L’objectif global de cet essai, est de préparer des macrophages et des globules rouges opsonisés pour la visualisation de la phagocytose par microscopie tridimensionnelle time lapse. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie, telles que la façon dont les phagocytes capturent et ingèrent les particules. Cette technique permet la visualisation de l’absorption des particules en temps réel, contrairement aux analyses de point final plus traditionnelles qui ne permettent d’évaluer si oui ou non comment, une particule a été ingérée.
En général, les personnes nouvelles à cette méthode peuvent lutter jusqu’à ce qu’elles deviennent habituées aux procédures d’isolement cellulaire. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons réalisé les avantages de faire tourner cette microscopie confocale pour l’imagerie 3D time-lapse de Phagocytosis. Pour isoler les macrophages péritonéaux, placez un cathéter en plastique de calibre 24 dans le péritoine d’une souris de trois à quatre mois, et utilisez une seringue en plastique de cinq millilitres pour la lavage de la cavité deux fois avec 4,5 millilitres de HBSS glacé sans calcium et magnésium par lavage.
Transfert de la suspension aspirée dans un tube de fond rond en polypropylène de 14 millilitres au fur et à mesure qu’elle est recueillie. Lorsque les deux échantillons ont été récoltés, centrifuger l’aspirate, et resuspendre les cellules péritonéales dans un millilitre de bicarbonate complet libre RPMI 1640 milieu pour atteindre environ six fois 10 à la sixième cellule par concentration millilitre. Ensuite, pour pré-remplir les diapositives ajouter un millilitre de milieu complété HEPES complet à un réservoir d’une glissière de canal enduit de fibronectine, et incliner la glissière pour permettre au milieu d’être aspiré à partir du réservoir en aval.
Pour éliminer les bulles d’air indésirables, ajoutez un à deux millilitres de milieu frais à l’un des deux réservoirs et appliquez bien un bouchon de réservoir. Appliquez ensuite une pression rythmique du pouce sur le capuchon pour pomper tout air hors de la glissière, en inclinant la glissière au besoin. Lorsque tout l’air a été expulsé, inclinez la glissière vers le milieu non plafonné contenant le réservoir et retirez le bouchon pour éviter que l’air ne soit aspiré dans le chenal.
Maintenant pipette la solution cellulaire à quelques reprises pour réduire l’agglutination, et ajouter 100 microlitres des cellules dans un canal de la diapositive pour une incubation de deux heures dans une chambre humide à 37 degrés Celsius en l’absence de dioxyde de carbone. À la fin de l’incubation remplacer le HEPES contenant milieu dans chaque diapositive avec bicarbonate complet complété milieu comme vient de le démontrer. Placez ensuite les cellules dans un incubateur humide de 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pour leur culture nocturne.
Le lendemain matin, transférez un millilitre de sang de donneur sain fraîchement obtenu dans un tube de microcentrifugeuse de polypropylène rond de deux millilitres. Puis centrifuger l’échantillon. Retirer le plasma et le pelage bouffi contenant du supernatant.
Et transférez soigneusement 100 microlitres des globules rouges sédimentés dans un tube de mircocentrifugeuse de deux millilitres contenant 100 microlitres de milieu complété complet de HEPES. Étiquetez le tube 1:1 et transférez quatre microlitres des globules rouges dilués dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de deux millilitres contenant deux millilitres de milieu complété par HEPES complet. Ensuite, étiquetez ce tube 4:2000 et placez les deux tubes dilués d’échantillon de globule rouge sur la glace.
Pour étiqueter les macrophages péritonéaux remplacer le milieu bicarbonate dans chaque diapositive de canal avec des médiums complets complétés par HEPES. Inclinez ensuite la glissière pour permettre l’ajout de 100 microlitres de l’anticorps spécifique macrophage de souris marqué fluorescentement à l’ouverture du canal de 100 microlitres de la diapositive. Aspirer le milieu qui se jette dans le réservoir en aval, et incuber les cellules pendant 20 minutes dans une chambre humide à 37 degrés Celsius en l’absence de dioxyde de carbone.
Alors que les cellules péritonéales sont étiquetées mélanger doucement 4:2000 globules rouges échantillon et transférer 400 microlitres des cellules dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de deux millilitres, dans un bloc d’aluminium chauffé à l’intérieur d’un capot d’écoulement laminaire pendant environ cinq à huit minutes. Lorsque les cellules se sont réchauffées à 37 degrés Celsius, mélanger 0,4 microlitres d’une tache appropriée de membrane plasmatique fluorescente rouge avec les cellules. Ensuite, placez les cellules dans le bloc thermique.
Après cinq minutes laver les cellules en ajoutant 1,6 millilitres de HEPES frais complété moyen complet et centrifugeuse. Faites pivoter le tube pour identifier la pastille des globules rouges. À l’aide d’une pointe de pipette de 1 à 1,5 millilitre, retirez soigneusement le supernatant en deux volumes sans déranger la pastille et mélangez 2000 microlitres de milieu complet frais complété par hepes avec les cellules.
Centrifugeuse et re-suspendre la pastille dans 400 microlitres de milieu. Étiquetez ensuite le tube PMS pour la tache de membrane plasmatique. À la fin de l’incubation d’étiquetage péritonéal de cellules de 20 minutes lavez la glissière avec un millilitre de milieu complété hepes complet frais.
Pour opsoniser les globules rouges ajouter un microlitre de souris IGG2B anticorps anti-humain CD235A au tube d’échantillon PMS. Après huit minutes à 37 degrés Celsius avec le mélange une fois par minute de transfert 100 microlitres de la membrane plasmatique tachée IGG opsonized globules rouges humains au macrophage péritonéal contenant la glissière de canal. Dès que les globules rouges humains ont été ajoutés monter la diapositive sur un microscope confocal disque filature.
Avec l’incubateur de scène fixé à 37 degrés Celsius et commencer immédiatement l’imagerie des cellules. Time lapse 3D-imaging of green fluorescent macrophages presented with red fluorescent human red blood cells enables the visualization of single particle phagocytic events. Par exemple, la capture d’une souris IGG opsonized globule rouge humain par un filopodium macrophage peut être observée.
En plus, la compression d’un globule rouge humain pendant la formation de tasse phagocytique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les macrophages péritonéaux résidents de la souris, les cellules étiquetées fluorescentes et les particules opsonisées.
