Ce test d’imagerie in vitro permet de quantifier l’effet de différents traitements cellulaires ou de différents génotypes sur la phagocytose microgliale. En utilisant deux types de cellules pertinentes pour les maladies neurodégénératives, nous utilisons des cellules de neuroblastome mortes pour la cargaison phagocytaire, qui sont préparées d’une manière qui peut être facilement et à moindre coût mise à l’échelle par de grands écrans d’imagerie à haut contenu. Dans une armoire de sécurité biologique de classe 2, dissocier les SH-SY5Y en aspirant le milieu.
Ajouter 4 ml de tampon de dissociation cellulaire et retirer immédiatement le tampon afin qu’il reste moins de 1 ml sous forme de film mince recouvrant les cellules. Incuber pendant 2 à 3 minutes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Puis à 10 ml de HBSS dans la fiole T-75.
Et pipettez les SH-SY5Ys dans un tube de centrifugeuse conique de 15 ml. Centrifuger à 400xG pendant 5 minutes. Aspirer le surnageant et re-suspendre les cellules dans 2 ml de milieu tamponné HEPES sans phénol rouge, en veillant à briser les amas avant la fixation.
Fixez les cellules en ajoutant 2 ml de formaldéhyde de puissance 4% au tube et en incubant pendant 10 minutes à température ambiante avec une agitation douce occasionnelle. Ajouter 10 ml de HBSS dans le tube. Ensuite, centrifugez à 1200xG pendant 7 minutes.
Aspirer le surnageant et suspendre à nouveau la pastille cellulaire dans 2 ml de milieu tamponné HEPES sans rouge de phénol. Compter et retirer 1 million de cellules HS-SY5Y dans un tube de 2 ml à faible teneur en protéines. Porter le volume total à 300 à 500 microlitres avec des milieux tamponnés HEPES sans phénol rouge.
Ensuite, réchauffez brièvement le tube dans un bain-marie de 37 degrés Celsius. Reconstituer l’ester STP du colorant fluorescent rouge sensible au pH conformément aux instructions du fabricant. Ajoutez ensuite 12,5 microgrammes de colorant par million de cellules SH-SY5Y.
Mélanger doucement en agitant le tube. Et incuber le tube à température ambiante pendant 30 minutes, à l’abri de la lumière. Ajouter 1 ml de HBSS et centrifuger à 1200xG pendant 7 minutes et 4 degrés Celsius.
Jetez le surnageant. Et laver avec 2 ml de HBSS. Ressuscez la pastille cellulaire dans un milieu de macrophages sans phénol à une concentration de 0,2 à 1,2 million de cellules par ml, de sorte que 50 microlitres contiennent 10 000 à 60 000 cellules.
Dans une armoire de sécurité biologique, préparer une solution de colorant réactif succinimidyl ester-réactif aux cellules fluorescentes rouge foncé dans des milieux macrophages. Ajouter Hoechst 33342 et réchauffer la solution de travail à 37 degrés Celsius au bain-marie. Aspirer doucement le milieu macrophage iPSC en pipetant le surnageant de la cellule avec une pipette multicanal dans un réservoir stérile.
Ajouter 70 microlitres par puits de la solution de colorant aux macrophages iPSC à l’aide d’une pipette multicanal. Incuber pendant 1 heure à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Réparer les traitements expérimentaux dans des milieux macrophages sans phénol rouge.
Après l’incubation, aspirer très doucement le milieu macrophage iPSC avec une pipette multicanal et ajouter 100 microlitres de HBSS par puits. Retirez immédiatement hbSS par pipetage doux. Ajoutez ensuite 100 microlitres de milieux de macrophages sans phénol rouge, ainsi que des traitements expérimentaux dans des puits séparés.
Incuber pendant 10 minutes à 1 heure à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Utilisez une pipette multicanal pour ajouter 50 microlitres des SH-SY5Y étiquetés par puits sur les côtés de chaque puits au bord du liquide. Ensuite, incubez à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 3 à 5 heures.
Après l’incubation de la phagocytose, aspirer doucement les surnageants cellulaires en pipetant avec une pipette multicanal et les jeter. Laver une fois avec 100 microlitres de PBS. Ensuite, fixez les cellules en ajoutant 100 microlitres de formaldéhyde à 2% de puissance et en incubant pendant 15 minutes à température ambiante.
Aspirez les puits et ajoutez 100 microlitres de PBS. Passez directement à l’imagerie avec le microscope à haut contenu, ou couvrez avec un scellant à plaque et une feuille, et stockez la plaque à 4 degrés Celsius, jusqu’à ce que cela soit nécessaire. Allumez le microscope d’imagerie à haut contenu et ouvrez le logiciel de capture d’image.
Chargez la plaque d’essai dans le microscope en cliquant sur l’icône LOAD en haut de l’écran. Sélectionnez l’onglet SETUP ». Dans les menus déroulants en haut à gauche, sélectionnez le type de plaque approprié.
L’option autofocus: deux pics"L’objectif: 40x Eau, NA 1.1 « Mode confocal » et Binning de 1. Rincez l’objectif Eau 40x avant utilisation via le menu des paramètres. Dans la zone de sélection des canaux, utilisez l’icône plus pour ajouter les canaux DAPI, Alexa 647 et Alexa 568.
Réglez-les pour qu’ils mesurent à un seul plan d’un micromètre. Optimisez les réglages de temps et de puissance pour l’efficacité de coloration de la plaque d’essai. Assurez-vous que les canaux ne sont pas mesurés simultanément, en cliquant sur la séquence de canaux pour séparer les canaux.
Sous Navigation et définition de la disposition, sélectionnez les puits de mesure et sélectionnez 9 à 12 champs par puits. Pendant la configuration, cliquez sur un champ représentatif sur la carte des plaques. Et vérifiez chaque canal de mesure à tour de rôle pour vous assurer que la coloration est présente et que les images sont mises au point en ajustant le décalage du canal.
Pour télécharger les données sur un serveur pour une analyse à distance, cliquez sur la case des tâches en ligne et sur le nom d’écran correspondant. Enregistrez le protocole de test en cliquant sur le bouton « enregistrer », puis cliquez sur l’onglet Exécuter l’expérience en haut. Nommez la plaque d’expérience, puis cliquez sur démarrer"Un test de phagocytose de temps de vie de cellule vivante a montré qu’avec 10 000 SH-SY5Ys par puits, le nombre de particules de phagocytose par cellule augmentait linéairement avec le temps et était inhibé d’environ 50% par la cytochalasine D.Avec des quantités plus élevées de SH-SY5Y par puits, la phagocytose présentait une faible linéarité, probablement en raison d’une mauvaise segmentation de l’iPSC, macrophages et SH-SY5Y dans un champ de vision plus encombré.
Les résultats suivants ont été obtenus en effectuant une imagerie à haute teneur en cellules fixes, y compris cette image représentative de la phagocytose. L’augmentation de la quantité de SH-SY5Y a entraîné un nombre plus élevé de particules phagocytosées par cellule. Le test de phagocytose a été validé à l’aide de plusieurs inhibiteurs de la phagocytose.
La cytochalasine D et le jasplakinolide ont inhibé de manière significative la phagocytose de 91 et 90% respectivement. Et la bafilomycine A1 a significativement réduit la phagocytose de 31% lorsqu’elle est pré-incubée pendant 1 heure avant la phagocytose. L’ajout d’annexine 5 recombinante a considérablement réduit la phagocytose de 30 % lorsqu’elle est ajoutée aux puits immédiatement avant l’ajout de SH-SY5Y.
Il est confirmé que nous avons corrigé les SH-SY5Ys pour exposer la phosphatidylsérine à l’aide d’une sonde fluorescente Annexin 5. Alors que les SH-SY5Y vivants étaient négatifs pour la coloration annexine 5. Plusieurs longueurs de durée de phagocytose, de 1 à 5 heures, ont été testées en utilisant l’ajout échelonné de cargaison phagocytaire.
La longueur totale de ce protocall peut être raccourcie en préparant la cargaison phagocytaire et en colorant les macrophages iPSC en parallèle. Si vous voulez le faire, travaillez à l’avance sur les horaires et utilisez vos incubations pour préparer des solutions pour les étapes futures.
