Cette méthode de co-culture aidera à répondre aux questions clés entourant les mécanismes de contact cellulaire à l’origine de la régulation mésenchymateuse des cellules souches de la phagocytose des macrophages, et donc à éclairer le rôle du CSM dans la régulation de l’immunité innée. Cette technique peut être appliquée dans les analyses à haut débit. Les bioparticules conjuguées à des colorants sensibles au pH ne fluorescent que dans les environnements phagolysosomes acides.
Par conséquent, le lavage et la trempe sont nécessaires. Cette méthode peut également être appliquée à une variété de modèles de co-culture qui incluent des neutrophiles et d’autres phagocytes. La démonstration de la procédure sera Faite par Ethan Chetkof, un étudiant de premier cycle actuellement dans mon laboratoire.
Pour commencer, observez la confluence des cellules souches mésenchymateuses cultivées. Lorsque 70 à 80% de confluence est atteinte, aspirez le milieu de croissance des cellules cultivées dans un plat de 100 millimètres et ajoutez cinq millilitres de PBS. Après avoir aspiré le PBS, ajouter deux millilitres de solution d’EDTA à 0,05% de trypsine et incuber les cellules pendant trois minutes.
Après trois minutes, vérifiez le détachement de la cellule à l’aide d’un microscope inversé. Et si les cellules ne sont pas détachées, incuber à nouveau pendant une à deux minutes. Une fois que toutes les cellules sont détachées, ajoutez cinq millilitres de milieu de croissance frais à l’assiette.
Après avoir rincé la plaque à l’aide du mélange de milieu de trypsine, utilisez une pipette sérologique stérile pour recueillir les cellules dans un tube conique propre et stérile de 50 millilitres. Ensuite, adzé les cellules par centrifugation. Après avoir aspiré le surnageant, remettez ensemence la pastille cellulaire dans 10 millilitres de milieu de croissance frais en pipetant doucement de haut en bas.
Pour le comptage cellulaire, ajouter 10 microlitres de suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre contenant 30 microlitres de solution de trypan blue à 0,4%, puis ajouter 10 microlitres du mélange sous le couvercle d’une chambre de comptage hémocytomètre. Sous le microscope inversé ou Brightfield, comptez les cellules viables non colorées à l’aide d’une lentille d’objectif 10X et de quatre chambres d’un millimètre carré et calculez le nombre de cellules comme décrit dans le manuscrit textuel. Utilisez l’équation C1V1 égale à C2V2 pour déterminer le volume souhaité du milieu frais et de la suspension cellulaire nécessaire pour préparer la suspension cellulaire à une concentration finale d’une fois 10 à la cinquième cellule par millilitre.
Utilisez un micropipetter multicanal pour ajouter 100 microlitres de la suspension cellulaire dans les puits d’une plaque de 96 puits selon la conception de la plaque. Utilisez une micropipette pour ajouter 530 microlitres de la suspension de la cellule à chacune des lames de la chambre selon la conception de la plaque et incuber pendant la nuit. Préparer 10 millilitres de milieu d’activation contenant de l’interféron gamma à une concentration de 250 nanogrammes par millilitre pour activer les cellules macrophages dans une boîte de 100 millimètres.
Aspirer le milieu de croissance des cultures cellulaires de macrophages et rincer les cellules avec cinq millilitres du milieu d’activation dépourvu d’interféron gamma. Après avoir aspiré le milieu de rinçage dans la boîte expérimentale, ajouter 10 millilitres de milieu d’activation complété par de l’interféron gamma. Et dans la parabole témoin, ajoutez 10 millilitres de milieu d’activation sans interféron gamma, puis incubez les cellules pendant 16 à 24 heures.
À la fin de l’incubation, pour préparer les co-cultures, retirez le milieu d’activation des cellules macrophages et ajoutez cinq millilitres de milieu de croissance frais. Utilisez un élévateur de cellules pour gratter doucement les cellules et recueillir les cellules dans un tube conique de 50 millilitres. Ensuite, comptez les cellules à l’aide de l’exclusion de Trypan Blue et de l’hémocytométrie, suivie de la préparation de suspensions de cellules macrophages témoins et traitées à la concentration de deux fois 10 à la cinquième cellule par millilitre, comme démontré précédemment pour les cellules souches mésenchymateuses.
Aspirer doucement le milieu des puits expérimentaux contenant des cellules souches mésenchymateuses. Utilisez une micropipette multicanal pour ajouter 100 microlitres des suspensions de cellules de macrophages traitées et de contrôle dans les puits expérimentaux appropriés selon la conception de la plaque et incuber pendant la nuit comme démontré. Aspirer doucement le milieu de la lame de chambre à quatre parois contenant des cellules souches mésenchymateuses.
Utilisez une micropipette pour ajouter 530 microlitres de la suspension de la cellule de macrophage aux puits appropriés selon la conception et incuber pendant la nuit. Ajouter un millilitre de milieu d’imagerie de cellules vivantes au flacon contenant un milligramme de particules de Zymosan et recueillir le mélange de particules moyennes dans un tube de culture en verre. Après avoir rincé le flacon avec un millilitre supplémentaire de solution d’imagerie, transférez le milieu d’imagerie rincé dans le tube en verre, puis ajoutez trois millilitres de solution d’imagerie supplémentaire pour obtenir 0,2 milligramme par millilitre de suspension de particules de Zymosan.
Vortex la suspension Zymosan en utilisant des impulsions rapides pendant 30 à 60 secondes, puis utilisez un sonificateur à sonde pour soniquer la suspension avec 60 impulsions rapides. Après avoir aspiré le milieu, rincer les puits expérimentaux et les puits vierges de réactif avec 100 microlitres de solution d’imagerie de cellules vivantes. Ensuite, aspirez la solution d’imagerie de cellules vivantes des puits et ajoutez 100 microlitres de la suspension de Zymosan.
Ouvrez le plateau du lecteur fluorescent à l’aide de l’interface du pavé tactile. Placez la plaque sans couvercle dans le plateau avec le puits A1 dans le coin supérieur gauche. Fermez le plateau à l’aide du pavé tactile et cliquez sur le bouton de lecture vert dans le menu supérieur.
Pour effectuer le test de phagocytose, après avoir rincé le premier puits expérimental avec 750 microlitres du milieu imageur, ajoutez 400 microlitres de la suspension de Zymosan en laissant les puits restants dans le milieu de croissance. Ensuite, placez la diapositive sur la scène incubée du système d’imagerie. Utilisez le logiciel d’imagerie.
Sélectionnez l’option Brightfield sous l’onglet Localiser, puis cliquez sur l’icône de l’oculaire. Avec l’objectif 10X en place, utilisez l’oculaire et le bouton de mise au point pour vous concentrer sur les cellules. Sélectionnez l’onglet Acquisition.
Ouvrez le menu déroulant de l’expérience et sélectionnez un ensemble de longueurs d’onde comprenant un ensemble de filtres EGFP pour accueillir une excitation de 509 nanomètres et des longueurs d’onde d’émission de 533 nanomètres du colorant sensible au pH. Lorsqu’il reste environ deux minutes sur la minuterie, cliquez sur l’icône 20X dans le menu de l’objectif pour changer l’objectif en 20X, puis cliquez sur le menu des canaux, sélectionnez les filtres EGFP et, dans le menu d’exposition, réglez le temps d’exposition à 400 millisecondes pour détecter le fluorophore vert sensible au pH, puis cliquez sur en direct. Après avoir réglé la mise au point, cliquez sur arrêter pour éteindre la lumière et cochez la case à côté du réglage expérimental time-lapse supérieur.
Dans le menu stratégie de mise au point, sélectionnez la mise au point automatique du logiciel et, dans le menu déroulant, sélectionnez les paramètres intelligents et principaux pour réduire le temps d’exposition à la lumière pendant l’exécution de la mise au point automatique. Dans le menu time-lapse, définissez le nombre d’acquisitions souhaité sur 30 à 60, le temps d’intervalle sur une minute, puis cliquez sur le bouton Démarrer l’expérience pour commencer l’acquisition. L’effet de l’interféron gamma sur la co-culture a été étudié.
Les résultats représentatifs démontrent que la co-culture de macrophages avec des cellules souches mésenchymateuses améliore l’activité phagocytaire du macrophage. Le traitement à l’interféron gamma réduit l’activité du macrophage. Cependant, en présence de cellules souches mésenchymateuses, l’activité phagocytaire des macrophages a été partiellement sauvée.
Les densités cellulaires optimales sont essentielles dans ces études. Et lorsque les cellules macrophages ont été plaquées à une densité trop faible, les changements d’intensité de fluorescence n’ont pas été détectés. Lorsque les cellules macrophages étaient plaquées à une densité élevée, l’intensité de fluorescence était élevée rapidement dans tous les groupes et les différences n’étaient pas discernées.
L’une des choses les plus importantes au cours de cette procédure est de s’assurer que les densités cellulaires sont optimisées et maintenues cohérentes entre les expériences.
