This work is supported by an R21 grant from the National Institutes of Health and by a grant from Hearing Research, Incorporated.

ملاحظة: جميع الإجراءات والحيوان معالجة ينسجم مع المبادئ التوجيهية الأخلاق NIH ومتطلبات البروتوكول وافقت لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو. 1. إعداد الحيوان للجراحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ العمليات الجراحية في نظيفة، ومساحة مخصصة. الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية، وتعقيم للتعقيم الزجاج حبة قبل الجراحة. ملاحظة: في هذا البروتوكول، استخدم يوم بعد الولادة 10-12 (P10-12) الفئران FVB. مختلف الأعمار وسلالات من الفئران يمكن استخدامها لتلبية احتياجات مشروع معين. الفئران الأكبر سنا من P40 يمكن أن يكون تحديا لأن العظام الفقاعة أكثر صعوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفئران مع حقن داخل الصفاق من خليط من هيدروكلوريد الكيتامين (100 ملغ / كلغ)، هيدروكلوريد زيلازين (10 ملغ / كلغ)، وآسيبرومازين (2 ملغ / كلغ). تبدأ التحضير الجراحي إلا بعد الحيوان لم يعد يستجيب للمؤثرات المؤلمة، مثل قرصة أخمص قدميه. اذا لزم الامرذ، إدارة جرعة معززة (خمس الجرعة الأصلية) من كوكتيل مخدر لاستعادة الطائرة مخدر الأصلية. ملاحظة: احرص على هذه الخطوة لأن معظم وفيات لوحظ في هذا العصر تسببها جرعة زائدة من مخدر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية أعين الحيوان مع مرهم للعين وقائي للحفاظ على العينين رطبة أثناء التخدير، وقمع طرفة المنعكس الحيوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس مع الرقبة امتدت على وسادة التدفئة في جميع أنحاء الإجراء حتى الفأر هو مستيقظا تماما، لمنع ما بعد التخدير، انخفاض حرارة الجسم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلق منطقة ما بعد أذني اليسرى مع المقص وتعقيم مع الايثانول 70٪ وبوفيدون اليود قبل التلاعب الجراحي. </li></ol> 2. إجراء العمليات الجراحية والمتجهات حقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام نهج ما بعد أذني لفضح الفقاعة الطبلية. شق النسيج تحت الجلد مع مقص صغير لفضح العضلات بعد أذني. بعد التراجع في الأنسجة الدهنية إلى thالبريد الجانب الخلفي من شق، فصل العضلات على الجانب الأيمن والأيسر عمودي على شق لفضح العظم الصدغي. تأكد من أن هذا الشق طويلة بما فيه الكفاية للعمل بشكل مريح مع التصور الملائم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خرم الفقاعة الطبلية مع 25 G إبرة وتوسيع ثقب عند الضرورة مع ملقط عن طريق تقشير العظم الخلفي للسماح بالوصول إلى بدوره القاعدية من القوقعة، ومن ثم توسيع بما فيه الكفاية لتصور الشريان الركابي والغشاء النافذة المستديرة (RWM) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقب RWM بلطف في وسط مع ماصة البورسليكات الشعرية. نلاحظ هروب رأس المال السائل من خلال RWM في هذه المرحلة. وهذا أمر طبيعي. انتظر حتى استقر هروب رأس المال (تجفف السائل effluxed من القوقعة مع ورق الترشيح العقيمة). ملاحظة: خذ الحيطة والحذر عند عقد ودفع الإبرة الزجاج بحيث ثقب RWM صغير بقدر الإمكان. اعتمادا على المجهر المستخدمة، عقد ماصات باستخدام لمياداة مجهرية أو باليد باستخدام ماصةحامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ماصات للحقن باستخدام ماصة مجتذب يتم إعدادها بنفس الطريقة الماصات المشبك التصحيح. تأكد من أن قطر الحافة هو كبير (حوالي 15 ميكرون في القطر) بحيث pipetting لفيروس الدخول والخروج من السهل القيام به. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 1 إلى 2 ميكرولتر من AAV1-VGLUT3، AAV1-GFP أو AAV2-GFP إلى ماصة الحقن. بعد استقرار هروب رأس المال (من 5 إلى 10 دقيقة)، microinject هذا الحجم ثابت في طبلة الأذن سكالا خلال نفس الحفرة جعلت سابقا في RWM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم المتخصصة RW بسرعة بعد سحب ماصة مع المكونات صغيرة من العضلات وضمان الحصول عليها مع قطرة صغيرة من مادة لاصقة وضعت على الأنسجة العضلية لتجنب تسرب من النافذة المستديرة. ملاحظة: ختم هذا الثقب بشكل جيد للغاية بعد إزالة الإبرة مع المكونات صغيرة من العضلات لمنع أي تسرب اللمف المحيطي من القوقعة-هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية للحفاظ على السمع. والفشل في التوصل تماما فإن RWM يؤدي إلى فقدان السمع مع مرور الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحقن، تغطيةثقب في الفقاعة السمعية مع الأنسجة الدهنية، والعودة العضلات بعد أذني والأنسجة الدهنية إلى وضعها الطبيعي وخياطة الجرح في طبقات مع 6-0 أو أصغر خياطة الكروم للامتصاص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطهير الجرح مع بوفيدون اليود. </li></ol> 3. بعد العملية الجراحية العناية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الفئران في قفص دافئ وليس تركهم دون مراقبة حتى تعافى تماما أنهم ثم نقلها مرة أخرى مع الأم. فمن المستحسن لإزالة الذكور من القفص قبل وضع الجراء مرة أخرى مع الأم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدارة تحت الجلد كاربروفين (2 ملغ / كلغ) لتسكين الألم بعد العمل الجراحي وكل 24 ساعة بعد ذلك لمدة 3 أيام، لإدارة الالتهاب والألم. مراقبة الحيوانات يوميا بحثا عن علامات الضيق، وفقدان الوزن غير طبيعية، والألم، أو العدوى. عموما اليوم 3 الثالثة بعد الجراحة جميع الفئران يجب أن يتصرف بشكل طبيعي. في حالة ظهور أي علامات على الضيق أو المرض في الماوس بعد اليوم 3 الثالثة، والنظر في القتل الرحيم رانه الماوس وفقا لتوجيهات المؤسسية. </li></ol> 4. تقييم من وظيفة القوقعة بعد التسليم الفيروسي عن طريق الدماغ السمعية الاستجابة (ABR) تسجيلات ملاحظة: استجابة الدماغ السمعية (ABR) هي أثار والسمعية إمكانات المستخرجة من النشاط الكهربائي المستمر في الدماغ وسجلت عن طريق أقطاب كهربية وضعت تحت فروة الرأس. يتم تحفيز الحيوان مع الصوت. ويتكون تسجيل الناتجة من خمس موجات التي تعكس النشاط الكهربائي من النقاط المتتالية في مسار السمعي في ميللي ثانية 10 الأولى بعد ظهور حافز السمعي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من خليط من هيدروكلوريد الكيتامين وزيلازين هيدروكلوريد كما هو موضح في القسم 1.2 من هذا البروتوكول، باستثناء دون آسيبرومازين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس على وسادة التدفئة في جميع أنحاء اختبار السمع حتى الفأر هو مستيقظا تماما، لمنع ما بعد التخدير، انخفاض حرارة الجسم. ملاحظة: استخدمالمنبهات الصوتية التالية في هذه التجربة: اضغط (5 ميللي ثانية مدتها؛ 31 معدل العرض هرتز). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أقطاب كهربائية إبرة تحت الجلد في قمة الرأس، وتحت الصيوان من الأذن اليسرى (المرجع)، وتحت الأذن المقابل (الأرض) والبدء ABRs تسجيل كما هو موضح سابقا في غرفة عازلة للصوت 27،28. سجل الطول الموجي ABR في 5 فترات ديسيبل مستوى ضغط الصوت منخفضا من أقصى السعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عتبات ABR بعد العمل الجراحي في أقرب وقت 4 أيام بعد الولادة الفيروسي يتم تعريف عتبة كمستوى أدنى التحفيز التي استجابة قمم للموجات I-V من الواضح والحاضر مرارا وتكرارا على الفحص البصري: ملاحظة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الموجة I لتحليل النشاط من العصب القوقعي. يتم تعريف أدنى مستوى التحفيز التي تعطي ABR الموجي كشفها كما العتبة. </li></ol> 5. القوقعة التعبير التحوير البروتين عن طريق المناعي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفئران عن طريق جرعة زائدة من intrapحقن eritoneal من خليط من هيدروكلوريد الكيتامين وزيلازين هيدروكلوريد النحو الموضح في القسم 1.2 من هذا البروتوكول، باستثناء دون آسيبرومازين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع رأس رئيس إلا بعد الحيوان لم يعد يستجيب للمؤثرات المؤلمة، مثل قرصة أخمص قدميه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح للقوقعة بها وعملية لجبل لالجامع المناعي كما هو موضح 26. يوصف بروتوكول مفصل من قوقعة كله يشن المناعي باستخدام مكافحة VGLUT3 والأجسام المضادة 7A مكافحة الميوسين في عقيل وآخرون. 2013 29. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوضع العلامات GFP، احتضان قوقعة يتصاعد كلها بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع الأرنب مكافحة GFP الأجسام المضادة في 1: 250 التخفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف القوقعة مرتين لمدة 10 دقيقة مع برنامج تلفزيوني ثم احتضان لمدة 2 ساعة في الماعز المضادة للأرنب مفتش مترافق إلى Cy2 المخفف 1: 4،000 في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف القوقعي مع برنامج تلفزيوني مرتين لمدة 10 دقيقة واحتضان لهم دابي لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيب القوقعة على الشرائح الزجاجية ومراقبة اوندإيه المجهر مع المناعي متحد البؤر. </li></ol>

<ol>
	<li>Jero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+gene+delivery+through+an+intact+round+window+membrane+in+mouse.">Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse.</a> Hum. Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).</li><li>Nam, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+adeno-associated+virus+serotype+8,+a+gene+therapy+vector.">Structure of adeno-associated virus serotype 8, a gene therapy vector.</a> J. Virol. 81 (22), 12260-12271 (2007).</li><li>Ryan, A. F., Mullen, L. M., Doherty, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+targeting+for+cochlear+gene+therapy.">Cellular targeting for cochlear gene therapy.</a> Adv Otorhinolaryngol. 66, 99-115 (2009).</li><li>Xia, L., Yin, S., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+ear+gene+trasfection+in+neonatal+mice+using+adeno-associate+viral+vwctor:+a+comparison+of+two+approaches.">Inner ear gene trasfection in neonatal mice using adeno-associate viral vwctor: a comparison of two approaches.</a> PLoS One. 7 (8), e43218 (2012).</li><li>Husseman, J., Raphael, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+in+the+inner+ear+using+adenovirus+vectors.">Gene therapy in the inner ear using adenovirus vectors.</a> AdvOtorhinolaryngol. 66, 37-51 (2009).</li><li>Ballana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+specific+transduction+of+cochlear+supporting+cells+by+adeno-associated+virus+serotype+5.">Efficient and specific transduction of cochlear supporting cells by adeno-associated virus serotype 5.</a> Neurosci. Lett. 442 (2), 134-139 (2008).</li><li>Praetorius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral+vectors+for+improved+gene+delivery+to+the+inner+ear.">Adenoviral vectors for improved gene delivery to the inner ear.</a> Hear. Re. 248 (1-2), 31-38 (2009).</li><li>Kay, M. A., Glorioso, C. G., Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+therapy:+the+art+of+turning+infectious+agents+into+vehicles+of+therapeutics.">Viral vectors for gene therapy: the art of turning infectious agents into vehicles of therapeutics.</a> Nature Medicine. 7 (1), 33-40 (2001).</li><li>Kesser, B. W., Lalwani, A. K., Ryan, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+and+Stem+Cell+Transplantation:+Strategies+for+Hearing+Restoration.">Gene Therapy and Stem Cell Transplantation: Strategies for Hearing Restoration.</a> Adv Otorhinolaryngol. 66, 64-86 (2009).</li><li>Cooper, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+delivery+of+the+caspase+inhibitor+XIAP+protects+against+cisplatin+ototoxicity.">AAV-mediated delivery of the caspase inhibitor XIAP protects against cisplatin ototoxicity.</a> Otol. Neurotol. 27 (4), 484-490 (2006).</li><li>Gratton, M. A., Salvi, R. J., Kamen, B. A., Saunders, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+cisplatin+and+noise+on+the+peripheral+auditory+system.">Interaction of cisplatin and noise on the peripheral auditory system.</a> Hear. Res. 50 (1-2), 211-223 (1990).</li><li>Lalwani, A. K., Walsh, B. J., Reilly, P. G., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+in+vivo+gene+therapy+for+hearing+disorders:+introduction+of+adeno-associated+virus+into+the+cochlea+of+the+guinea+pig.">Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig.</a> Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).</li><li>Kesser, B. W., Hashisaki, G. T., Holt, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Transfer+in+Human+Vestibular+Epithelia+and+the+Prospects+for+Inner+Ear+Gene+Therapy.">Gene Transfer in Human Vestibular Epithelia and the Prospects for Inner Ear Gene Therapy.</a> Laryngoscope. 118 (5), 821-831 (2008).</li><li>Izumikawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+hair+cell+replacement+and+hearing+improvement+by+Atoh1+gene+therapy+in+deaf+mammals.">Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals.</a> Nat. Med. 11 (3), 271-276 (2005).</li><li>Praetorius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovector-mediated+hair+cell+regeneration+is+affected.">Adenovector-mediated hair cell regeneration is affected.</a> Acta Otolaryngol. 130 (2), 215-222 (2009).</li><li>Friedman, L. M., Dror, A. A., Avraham, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+to+study+inner+ear+development+and+hereditary+hearing+loss.">Mouse models to study inner ear development and hereditary hearing loss.</a> Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 609-631 (2007).</li><li>Chang, E. H., Van Camp, G., Smith, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+connexins+in+human+disease.">The role of connexins in human disease.</a> Ear Hear. 24 (4), 314-323 (2003).</li><li>Cohen-Salmon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+ablation+of+connexin26+in+the+inner+ear+epithelial+gap+junction+network+causes+hearing+impairment+and+cell+death.">Targeted ablation of connexin26 in the inner ear epithelial gap junction network causes hearing impairment and cell death.</a> Curr. Biol. 12 (13), 1106-1111 (2002).</li><li>Nickel, R., Forge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+and+connexins+in+the+inner+ear:+their+roles+in+homeostasis+and+deafness.">Gap junctions and connexins in the inner ear: their roles in homeostasis and deafness.</a> Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 16 (5), 452-457 (2008).</li><li>Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kv7-type+channel+currents+in+spiral+ganglion+neurons:+involvement+in+sensorineural+hearing+loss.">Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss.</a> J. Biol. Chem. 285 (45), 34699-34707 (2010).</li><li>Leibovici, M., Safieddine, S., Petit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+human+hereditary+deafness.">Mouse models for human hereditary deafness.</a> Curr. Top. Dev. Biol. 84, 385-429 (2008).</li><li>Dror, A. A., Avraham, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+loss:+mechanisms+revealed+by+genetics+and+cell+biology.">Hearing loss: mechanisms revealed by genetics and cell biology.</a> Annu. Rev. Genet. 43, 411-437 (2009).</li><li>Richardson, G. P., de Monvel, J. B., Petit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+genetics+of+deafness+illuminates+auditory+physiology.">How the genetics of deafness illuminates auditory physiology.</a> Annu. Rev. Physiol. 73, 311-334 (2011).</li><li>Jero, J., Tseng, C. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+surgical+approach+appropriate+for+targeted+cochlear+gene+therapy+in+the+mouse.">A surgical approach appropriate for targeted cochlear gene therapy in the mouse.</a> Hearing Research. 151 (1-2), 106-114 (2001).</li><li>Seal, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorineural+deafness+and+seizures+in+mice+lacking+vesicular+glutamate+transporter+3.">Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3.</a> Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).</li><li>Akil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+hearing+in+the+VGLUT3+knockout+mouse+using+virally+mediated+gene+therapy.">Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy.</a> Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).</li><li>Akil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+deafness+and+altered+cochlear+innervation+in+knock-out+mice+lacking+prosaposin.">Progressive deafness and altered cochlear innervation in knock-out mice lacking prosaposin.</a> J. Neurosci. 26 (5), 13076-13088 (2006).</li><li>Fremeau, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+glutamate+transporters+1+and+2+target+to+functionally+distinct+synaptic+release+sites.">Vesicular glutamate transporters 1 and 2 target to functionally distinct synaptic release sites.</a> Science. 304 (5678), 1815-1819 (2004).</li><li>Akil, O., Lustig, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Cochlear+Whole+Mount+Immunofluorescence.">Mouse Cochlear Whole Mount Immunofluorescence.</a> Bio-protocol. , (2013).</li><li>Kho, S. T., Pettis, R. M., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlea+microinjection+and+its+effects+upon+auditory+function+in+guinea+pig.">Cochlea microinjection and its effects upon auditory function in guinea pig.</a> Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).</li><li>Iizuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+in+vivo+delivery+of+transgene+via+adeno-associated+virus+into+supporting+cells+of+the+neonatal+mouse+cochlea.">Noninvasive in vivo delivery of transgene via adeno-associated virus into supporting cells of the neonatal mouse cochlea.</a> Hum. Gene Ther. 19 (4), 384-390 (2008).</li><li>Kilpatrick, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus-mediated+gene+delivery+into+the+scala+media+of+the+normal+and+deafened+adult+mouse+ear.">Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear.</a> Gene Ther. 18 (6), 569-578 (2011).</li><li>Yamasoba, T., Yagi, M., Roessler, B. J., Miller, J. M., Raphael, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+Ear+Transgene+Expressionafter+Adenoviral+Vector+Inoculation+in+the+Endolymphatic+Sac+Hum.">Inner Ear Transgene Expressionafter Adenoviral Vector Inoculation in the Endolymphatic Sac Hum.</a> Gene Ther. 10 (5), 769-774 (1999).</li><li>Praetorius, M., Baker, K., Weich, C. M., Plinkert, P. K., Staecker, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+preservation+after+inner+ear+gene+therapy:+the+effect+of+vector+and+surgical+approach.">Hearing preservation after inner ear gene therapy: the effect of vector and surgical approach.</a> ORL J. Otorhinolaryngol. Relat. Spec. 65 (4), 211-214 (2003).</li><li>Carvalho, G. J., Lalwani, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cochleaostomy+and+intracochlear+infusion+on+auditory+brain+stem+response+threshold+in+the+guinea+pig.">The effect of cochleaostomy and intracochlear infusion on auditory brain stem response threshold in the guinea pig.</a> Am. J. Otol. 20 (1), 87-90 (1999).</li><li>Kawamoto, K., Oh, S. H., Kanzaki, S., Brown, N., Raphael, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Functional+and+Structural+Outcome+of+Inner+Ear+Gene+Transfer+via+the+Vestibular+and+Cochlear+Fluids+in+Mice.">The Functional and Structural Outcome of Inner Ear Gene Transfer via the Vestibular and Cochlear Fluids in Mice.</a> Mol. Ther. 4 (6), 575-585 (2001).</li><li>Lalwani, A. K., Han, J. J., Walsh, B. J., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+reporter+for+gene+transfer+studies+in+the+cochlea.">Green fluorescent protein as a reporter for gene transfer studies in the cochlea.</a> Hear Res. 114 (1-2), 139-147 (1997).</li><li>Lalwani, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+cochlear+transgene+expression+mediated+by+recombinant+adeno-associated+virus.">Long-term in vivo cochlear transgene expression mediated by recombinant adeno-associated virus.</a> Gene Ther. 5 (2), 277-281 (1998).</li><li>Raphael, Y., Frisancho, J. C., Roessler, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral-mediated+gene+transfer+into+guinea+pig+cochlear+cells+in+vivo.">Adenoviral-mediated gene transfer into guinea pig cochlear cells in vivo.</a> Neurosci. Lett. 207 (2), 137-141 (1996).</li><li>Weiss, M. A., Frisancho, J. C., Roessler, B. J., Raphael, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+mediated+gene+transfer+in+the+cochlea.">Viral mediated gene transfer in the cochlea.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 15 (4=5), 577-583 (1997).</li><li>Pettis, R. M., Han, J. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracochlear+infusion+of+recombinant+adeno+associated+virus:+Analysis+of+its+dissemination+to+near+and+distant+tissues.">Intracochlear infusion of recombinant adeno associated virus: Analysis of its dissemination to near and distant tissues.</a> Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. 21, 673 (1998).</li><li>Konish, i. M., Kawamoto, K., Izumikawa, M., Kuriyama, H., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+guinea+pig+cochlea+using+adeno-associated+virus+vectors.">Gene transfer into guinea pig cochlea using adeno-associated virus vectors.</a> J. Gene Med. 10 (6), 610-618 (2008).</li><li>Kaplitt, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+gene+expression+and+phenotypic+correction+using+adeno-associated+virus+vectors+in+the+mammalian+brain.">Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain.</a> Nature Genetics. 8 (2), 148-154 (1994).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

في هذا العمل، نحن تصف بالتفصيل تقنية التي يمكن استخدامها للعلاج بالجينات القوقعة، وذلك بهدف استعادة أو إنقاذ وظيفة السمع العادية التي تتعرض للخطر من قبل خلل جيني. كما هو ارضحي عادة، وهذا النهج هو آمن لنقل الجين القوقعة أو العلاجات الجزيئية المحتملة الأخرى 30. و?...

منذ فترة طويلة واقترح العلاج الجيني كعلاج محتمل لفقدان السمع الوراثية، ولكن ظلت النجاح في هذا المجال بعيد المنال 1. حتى الآن، وقد سادت منهجيات بوساطة فيروسي بسبب القدرة النظرية لاستهداف أنواع معينة من الخلايا داخل القوقعة التي يتعذر الوصول إليها نسبيا. وقد استخدمت كل من اتش (AV) وفيروس الغدة المرتبطة (AAV) لتوصيل الجينات القوقعة. AAVs هي مفيدة في القوقعة لعدد من الأسباب. وهي فيروسات النسخ ناقصة ويمكن نقل الجزيئات المعدلة وراثيا بكفاءة لأنواع مختلفة من الخلايا بما في ذلك الخلايا العصبية، هدف هام لعدد من الأسباب المؤدية إلى فقدان السمع. وتوسطت دخول AAV في الخلية التي كتبها مستقبلات محددة 2. وبالتالي، يجب أن يكون اختيار النمط المصلي خاص متوافق مع أنواع الخلايا إلى أن transduced. يمكن AAVs بالنقل فعال خلايا الشعر (3) وتدرج في الجينوم المضيف، مما أدى إلى مستقر، والتعبير على المدى الطويل من هيئة تنظيم الاتصالاتnsgenic البروتين والتغير المظهري في الخلية 4. في حين لا فائدة بالضرورة لتطبيقات قصيرة الأجل مثل تجديد خلايا الشعر، والتعبير على المدى الطويل هو مهم جدا لإنقاذ مستقر من عيوب وراثية. لأن لا ترتبط AAVs مع أي مرض أو عدوى الإنسان وإظهار أي تسميم أذني 5،6،7، فهي مرشحا مثاليا للاستخدام في العلاج الجيني لأشكال الموروثة من فقدان 8 السمع. وقد تمت دراسة نقل المادة الوراثية الخارجية إلى الأذن الداخلية الثدييات باستخدام ناقلات فيروسية خلال العقد الماضي، ويبرز بوصفه تقنية واعدة لعلاج أشكال كلا الوراثية والمكتسبة للخسارة 9 السمع. القوقعة يحتمل أن تكون هدفا مثاليا للعلاج بالجينات لعدة أسباب: 1) يتطلب حجمه صغير كمية محدودة من الفيروس الحاجة؛ 2) عزلتها النسبية عن غيرها من آثار حدود أجهزة الجسم الجانب. و3) غرف مملوءة بسائل في تسهيل الفيروسيةتسليم جميع أنحاء المتاهة 10، 11،12،13،14، 15. نماذج الماوس من الصمم الخلقي تسمح لاستخدام العديد من أساليب الدراسة إلى رصد التنمية في الأذن الداخلية و بطريقة قابلة للتكرار منهجية. في حين أن صغر حجم الماوس القوقعة لا يقدم بعض الصعوبة الجراحية، ويعمل الماوس باعتبارها نموذجا هاما للغاية في دراسة فقدان السمع الوراثية، مع العديد من المزايا التجريبية على الأنواع الأخرى (16). نماذج الماوس تسمح بتقييم مجموعة من الخصائص من خلال التحليل الجيني الربط، وجمع من الملاحظات الشكلية مفصلة، ​​ومحاكاة سيناريوهات المسببة للأمراض. على هذا النحو، فهي مرشحة جيدة للعلاج بالجينات بوساطة فيروسي. جعلت الدراسات الجينية واسعة في الفئران جنبا إلى جنب مع التقدم التكنولوجي من الممكن لتوليد الفئران المعدلة وراثيا بطريقة استنساخه في المختبرات 17،18، 19، 20،21. Furthermorه، توجد العديد من النماذج على حد سواء المكتسبة والموروثة سماع الظواهر الخسارة في الفئران، مما يسمح للاختبارات صارمة في هذا النموذج الحيواني 22، 23،24. وهكذا، وتصحيح السمع باستخدام العلاج الجيني بوساطة فيروسي في نموذج الفأر هو خطوة أولى المناسبة في البحث عن علاج لمرض البشري. لقد أظهرنا سابقا أن الفئران المعدلة وراثيا التي تفتقر إلى نقل الغلوتامات حويصلي 3 (VGLUT3) يولدون الصم بسبب عدم الإفراج الغلوتامات في IHC الشريط المشبك 25. لأن هذه الطفرة لا يؤدي إلى انحطاط الأساسي للخلايا الشعر الحسية، هذه الفئران الطافرة يمكن أن تكون نموذجا ممتازا فيها لاختبار العلاج الجيني قوقعة لفقدان السمع الخلقية. حتى الآن، وقد وصفت عدد من التقنيات تسليم الفيروسية للعلاج بالجينات القوقعة، بما في ذلك جولة نشر نافذة الغشاء، مستديرة حقن نافذة الغشاء، والتسليم عن طريق فغر القوقعة. هناك قويةمزايا وعيوب كل من هذه الأساليب 9 الاتحاد العالمي للتعليم. نحن هنا الإبلاغ عن طريقة جراحية للتوسط فيروسي توصيل الجينات إلى الأذن الداخلية VGLUT3 KO الماوس من خلال النافذة غشاء الجولة (RWM). وبعد أذني طريقة الحقن RWM هو الغازية الحد الأدنى مع الحفاظ على جلسة ممتازة، وسريع نسبيا. كما نشرنا سابقا، في محاولة لاستعادة السمع في هذا النموذج الماوس، تم إدخال ناقلات AAV1 تحمل الجين VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) في القوقعة من هذه الفئران صماء في يوم ما بعد الولادة 12 (P! @)، مما أدى إلى استعادة السمع 26. السمع في الفئران VGLUT3 KO تم التحقق من استجابة الدماغ السمعية (ABR)، في حين تم التحقق من البروتين التحوير التعبير باستخدام المناعي (IF). وهكذا يوضح هذه المنهجية أن العلاج الجيني بوساطة فيروسي يمكن أن تصحح الخلل الجيني التي من شأنها أن يؤدي خلاف ذلك في الصمم.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="803">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">Name</td>
			<td style="width:177px;">Company</td>
			<td style="width:161px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:111px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">Ketamine</td>
			<td style="width:177px;">Butler Schein</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">Xylazine</td>
			<td style="width:177px;">AnaSed</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:355px;">Acepromazine</td>
			<td style="width:177px;">Provided by UCSF LARC</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:355px;">Carprofen analgesia</td>
			<td style="width:177px;">Provided by UCSF LARC</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:355px;">Betadine</td>
			<td style="width:177px;">Betadine Puredue Pharma</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex)</td>
			<td style="width:177px;">Alcon</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">Heating pad</td>
			<td style="width:177px;">Braintree scientific, inc.</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">25G needle</td>
			<td style="width:177px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:161px;">305127</td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:355px;">Borosilicate capillary pipette</td>
			<td style="width:177px;">World precision instruments, inc.</td>
			<td style="width:161px;">1B100F-4</td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">Suture PDS*plus Antibacterial</td>
			<td style="width:177px;">Ethicon</td>
			<td style="width:161px;">PDP149</td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">Tissue glue (Vetcode)</td>
			<td style="width:177px;">Butler Schein</td>
			<td align="right" style="width:161px;">31477</td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">Rabbit Anti-GFP antibody</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">A11122</td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissecting microscope&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>MZ95</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flaming/ Brown Micropipette&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Puller Model P-97&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TDT BioSig III System&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;Tucker-Davis Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surgical method for virally mediated gene delivery to the mouse inner ear through the round window membrane

العلاج الجيني، وتستخدم لتحقيق الانتعاش وظيفية من الصمم الحسي العصبي، وعود بمنح فهم أفضل للآليات الجزيئية والجينية الأساسية التي تساهم في فقدان السمع. ويجب أن يتم إدخال ناقلات في الأذن الداخلية بطريقة توزع على نطاق واسع وكيل في جميع أنحاء القوقعة مع التقليل من إصابة في الهياكل القائمة. توضح هذه المخطوطة نهج الجراحي بعد أذني التي يمكن استخدامها للماوس العلاج القوقعة باستخدام الجزيئية، الصيدله، والتسليم الفيروسي على الفئران يوم ما بعد الولادة 10 وكبار السن عبر النافذة غشاء الجولة (RWM). هذا النهج الجراحي يمكن التسليم السريع والمباشر إلى طبلة الأذن سكالا مع تقليل فقدان الدم وتجنب نفوق الحيوانات. هذه التقنية تنطوي على ضرر يذكر أو لا للهياكل الأساسية في الأذن الداخلية والوسطى وكذلك عضلات الرقبة بالكامل مع الحفاظ على السمع. للتدليل على فعالية هذه التقنية الجراحية، وglutam حويصليأكل نقل ستستخدم 3 خروج المغلوب (VGLUT3 KO) الفئران كمثال على نموذج الفأر من الصمم الخلقي أن يسترد السمع بعد الولادة من VGLUT3 إلى الأذن الداخلية باستخدام فيروس الغدة المرتبطة (AAV-1).

للتحقق من الخصائص التقنية وفائدة النهج بعد أذني لعلاج الجزيئي القوقعة، تم تسليم AAV1-VGLUT3، AAV1-GFP وAAV2-GFP في الفئران P10-12 الأذن الداخلية عن طريق RWM. هذا النهج يوضح الناجح التعبير التحوير في خلايا الشعر الداخلية (IHC) (VGLUT3 الشكل 1 و 2 و GFP الشكل GFP ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane at JoVE.com

Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane

The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane.

الطريقة الجراحية لفيروسي وساطة جين التسليم إلى الأذن الداخلية الماوس من خلال جولة النافذة غشاء

Gene therapy, used to achieve functional recovery from sensorineural deafness, promises to grant better understanding of the underlying molecular and ...

surgical-method-for-virally-mediated-gene-delivery-to-mouse-inner-ear

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.1K Views.  University of California, San Francisco. The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane. 

Video: Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, inflammatory and metabolic conditions, using in vivo fluorescence microscopy. A closed cranial window is placed over the left parieto-occipital cortex of the mice. Local microcirculation is recorded in real time through the window using epi and fluorescence illumination, and measurements of vessels diameters and red blood cell (RBC) velocities are performed. RBC velocity is measured using real-time cross-correlation and/or fluorescent-labeled erythrocytes. Leukocyte and platelet adherence to pial vessels and assessment of perfusion and vascular leakage are made with the help of fluorescence-labeled markers such as Albumin-FITC and anti-CD45-TxR antibodies. Microcirculation can be repeatedly video-recorded over several days. We used for the first time the close window brain intravital microscopy to study the pial microcirculation to follow dynamic changes during the course of Plasmodium berghei ANKA infection in mice and show that expression of CM is associated with microcirculatory dysfunctions characterized by vasoconstriction, profound decrease in blood flow and eventually vascular collapse.

Intravital microscopy to follow temporal and spatial hemodynamic and inflammatory events in the pial microcirculation.

Intravital المجهري للماوس دوران الأوعية الدقيقة الدماغ باستخدام نافذة مغلقة القحف

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

الحبل الشوكي الكهربية ثانيا : خارج الخلية التصنيع الكهربائي شفط

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

عزل LacZ - معربا عن خلايا من أنسجة الأذن الداخلية باستخدام الماوس التدفق الخلوي

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

نقل الجينات إلى الأذن الداخلية عن طريق تطوير ماوس<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

مصقول وعززت ضعيفة، جمجمة نافذة على المدى الطويل التصوير من مخ الفأر

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

تسجيلات المشبك التصحيح في الأذن الداخلية خلايا الشعر المعزولة من اسماك الزرد

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

التصوير pHluorin الموسومة الإدراج مستقبلات غشاء البلازما إلى الخلايا العصبية في الابتدائية الماوس مثقف

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

الاستفادة المشتركة منهجيات لتحديد دور البلازما غشاء تسليم خلال أكسون التشعب والعصبية التشكل

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous substances into the brain. These exogenous substances may induce injurious impact or constitute therapeutic strategy. The most common delivery methods of exogenous substances into the brain are based on systemic deliveries, such as subcutaneous or intravenous routes. Although commonly used, these approaches have several limitations, including low delivery efficacy into the brain. In contrast, surgical methods that locally deliver substances into the CNS are more specific and prevent the uptake of the exogenous substances by other organs. Several surgical methods for CNS delivery are available; however, they tend to be very traumatic. Here, we describe a mouse infusion microsurgery technique, which effectively delivers substances into the brain via the internal carotid artery, with minimal trauma and no interference with normal CNS functionality.

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

The present protocol describes a mouse microsurgery infusion technique, which effectively delivers substances directly into the brain via the internal carotid artery.

الماوس المجهرية تسريب تقنية لالمستهدفة المواد تسليم في الجهاز العصبي المركزي<i&gt; عبر</i&gt; في الشريان السباتي الداخلي

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

استئصال الصفيحة الفقرية وغرس نافذه الحبل الشوكي في الماوس

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...