This work is supported by an R21 grant from the National Institutes of Health and by a grant from Hearing Research, Incorporated.

הערה: כל טיפול הנהלים ובעלי חיים עמד בהנחיות האתיקה NIH ודרישות פרוטוקול שאושרו בוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו. 1. הכנת בעלי החיים לכירורגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוחים בחלל נקי, מסור. החיטוי כל מכשירי הניתוח, לעקר עם מעקר חרוזי זכוכית לפני הניתוח. הערה: בפרוטוקול זה, להשתמש ביום לידה 10-12 עכברי FVB (P10-12). גילים וזנים של עכברים שונים יכולים לשמש כדי לענות על הצרכים של פרויקט ספציפי. עכברים מבוגרים יותר מP40 יכולים להיות מאתגרים, כי עצם הבולה נהיה קשה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברים עם זריקת intraperitoneal של תערובת של קטמין הידרוכלוריד (100 מ&quot;ג / קילוגרם), hydrochloride xylazine (10 מ&quot;ג / קילוגרם), וacepromazine (2 מ&quot;ג / קילוגרם). בגין הכנה כירורגית רק לאחר החיה כבר לא מגיבה לגירויים מכאיבים, כגון צביטת הבוהן. אם necessary, לנהל מנת דחף (חמישית במינון המקורי) של קוקטייל ההרדמה כדי לשחזר את המטוס המקורי ההרדמה. הערה: הקפד בשלב זה משום שרוב התמותה שנצפתה בגיל זה נגרם על ידי מנת יתר הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את עיניו של בעל החיים עם משחת עיני מגן כדי לשמור על העיניים לחות במהלך הרדמה, דיכוי רפלקס המצמוץ של החיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את העכבר עם הצוואר המורחב על כרית חימום לאורך כל ההליך עד לעכבר הוא ער לחלוטין, כדי למנוע היפותרמיה לאחר הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את אזור פוסט-אוזן השמאל עם קליפר ולחטא עם אתנול 70% וpovidone- יוד לפני מניפולציה כירורגית. </li></ol> 2. הליך כירורגי והזרקת וקטור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בגישת פוסט-תנוכים לחשוף את הבולה התוף. לחתוך את הרקמה התת עורית עם מספריים קטנים לחשוף את השרירים פוסט-אוזן. לאחר חוזר בי רקמת שומן הצד אחורי דואר של החתך, להפריד את השרירים בצד הימין וצד שמאל ניצב לחתך על מנת לחשוף את העצם הטמפורלית. ודא שחתך זה מספיק זמן כדי לעבוד בנוחות עם הדמיה נאותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקב הבולה התוף עם מחט 25 G ולהרחיב את החור במידת צורך עם מלקחיים על ידי קילוף העצם אחורי כדי לאפשר גישה לתורו הבסיסי של השבלול, ולאחר מכן להרחיב במידה מספקת כדי להמחיש את עורק stapedial וחלון העגול הקרום (RWM) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקב את RWM בעדינות במרכז עם טפטפת נימי ורוסיליקט. שים לב בזרימת נוזל דרך RWM בשלב זה; זה נורמלי. חכה עד שהזרימה התייצבה (נוזל effluxed מהשבלול הוא מיובש עם נייר סינון סטרילי). הערה: היזהר בעת ההחזקה וקידום מחט הזכוכית כך שניקוב RWM הוא קטן ככל האפשר. בהתאם למיקרוסקופ משמש, להחזיק טפטפות באמצעות micromanipulator או ביד בעזרת פיפטהבעל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את טפטפות להזרקה באמצעות פיפטה חולץ אותו טפטפות מהדק תיקון הדרך מוכנה. ודא שקוטר הקצה הוא גדול (15 מיקרומטר על קוטר), כך שpipetting הווירוס פנימה והחוצה נעשה בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את 1 עד 2 μl של AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP או AAV2-GFP לפיפטה הזרקה. לאחר הזרימה הוא התייצב (5 עד 10 דקות), microinject כרך זה קבוע להלמות scala דרך אותו החור שנעשה בעבר בRWM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את הנישה RW מהירות לאחר שהפילה את פיפטה עם תקע קטן של שרירים ולאבטח אותו עם טיפה קטנה של דבק רקמות מונחת על השרירים כדי למנוע דליפה מהחלון העגול. הערה: חותם החור הזה היטב לאחר המחט מוסרת עם תקע קטן של שרירים כדי למנוע כל דליפת perilymph מהשבלול זה הצעד חיוני כדי לשמור על שמיעה. הכישלון לאטום לחלוטין RWM יגרום לאובדן שמיעה לאורך זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזרקה, לכסותחור בבולה השמיעתית עם רקמת שומן, להחזיר את השרירים שלאחר אוזן ורקמת שומן למצב הרגיל שלהם ותפר את הפצע בשכבות עם תפר נספג כרום 6-0 או קטן יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את הפצע עם povidone- יוד. </li></ol> 3. לאחר ניתוח טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים עכברים בכלוב חם ולא להשאיר אותם ללא השגחה עד שהם התאוששו באופן מלא ולאחר מכן לחזור עם האמא שלהם. מומלץ להסיר את הזכר מהכלוב לפני שהכניס את הגורים בחזרה עם אמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל carprofen תת-עורי (2 מ&quot;ג / קילוגרם) על כאבים לאחר הניתוח ובכל שעה 24 ואילך במשך 3 ימים, כדי לנהל את הדלקת וכאב. לפקח על בעלי החיים מדי יום בחיפוש אחר סימנים של מצוקה, ירידה במשקל נורמלית, כאב, או זיהום. בדרך כלל מהיום ליום 3 rd לאחר הניתוח כל העכברים יש לפעול כרגיל. אם כל סימני מצוקה או מחלה מופיעים בעכבר לאחר יום 3 rd, לשקול הרדמת חסד tהוא העכבר בהתאם להנחיות מוסדיות. </li></ol> 4. הערכה של תפקוד שבלול בעקבות משלוח ויראלי שימוש שמיעתי בגזע מוח תגובת הקלטות (ABR) הערה: הבדיקה ABR (ABR) היא שמיעתי עורר פוטנציאלי המופק מפעילות חשמלית במוח מתמשכת ונרשמו באמצעות אלקטרודות המונחות מתחת לקרקפת. בעלי החיים מגורה עם קול. ההקלטה וכתוצאה מכך מורכבת מחמישה גלים המשקפים את הפעילות החשמלית של נקודות רצופות במסלול השמיעה בראשונה 10 האלפיות השניים לאחר תחילתה של גירוי שמיעתי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים בזריקת intraperitoneal של תערובת של קטמין הידרוכלוריד וhydrochloride xylazine כאמור בסעיף 1.2 של פרוטוקול זה, למעט ללא acepromazine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העכבר על כרית חימום לאורך כל בדיקת השמיעה עד העכבר הוא ער לחלוטין, כדי למנוע היפותרמיה לאחר הרדמה. הערה: שימוש בגירויי הקול הבאים בניסוי זה: לחצו (5 אלפיות שני משך; מצגת שיעור Hz 31). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים אלקטרודות מחט subdermal בקודקוד, מתחת לאפרכסת אוזן השמאל (הפניה), ומתחת לאוזן הנגדית (קרקע) ולהתחיל ABRs הקלטה כפי שתואר לעיל בתא אטום לרעש 27,28. גל ABR שיא ב 5 מרווחי רמת לחץ קול dB למטה ממשרעת המרבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע ספי ABR לאחר הניתוח מוקדם ככל 4 ימים לאחר לידה נגיפית הערה: סף מוגדר כרמת הגירוי הנמוכה ביותר שבי תגובת פסגות לגלים I-V היו ברור ובהווה שוב ושוב על בדיקה ויזואלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד Wave אני לנתח את הפעילות מעצב השבלול. רמת הגירוי הנמוכה ביותר שמניבה צורת גל ABR לזיהוי מוגדרת כסף. </li></ol> 5. ביטוי חלבון השבלול transgene שימוש Immunofluorescence <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים על ידי מינון יתר של intrapהזרקת eritoneal מתערובת של קטמין הידרוכלוריד וhydrochloride xylazine כאמור בסעיף 1.2 של פרוטוקול זה, למעט ללא acepromazine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף את הראש רק לאחר החיה כבר לא מגיבה לגירויים מכאיבים, כגון צביטת הבוהן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את cochleae החוצה ותהליך לimmunofluorescence הר-שלם, כמתואר 26. פרוטוקול מפורט של immunofluorescence-הר השלם שבלול באמצעות אנטי VGLUT3 ונוגדני 7 א אנטי-שרירן מתואר בעקיל et al., 2013 29. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתיוג GFP, דגירה כל-mounts שבלול הלילה ב 4 ° C עם נוגדן אנטי GFP ארנבת ב 1: 250 דילול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את cochleae פעמיים במשך 10 דקות עם PBS ולאחר מכן דגירה של 2 שעות בIgG נגד הארנב העז המוצמד לCy2 בדילול 1: 4,000 ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את cochleae עם PBS פעמיים במשך 10 דקות ודגירתם עם DAPI במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר cochleae בשקופיות זכוכית ולהתבונן undאה מיקרוסקופ עם immunofluorescence confocal. </li></ol>

<ol>
	<li>Jero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+gene+delivery+through+an+intact+round+window+membrane+in+mouse.">Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse.</a> Hum. Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).</li><li>Nam, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+adeno-associated+virus+serotype+8,+a+gene+therapy+vector.">Structure of adeno-associated virus serotype 8, a gene therapy vector.</a> J. Virol. 81 (22), 12260-12271 (2007).</li><li>Ryan, A. F., Mullen, L. M., Doherty, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+targeting+for+cochlear+gene+therapy.">Cellular targeting for cochlear gene therapy.</a> Adv Otorhinolaryngol. 66, 99-115 (2009).</li><li>Xia, L., Yin, S., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+ear+gene+trasfection+in+neonatal+mice+using+adeno-associate+viral+vwctor:+a+comparison+of+two+approaches.">Inner ear gene trasfection in neonatal mice using adeno-associate viral vwctor: a comparison of two approaches.</a> PLoS One. 7 (8), e43218 (2012).</li><li>Husseman, J., Raphael, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+in+the+inner+ear+using+adenovirus+vectors.">Gene therapy in the inner ear using adenovirus vectors.</a> AdvOtorhinolaryngol. 66, 37-51 (2009).</li><li>Ballana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+specific+transduction+of+cochlear+supporting+cells+by+adeno-associated+virus+serotype+5.">Efficient and specific transduction of cochlear supporting cells by adeno-associated virus serotype 5.</a> Neurosci. Lett. 442 (2), 134-139 (2008).</li><li>Praetorius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral+vectors+for+improved+gene+delivery+to+the+inner+ear.">Adenoviral vectors for improved gene delivery to the inner ear.</a> Hear. Re. 248 (1-2), 31-38 (2009).</li><li>Kay, M. A., Glorioso, C. G., Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+therapy:+the+art+of+turning+infectious+agents+into+vehicles+of+therapeutics.">Viral vectors for gene therapy: the art of turning infectious agents into vehicles of therapeutics.</a> Nature Medicine. 7 (1), 33-40 (2001).</li><li>Kesser, B. W., Lalwani, A. K., Ryan, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+and+Stem+Cell+Transplantation:+Strategies+for+Hearing+Restoration.">Gene Therapy and Stem Cell Transplantation: Strategies for Hearing Restoration.</a> Adv Otorhinolaryngol. 66, 64-86 (2009).</li><li>Cooper, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+delivery+of+the+caspase+inhibitor+XIAP+protects+against+cisplatin+ototoxicity.">AAV-mediated delivery of the caspase inhibitor XIAP protects against cisplatin ototoxicity.</a> Otol. Neurotol. 27 (4), 484-490 (2006).</li><li>Gratton, M. A., Salvi, R. J., Kamen, B. A., Saunders, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+cisplatin+and+noise+on+the+peripheral+auditory+system.">Interaction of cisplatin and noise on the peripheral auditory system.</a> Hear. Res. 50 (1-2), 211-223 (1990).</li><li>Lalwani, A. K., Walsh, B. J., Reilly, P. G., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+in+vivo+gene+therapy+for+hearing+disorders:+introduction+of+adeno-associated+virus+into+the+cochlea+of+the+guinea+pig.">Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig.</a> Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).</li><li>Kesser, B. W., Hashisaki, G. T., Holt, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Transfer+in+Human+Vestibular+Epithelia+and+the+Prospects+for+Inner+Ear+Gene+Therapy.">Gene Transfer in Human Vestibular Epithelia and the Prospects for Inner Ear Gene Therapy.</a> Laryngoscope. 118 (5), 821-831 (2008).</li><li>Izumikawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+hair+cell+replacement+and+hearing+improvement+by+Atoh1+gene+therapy+in+deaf+mammals.">Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals.</a> Nat. Med. 11 (3), 271-276 (2005).</li><li>Praetorius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovector-mediated+hair+cell+regeneration+is+affected.">Adenovector-mediated hair cell regeneration is affected.</a> Acta Otolaryngol. 130 (2), 215-222 (2009).</li><li>Friedman, L. M., Dror, A. A., Avraham, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+to+study+inner+ear+development+and+hereditary+hearing+loss.">Mouse models to study inner ear development and hereditary hearing loss.</a> Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 609-631 (2007).</li><li>Chang, E. H., Van Camp, G., Smith, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+connexins+in+human+disease.">The role of connexins in human disease.</a> Ear Hear. 24 (4), 314-323 (2003).</li><li>Cohen-Salmon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+ablation+of+connexin26+in+the+inner+ear+epithelial+gap+junction+network+causes+hearing+impairment+and+cell+death.">Targeted ablation of connexin26 in the inner ear epithelial gap junction network causes hearing impairment and cell death.</a> Curr. Biol. 12 (13), 1106-1111 (2002).</li><li>Nickel, R., Forge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+and+connexins+in+the+inner+ear:+their+roles+in+homeostasis+and+deafness.">Gap junctions and connexins in the inner ear: their roles in homeostasis and deafness.</a> Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 16 (5), 452-457 (2008).</li><li>Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kv7-type+channel+currents+in+spiral+ganglion+neurons:+involvement+in+sensorineural+hearing+loss.">Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss.</a> J. Biol. Chem. 285 (45), 34699-34707 (2010).</li><li>Leibovici, M., Safieddine, S., Petit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+human+hereditary+deafness.">Mouse models for human hereditary deafness.</a> Curr. Top. Dev. Biol. 84, 385-429 (2008).</li><li>Dror, A. A., Avraham, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+loss:+mechanisms+revealed+by+genetics+and+cell+biology.">Hearing loss: mechanisms revealed by genetics and cell biology.</a> Annu. Rev. Genet. 43, 411-437 (2009).</li><li>Richardson, G. P., de Monvel, J. B., Petit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+genetics+of+deafness+illuminates+auditory+physiology.">How the genetics of deafness illuminates auditory physiology.</a> Annu. Rev. Physiol. 73, 311-334 (2011).</li><li>Jero, J., Tseng, C. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+surgical+approach+appropriate+for+targeted+cochlear+gene+therapy+in+the+mouse.">A surgical approach appropriate for targeted cochlear gene therapy in the mouse.</a> Hearing Research. 151 (1-2), 106-114 (2001).</li><li>Seal, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorineural+deafness+and+seizures+in+mice+lacking+vesicular+glutamate+transporter+3.">Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3.</a> Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).</li><li>Akil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+hearing+in+the+VGLUT3+knockout+mouse+using+virally+mediated+gene+therapy.">Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy.</a> Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).</li><li>Akil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+deafness+and+altered+cochlear+innervation+in+knock-out+mice+lacking+prosaposin.">Progressive deafness and altered cochlear innervation in knock-out mice lacking prosaposin.</a> J. Neurosci. 26 (5), 13076-13088 (2006).</li><li>Fremeau, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+glutamate+transporters+1+and+2+target+to+functionally+distinct+synaptic+release+sites.">Vesicular glutamate transporters 1 and 2 target to functionally distinct synaptic release sites.</a> Science. 304 (5678), 1815-1819 (2004).</li><li>Akil, O., Lustig, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Cochlear+Whole+Mount+Immunofluorescence.">Mouse Cochlear Whole Mount Immunofluorescence.</a> Bio-protocol. , (2013).</li><li>Kho, S. T., Pettis, R. M., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlea+microinjection+and+its+effects+upon+auditory+function+in+guinea+pig.">Cochlea microinjection and its effects upon auditory function in guinea pig.</a> Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).</li><li>Iizuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+in+vivo+delivery+of+transgene+via+adeno-associated+virus+into+supporting+cells+of+the+neonatal+mouse+cochlea.">Noninvasive in vivo delivery of transgene via adeno-associated virus into supporting cells of the neonatal mouse cochlea.</a> Hum. Gene Ther. 19 (4), 384-390 (2008).</li><li>Kilpatrick, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus-mediated+gene+delivery+into+the+scala+media+of+the+normal+and+deafened+adult+mouse+ear.">Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear.</a> Gene Ther. 18 (6), 569-578 (2011).</li><li>Yamasoba, T., Yagi, M., Roessler, B. J., Miller, J. M., Raphael, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+Ear+Transgene+Expressionafter+Adenoviral+Vector+Inoculation+in+the+Endolymphatic+Sac+Hum.">Inner Ear Transgene Expressionafter Adenoviral Vector Inoculation in the Endolymphatic Sac Hum.</a> Gene Ther. 10 (5), 769-774 (1999).</li><li>Praetorius, M., Baker, K., Weich, C. M., Plinkert, P. K., Staecker, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+preservation+after+inner+ear+gene+therapy:+the+effect+of+vector+and+surgical+approach.">Hearing preservation after inner ear gene therapy: the effect of vector and surgical approach.</a> ORL J. Otorhinolaryngol. Relat. Spec. 65 (4), 211-214 (2003).</li><li>Carvalho, G. J., Lalwani, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cochleaostomy+and+intracochlear+infusion+on+auditory+brain+stem+response+threshold+in+the+guinea+pig.">The effect of cochleaostomy and intracochlear infusion on auditory brain stem response threshold in the guinea pig.</a> Am. J. Otol. 20 (1), 87-90 (1999).</li><li>Kawamoto, K., Oh, S. H., Kanzaki, S., Brown, N., Raphael, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Functional+and+Structural+Outcome+of+Inner+Ear+Gene+Transfer+via+the+Vestibular+and+Cochlear+Fluids+in+Mice.">The Functional and Structural Outcome of Inner Ear Gene Transfer via the Vestibular and Cochlear Fluids in Mice.</a> Mol. Ther. 4 (6), 575-585 (2001).</li><li>Lalwani, A. K., Han, J. J., Walsh, B. J., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+reporter+for+gene+transfer+studies+in+the+cochlea.">Green fluorescent protein as a reporter for gene transfer studies in the cochlea.</a> Hear Res. 114 (1-2), 139-147 (1997).</li><li>Lalwani, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+cochlear+transgene+expression+mediated+by+recombinant+adeno-associated+virus.">Long-term in vivo cochlear transgene expression mediated by recombinant adeno-associated virus.</a> Gene Ther. 5 (2), 277-281 (1998).</li><li>Raphael, Y., Frisancho, J. C., Roessler, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral-mediated+gene+transfer+into+guinea+pig+cochlear+cells+in+vivo.">Adenoviral-mediated gene transfer into guinea pig cochlear cells in vivo.</a> Neurosci. Lett. 207 (2), 137-141 (1996).</li><li>Weiss, M. A., Frisancho, J. C., Roessler, B. J., Raphael, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+mediated+gene+transfer+in+the+cochlea.">Viral mediated gene transfer in the cochlea.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 15 (4=5), 577-583 (1997).</li><li>Pettis, R. M., Han, J. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracochlear+infusion+of+recombinant+adeno+associated+virus:+Analysis+of+its+dissemination+to+near+and+distant+tissues.">Intracochlear infusion of recombinant adeno associated virus: Analysis of its dissemination to near and distant tissues.</a> Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. 21, 673 (1998).</li><li>Konish, i. M., Kawamoto, K., Izumikawa, M., Kuriyama, H., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+guinea+pig+cochlea+using+adeno-associated+virus+vectors.">Gene transfer into guinea pig cochlea using adeno-associated virus vectors.</a> J. Gene Med. 10 (6), 610-618 (2008).</li><li>Kaplitt, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+gene+expression+and+phenotypic+correction+using+adeno-associated+virus+vectors+in+the+mammalian+brain.">Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain.</a> Nature Genetics. 8 (2), 148-154 (1994).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

בעבודה זו, אנו מתארים בפירוט טכניקה שיכול לשמש לריפוי גנטי שבלול, במטרה להחזיר או הצלת פונקצית שמיעה נורמלית שנפגעה על ידי פגם גנטי. כפי שהוא בדרך כלל atraumatic, גישה זו היא בטוחה להעברת גני שבלול או טיפולים מולקולריים פוטנציאליים אחרים 30. גישות אחרות לטיפול שבלול ת...

ריפוי גנטי כבר הציע ארוך כטיפול פוטנציאלי לאובדן שמיעה גנטי, אבל הצלחה בתחום זה נותרת חמקמקה 1. עד כה, מתודולוגיות תיווך באופן ויראלי גברו בשל היכולת התיאורטית למקד סוגי תאים מסוימים בתוך השבלול יחסית נגיש. אדנווירוס שניהם (AV) ונגיף adeno הקשורים (AAV) היה בשימוש למסירת גן שבלול. AAVs הוא יתרון בשבלול למספר הסיבות. הם וירוסים כפולים מחסרת וביעילות יכולים להעביר מולקולות מהונדסים לתאים מסוגים שונים, כולל נוירונים, יעד חשוב למספר הסיבות לירידה בשמיעה. כניסת AAV לתוך התא מתווכת על ידי קולטנים ספציפיים 2; כך, הבחירה של סרוטיפ מסוים חייבת להיות תואמת לסוגי התאים להיות transduced. AAVs יכול למעשה transfect תאי שיער 3 ולשלב לתוך הגנום המארח, וכתוצאה מכך הביטוי של tra יציב, לטווח ארוךחלבון nsgenic ושינוי פנוטיפי בתא 4. אמנם לא בהכרח יתרון עבור יישומים לטווח קצר, כגון התחדשות שיער תאים, ביטוי לטווח ארוך הוא מאוד חשוב עבור הצלה יציבה של פגמים גנטיים. בגלל AAVs אינם משויך לשום מחלה או הדבקת בני אדם ולהפגין לא ototoxicity 5,6,7, הם מועמד אידיאלי לשימוש בריפוי גנטי לצורות ירושה של אובדן שמיעת 8. העברה של חומר גנטי אקסוגניים לאוזן הפנימית היונקים באמצעות וקטורים ויראליים נחקרה בעשור האחרון ומסתמנת כטכניקה מבטיחה לטיפול צורות שניהם גנטיות ונרכשות של אובדן שמיעת 9. השבלול הוא פוטנציאל יעד אידיאלי לריפוי גנטי מכמה סיבות: 1) הנפח הקטן שלה מחייב כמות מוגבלת של נגיף צורך; 2) הבידוד היחסי שלה מצד מגבלות מערכות איברי אפקטים אחרים; ו 3) התאים מלא הנוזל להקל נגיפייםמשלוח ברחבי המבוך 10, 11,12,13,14, 15. מודלים עכבר של חירשות מולדת מאפשרים שימוש בשיטות רבות של מחקר לעקוב אחר התפתחות של האוזן הפנימית באופן שיטתי, לשכפול. בעוד גודלו הקטן של cochleae עכבר זה אכן מציג קושי כירורגית, העכבר משמש כמודל חשוב ביותר במחקר של אובדן שמיעה גנטי, עם כמה יתרונות ניסיוניים על מינים אחרים 16. מודלים עכבר מאפשרים הערכה של מגוון רחב של מאפיינים באמצעות ניתוח הצמדה גנטי, אוסף של תצפיות מורפולוגיים מפורטות, ומדמת תרחישים פתוגניים; ככזה, הם מועמדים טובים לטיפול גנטי בתיווך באופן ויראלי. מחקרים גנטיים נרחבים בעכברים בשילוב עם התקדמות טכנולוגית אפשרו ליצור עכברים מהונדסים גנטי בדרך לשחזור בכל מעבדות 17,18, 19, 20,21. Furthermorדואר, קיימים מודלים רבים לרכשו שני וירשו פנוטיפים אובדן שמיעה בעכברים, המאפשרים בדיקות מחמירות במודל זה של בעלי החיים 22, 23,24. לפיכך, תיקון שמיעה באמצעות ריפוי גנטי בתיווך באופן ויראלי במודל של עכברים הוא צעד ראשון מתאים בחיפוש אחר תרופה למחלה אנושית. הראינו בעבר כי עכברים הטרנסגניים חסרי גלוטמט שלפוחי טרנספורטר 3 (VGLUT3) נולדים חירשים בשל חוסר שחרור גלוטמט בסינפסה סרט IHC 25. בגלל מוטציה זו אינה מובילה לניוון עיקרי של תאי שיער החושיים, עכברים שעברו מוטציה אלה הם פוטנציאל מודל מצוין שבו לבחון את הטיפול גנטי שבלול לאובדן שמיעת מולד. נכון להיום, מספר טכניקות מסירה נגיפיות לריפוי גנטי שבלול תוארו, כולל דיפוזיה עגולה חלון קרום, הזרקת חלון קרום עגולה, ומשלוח באמצעות cochleostomy. יש עוצמהיתרונות ial וחסרונות של כל אחת מהגישות האלה 9. כאן אנו מדווחים שיטה כירורגית למסירת גן בתיווך באופן ויראלי לאוזן הפנימית VGLUT3 KO העכבר דרך הקרום העגול החלון (RWM). שיטת הזרקת RWM פוסט-אוזן היא פולשנית עם שימור שמיעה מצוין, והוא מהיר יחסית. כפי שפורסמנו בעבר, בניסיון לשחזר את השמיעה במודל עכבר זה, וקטור AAV1 נושא את גן VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) הוכנס לשבלול האוזן של עכברים החירשים אלה ביום הלידה 12 (P! @), וכתוצאה מכך שיקום שמיעת 26. שמיעה בעכברי VGLUT3 KO אומתה על ידי הבדיקה ABR (ABR), ואילו ביטוי חלבון transgene אומת באמצעות immunofluorescence (IF). מתודולוגיה זו ובכך מוכיחה כי טיפול גנטי באופן ויראלי בתיווך יכול לתקן פגם גנטי שאחרת היה גורם לחירשות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="803">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">Name</td>
			<td style="width:177px;">Company</td>
			<td style="width:161px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:111px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">Ketamine</td>
			<td style="width:177px;">Butler Schein</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">Xylazine</td>
			<td style="width:177px;">AnaSed</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:355px;">Acepromazine</td>
			<td style="width:177px;">Provided by UCSF LARC</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:355px;">Carprofen analgesia</td>
			<td style="width:177px;">Provided by UCSF LARC</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:355px;">Betadine</td>
			<td style="width:177px;">Betadine Puredue Pharma</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex)</td>
			<td style="width:177px;">Alcon</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">Heating pad</td>
			<td style="width:177px;">Braintree scientific, inc.</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">25G needle</td>
			<td style="width:177px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:161px;">305127</td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:355px;">Borosilicate capillary pipette</td>
			<td style="width:177px;">World precision instruments, inc.</td>
			<td style="width:161px;">1B100F-4</td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">Suture PDS*plus Antibacterial</td>
			<td style="width:177px;">Ethicon</td>
			<td style="width:161px;">PDP149</td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">Tissue glue (Vetcode)</td>
			<td style="width:177px;">Butler Schein</td>
			<td align="right" style="width:161px;">31477</td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">Rabbit Anti-GFP antibody</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">A11122</td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissecting microscope&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>MZ95</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flaming/ Brown Micropipette&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Puller Model P-97&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TDT BioSig III System&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;Tucker-Davis Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surgical method for virally mediated gene delivery to the mouse inner ear through the round window membrane

ריפוי גנטי, המשמש להשגת החלמה תפקודית מחירשות חושית, מבטיח להעניק הבנה טובה יותר של מנגנונים המולקולריים וגנטיים הבסיסיים שתורמים לירידה בשמיעה. מבוא של וקטורים לאוזן הפנימית חייב להיעשות באופן שמפיץ את הסוכן נרחב ברחבי השבלול תוך מזעור פגיעה במבנים הקיימים. כתב יד זה מתאר גישה ניתוחית פוסט-אוזן שיכולים לשמש לטיפול בשבלול עכבר באמצעות מולקולרי, תרופתי, ומשלוח נגיפי לעכברים לאחר הלידה יום 10 ומעלה באמצעות הקרום העגול החלון (RWM). גישה ניתוחית זו מאפשרת אספקה ​​מהירה וישירה להלמות scala תוך מזעור אובדן דם והימנעות תמותת בעלי חיים. טכניקה זו כרוכה נזק זניח או לא למבנים חיוניים של האוזן הפנימית ואמצע, כמו גם שרירי צוואר, תוך שמירה על דיון מלא. כדי להדגים את היעילות של טכניקה ניתוחית זו, glutam לפוחיאכלתי טרנספורטר 3 נוקאאוט עכברים (VGLUT3 KO) ישמשו כדוגמא למודל עכבר של חירשות מולדת שמשחזר שמיעה לאחר הלידה של VGLUT3 לאוזן הפנימית באמצעות וירוס adeno הקשורים (AAV-1).

כדי לאמת את התכונות ותועלת של גישת פוסט-אוזן לטיפול מולקולרי שבלול הטכניים, AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP וAAV2-GFP נמסרו לאוזן פנימית עכברי P10-12 באמצעות RWM. גישה זו מדגימה ביטוי transgene מוצלח בתוך תאי שיער פנימיים (IHC) (VGLUT3 איור 1 וGFP איור 2 וGFP איור 3 א), תאי שיער חיצונ?...

Watch this Scientific Journal Video about Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane at JoVE.com

Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane

The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane.

שיטה ניתוחית למשלוח באופן ויראלי המתווכת Gene לאוזן הפנימית באמצעות עכבר העגול חלון ממברנה

Gene therapy, used to achieve functional recovery from sensorineural deafness, promises to grant better understanding of the underlying molecular and ...

surgical-method-for-virally-mediated-gene-delivery-to-mouse-inner-ear

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.1K Views.  University of California, San Francisco. The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane. 

Video: Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, inflammatory and metabolic conditions, using in vivo fluorescence microscopy. A closed cranial window is placed over the left parieto-occipital cortex of the mice. Local microcirculation is recorded in real time through the window using epi and fluorescence illumination, and measurements of vessels diameters and red blood cell (RBC) velocities are performed. RBC velocity is measured using real-time cross-correlation and/or fluorescent-labeled erythrocytes. Leukocyte and platelet adherence to pial vessels and assessment of perfusion and vascular leakage are made with the help of fluorescence-labeled markers such as Albumin-FITC and anti-CD45-TxR antibodies. Microcirculation can be repeatedly video-recorded over several days. We used for the first time the close window brain intravital microscopy to study the pial microcirculation to follow dynamic changes during the course of Plasmodium berghei ANKA infection in mice and show that expression of CM is associated with microcirculatory dysfunctions characterized by vasoconstriction, profound decrease in blood flow and eventually vascular collapse.

Intravital microscopy to follow temporal and spatial hemodynamic and inflammatory events in the pial microcirculation.

מיקרוסקופית Intravital של microcirculation המוח עכבר באמצעות חלון גולגולתי סגור

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

חוט השדרה Electrophysiology II: ייצור תאי אלקטרודה יניקה

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

בידוד LacZ-להביע תאים פנימית עכבר רקמות האוזן באמצעות זרימת cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

ין העברת לאוזן הפנימית על ידי פיתוח מאוס<em&gt; In vivo</em&gt; Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

מלוטשת מחוזק דליל, הגולגולת חלון הדמיה לטווח ארוך של מוח עכבר

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

הקלטות קלאמפ תיקון בתאי שיער באוזן פנימיים מבודדות מדג הזברה

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

הדמית pHluorin-תויגה הכנסת קולט לממברנה הפלזמה בנוירונים עכבר מתורבתים ראשיים

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

ניצול מתודולוגיות משולב להגדיר את התפקיד של משלוח ממברנה פלזמה במהלך אקסון מסעף ו העצבית המורפוגנזה

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

In vivo ג&#39;ין העברה בתאי שוואן בעצב מכרסמים Sciatic ידי Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous substances into the brain. These exogenous substances may induce injurious impact or constitute therapeutic strategy. The most common delivery methods of exogenous substances into the brain are based on systemic deliveries, such as subcutaneous or intravenous routes. Although commonly used, these approaches have several limitations, including low delivery efficacy into the brain. In contrast, surgical methods that locally deliver substances into the CNS are more specific and prevent the uptake of the exogenous substances by other organs. Several surgical methods for CNS delivery are available; however, they tend to be very traumatic. Here, we describe a mouse infusion microsurgery technique, which effectively delivers substances into the brain via the internal carotid artery, with minimal trauma and no interference with normal CNS functionality.

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

The present protocol describes a mouse microsurgery infusion technique, which effectively delivers substances directly into the brain via the internal carotid artery.

טכניקה אינפוזיה Microsurgery עכבר למשלוח ואלכוהול ממוקד לתוך מערכת העצבים המרכזית<i&gt; דרך</i&gt; עורק התרדמה הפנימי

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...