through the window using epi and fluorescence illumination, and measurements of vessels diameters and red blood cell (RBC) velocities are performed. RBC velocity is measured using real-time cross-correlation and/or fluorescent-labeled erythrocytes. Leukocyte and platelet adherence to pial vessels and assessment of perfusion and vascular leakage are made with the help of fluorescence-labeled markers such as Albumin-FITC and anti-CD45-TxR antibodies. Microcirculation can be repeatedly video-recorded over several days. We used for the first time the close window brain intravital microscopy to study the pial microcirculation to follow dynamic changes during the course of Plasmodium berghei ANKA infection in mice and show that expression of CM is associated with microcirculatory dysfunctions characterized by vasoconstriction, profound decrease in blood flow and eventually vascular collapse.

Intravital microscopy to follow temporal and spatial hemodynamic and inflammatory events in the pial microcirculation.

Microscopie intravitale de la microcirculation cérébrale souris en utilisant une fenêtre fermée crânienne

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Recherche

Neurosciences

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

La moelle épinière électrophysiologie II: fabrication des électrodes extracellulaires d&#39;aspiration

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

Isoler LacZ cellules exprimant des tissus de la souris oreille interne par cytométrie en flux

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

Transfert de gènes à l&#39;oreille de souris en développement intérieur par<em&gt; In Vivo</em&gt; Électroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Une poli et renforcé Diluée-crâne fenêtre for Long-term imagerie du cerveau de souris

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

Les enregistrements de patch-clamp en cellules ciliées de l&#39;oreille Isolé du poisson zèbre

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

Imagerie pHluorin-étiqueté insertion du récepteur de la membrane plasmique dans les neurones primaires de souris en culture

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Utilisant Méthodologies combinés pour définir le rôle du Plasma Membrane Livraison Pendant Axon Branching et Neuronal morphogénèse

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous substances into the brain. These exogenous substances may induce injurious impact or constitute therapeutic strategy. The most common delivery methods of exogenous substances into the brain are based on systemic deliveries, such as subcutaneous or intravenous routes. Although commonly used, these approaches have several limitations, including low delivery efficacy into the brain. In contrast, surgical methods that locally deliver substances into the CNS are more specific and prevent the uptake of the exogenous substances by other organs. Several surgical methods for CNS delivery are available; however, they tend to be very traumatic. Here, we describe a mouse infusion microsurgery technique, which effectively delivers substances into the brain via the internal carotid artery, with minimal trauma and no interference with normal CNS functionality.

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

The present protocol describes a mouse microsurgery infusion technique, which effectively delivers substances directly into the brain via the internal carotid artery.

Souris microchirurgie Infusion Technique pour ciblée Substance Livraison dans le SNC<i&gt; via</i&gt; L&#39;artère carotide interne

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

Laminectomy et implantation de fenêtre de moelle épinière dans la souris

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...