Ce travail est financé par RJ Reynolds Tobacco Company (de RJRT) en vertu d&#39;un accord de collaboration de recherche avec l&#39;École de médecine Wake Forest University. GL Prasad est un employé à temps plein de la RJRT.

NOTE: le consentement éclairé de faire cette étude a été obtenue à une unité clinique locale de recherche sous approbation de l&#39;IRB, par les bonnes pratiques cliniques. Traitement du sang, l&#39;isolement des PBMC et d&#39;autres expériences de culture cellulaire sont effectuées dans des conditions stériles, l&#39;utilisation de consommables et réactifs microbiologiquement stérile. 1. Préparation WS-CM <ol><li> Générer WS-CM comme décrit précédemment 12. <ol><li> Préparer WS-CM en passant la fumée de quatre 3R4F cigarettes de référence grâce à Roswell Park Institute Memorial (RPMI) 1640 milieu sans rouge de phénol, avec un schéma de fumer suivante: 35-60-2, volume de bouffée en ml, intervalle entre chaque bouffée en sec, et la durée feuilletée en sec, respectivement. Chaque préparation génère un échantillon de 20 ml. </li></ol></li><li> tube (s) de l&#39;étiquette avec la date, l&#39;heure d&#39;achèvement, et le nom et le numéro de cigarette. Conserver les 500 ul aliquotes à -80 ° C immédiatement après le tabagisme est terminée. </li><li> Analyser aliquotes de WS congelés-CM Pour déterminer les niveaux de nicotine, les nitrosamines spécifiques du tabac, et les hydrocarbures aromatiques polycycliques comme décrit précédemment 12. </li></ol> 2. Isolement de PBMC <ol><li> Prélever le sang frais provenant de donneurs sains (qui sont des non-consommateurs de produits du tabac) Isoler PBMC de sang frais comme décrit ci-dessous sous une approbation distincte du Wake Forest Baptist Health CISR 15. <ol><li> Avant l&#39;arrivée de la poche de sang, une bouteille de 500 ml, des ciseaux, un tampon d&#39;isolement et tamponnée au phosphate salin de Dulbecco (DPBS) (RT) prêt à un niveau de biosécurité 2 (BSL-2) culture de cellules capot. tampon d&#39;isolement doit être protégé de la lumière. </li><li> Tenir le sac de sang à l&#39;envers et couper le tube juste au-dessous où il a été serré laissant au moins 3 cm de tube. </li><li> Retirez le bouchon de la bouteille de 500 ml et de maintenir le tube dessus de l&#39;ouverture de la bouteille. Ramassez le sac de sang et l&#39;inverser pour permettre au sang de circuler librement dans le sac dans til bouteille jusqu&#39;à ce que le sac est vide. Laisser le sang de circuler sur le mur intérieur de la bouteille vers le bas par rapport à éviter la formation de bulles. </li><li> Verser le tampon d&#39;isolement dans la bouteille à un rapport de 1: 5 de tampon d&#39;isolement de sang. Boucher le flacon et inverser doucement, fin-over-end, 10 fois. Laisser le flacon dans la hotte de culture de cellules à incuber avec des lumières, pour une heure à température ambiante. </li><li> Une couche de lumière, couleur paille va construire au-dessus du sang. Enlever cette couche à l&#39;aide d&#39;un 25 ml pipette sérologique dans 50 ml tubes coniques. Le montant perçu peut varier de 50 à 300 ml, en fonction du sujet qui a fait don de sang. </li><li> Centrifuger les tubes à 200 xg pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Aspirer le surnageant translucide, laissant le sang-pastille de couleur sombre. Le culot sera en vrac, mais visqueux. </li><li> Pipette 3 ml de tampon d&#39;isolement dans 15 ml tubes coniques. </li><li> Pour remettre en suspension le culot, ajouter 20 ml de DPBS pour tous les 50 ml de liquide de couleur paille recueillies dans sTep 2.1.5. Vortex pour bien mélanger, et de consolider le liquide remis en suspension à partir de tubes multiples. Ce liquide contient en suspension des cellules sanguines. </li><li> Avec une pipette de transfert, le transfert de 5 ml de globules en suspension sur 3 ml de tampon d&#39;isolement dans l&#39;étape 2.1.8. Incliner le tube conique de 15 ml contenant la suspension de cellules doucement et lentement pour créer deux couches séparées. Centrifuger les tubes à 400 xg pendant 40 min à température ambiante avec une accélération minimale et sans frein. </li><li> Utilisez une pipette de transfert pour enlever la couche résultant trouble du milieu (buffy coat) contenant PBMC dans un tube conique de 50 ml. Éviter de tirer d&#39;autres couches claires en dessous. Transfert pas plus de 25 ml dans chaque 50 ml tube conique. </li><li> Ajouter 25 ml de tampon froide (ou plus pour remplir la totalité du volume restant de la 50 ml tube conique) pour laver les cellules. Centrifuger les cellules à 400 xg pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Reprendre le culot avec 10 ml de tampon en cours d&#39;exécution. Celui-ci contient des PBMC. Compter les cellules et utiliser immédiatement ou placer sur la glace pour la congélation. </li></ol></li></ol> 3. congélation et la décongélation de la CMSP <ol><li> Centrifugeuse les PBMC qui ont été recueillies à l&#39;étape 2.1.13 pendant 10 min à 400 x g. </li><li> Remplir le récipient de congélation avec de l&#39;alcool isopropylique selon les instructions du fabricant. ATTENTION: L&#39;alcool isopropylique est inflammable et très toxique. </li><li> Remettre en suspension le culot avec du milieu RPMI 1640 (4 ° C) contenant 20% de sérum bovin fœtal (FBS) et 10% de sulfoxyde de diméthyle (DMSO). Ce est un milieu RPMI 1640 de congélation. Reprendre le culot avec une quantité de milieu de congélation qui se traduira par une suspension ayant environ 5 x 10 7 cellules / ml. Le nombre de cellules disponibles pour la congélation peut varier. </li><li> Distribuer des aliquotes de 1 ml de suspension de cellules dans des cryotubes de 2 ml et placer les cryotubes dans le récipient de congélation. Placer le récipient de congélation avec cryotubes dans un congélateur à -80 ° C pour stocker O / N puis retirez les cryotubes et transfert à stocker dans unCongélateur cryogénique entre -150 ° C à -190 ° C. </li><li> Retirer le cryotube de stockage cryogénique et décongeler rapidement sous agitation douce dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. </li><li> Transférer immédiatement les PBMC décongelées dans le cryotube dans un tube conique de 15 ml avec 10 ml du milieu RPMI 1640 complet (4 ° C) contenant 10% de FBS, 1% de Pen / Strep et 1% de L-glutamine. Le contenu du cryotube décongelés doivent être transférés dès que possible pour obtenir la viabilité cellulaire maximale 15. </li><li> Centrifuger les PBMC à 400 xg pendant 10 min. </li><li> Reprendre le culot avec 5 ml du milieu RPMI 1640 complet et compter les cellules. </li><li> Mesurer la viabilité des cellules par des méthodes établies, telles que la méthode d&#39;exclusion au bleu trypan. Généralement, la viabilité des cellules avec cette méthode est d&#39;environ 90 - 95%. Les PBMC sont maintenant prêts à utiliser dans des expériences. </li></ol> Mort cellulaire 4. Détermination NOTE: Les dilutions énumérées ici sont pour le but de cette study. Les dilutions peuvent être modifiés en conséquence. <ol><li> Diluer WS-CM nicotine ou dans une plaque à 96 puits en utilisant un milieu RPMI complet à un volume total de 100 ul / puits, comme indiqué ci-dessous. </li><li> Diluer WS-CM aux concentrations suivantes: 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, et 5 pg / ml d&#39;unités d&#39;équi-nicotine (sur la base de la teneur en nicotine dans WS-CM) 12. </li><li> Diluer nicotine dans du milieu RPMI aux concentrations suivantes: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000, et 3000 pg / ml. ATTENTION: La nicotine est extrêmement toxique et dangereux pour l&#39;environnement. </li><li> Ajouter 100 ul de cellules PBMC en suspension dans un milieu RPMI complet à chaque puits à une concentration de 1 x 10 6 cellules / puits. Le volume total des cellules plus WS-CM ou de la nicotine sera 200 pl / puits. </li><li> Aux fins de cette étude, préparer deux jeux de plaques comme ci-dessus. Couvrir les plaques et incuber une plaque pendant 24 heures et une plaque pendant 3 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. Ajuster les points de temps que nécessaire. </li&gt; <li> Laver les cellules à la température ambiante par centrifugation à 300 g pendant 3 min, l&#39;aspiration du surnageant, vortexer le fond de la plaque à plaque recouverte et finalement remise en suspension les cellules avec 200 ul de tampon de migration du froid de la glace, et répéter l&#39;étape de lavage une fois de plus. </li><li> Ajouter 95 ul de tampon suivie par 5 ul de 7-aminoactinomycine D (7AAD) à chaque puits pour un volume total de 100 ul / puits en cours d&#39;exécution. Incuber la plaque à l&#39;obscurité à température ambiante pendant 15 min. </li><li> Ajouter 100 pi de tampon pour courir tubes de munitions. Transférer tout le volume de suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque à tubes de munitions et d&#39;acquérir les échantillons sur cytomètre de flux. </li><li> Déterminer le pourcentage de cellules 7AAD positif en utilisant la cytométrie de flux logiciel d&#39;analyse. </li></ol> 5. CE 50 Détermination <ol><li> Les valeurs de CE 50 de WS-CM et la nicotine sont déterminées par 7AAD-coloration positive des PBMC. </li><li> La valeur EC 50 est définie comme la concntration à laquelle 50% des cellules ne était plus viable dans un dosage de 24 heures, et les valeurs sont exprimées en pg d&#39;équi-nicotine unités / ml. </li><li> Pour les fins de cette étude, les valeurs CE 50 ont été jugées 1,56 pg / ml et 1 650 pg / ml pour WS-CM et la nicotine, respectivement. </li></ol> 6. cytokines sécrétées NOTE: Les dilutions énumérées ici sont pour le but de cette étude. Les dilutions peuvent être ajustés en conséquence. <ol><li> Diluer WS-CM dans une plaque à 96 puits en utilisant un milieu RPMI complet à un volume total de 100 ul / puits à la concentration de 0,3, 1,56, 3 et 5 ug / ml d&#39;unités d&#39;équi-nicotine. </li><li> Diluer nicotine pour les concentrations suivantes: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000, et 3000 pg / ml. ATTENTION: La nicotine est extrêmement toxique et dangereux pour l&#39;environnement. </li><li> Ajouter 100 ul de cellules PBMC en suspension dans un milieu RPMI complet à chaque puits à une concentration de 1 x 10 6 cellules / puits.Le volume total des cellules plus WS-CM ou de la nicotine sera 200 pl / puits. </li><li> Couvrir la plaque et incuber pendant 3 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Laver les cellules par centrifugation à la température ambiante à 300 x g pendant 3 min, aspiration du surnageant, le vortex inférieure de la plaque à plaque recouverte et finalement les cellules en suspension avec 200 ul de la glace froide courante tampon et répéter l&#39;étape de lavage une fois de plus. </li><li> Ajouter 200 ul de milieu RPMI complet, et répéter l&#39;étape de lavage une fois de plus. </li><li> Ajouter 200 ul de 10 ug / ml de LPS milieu à chaque puits. </li><li> Couvrir la plaque et incuber pendant 4 h, 24 h, 48 h, 72 h ou à 37 ° C et 5% de CO 2. Régler des temps d&#39;incubation nécessaire. </li><li> Centrifuger la plaque à 300 g pendant 3 min. </li><li> Prenez 175 pi de surnageant de chaque puits et de stocker dans un congélateur à -80 ° C pour effectuer les tests dans les étapes 7 et 8. </li></ol> 7. cytométrie Bead Assay tableau &lt;ol&gt; <li> Décongeler les surnageants cellulaires préparés à partir de l&#39;étape 6.10 et l&#39;utilisation dans le dosage de l&#39;ABC. Effectuez le test réseau de billes cytométrique (ABC) selon les instructions du fabricant. </li></ol> 8. ELISA IL-8 <ol><li> Décongeler les surnageants de cellules de l&#39;étape 6.10 et l&#39;utilisation dans l&#39;IL-8 ELISA. Effectuer le test ELISA selon les instructions du fabricant. </li></ol> 9. intracellulaire coloration et cytométrie de flux NOTE: Les dilutions énumérées ici sont pour le but de cette étude. Les dilutions peuvent être ajustés en conséquence. <ol><li> Diluer WS-CM dans une plaque à 96 puits en utilisant un milieu RPMI complet à un volume total de 100 ul / puits à la concentration de 0,3, 1,56, 3 et 5 ug / ml d&#39;unités d&#39;équi-nicotine. </li><li> De la même plaque, diluer la nicotine aux concentrations suivantes: 2, 10, 50, 100, 500, 2000, et 4000 pg / ml. ATTENTION: La nicotine est extrêmement toxique et Hazar environnementdous. </li><li> Ajouter 100 ul de cellules PBMC en suspension dans un milieu RPMI complet à une concentration de 1 × 10 6 cellules / puits. Le volume total des cellules plus WS-CM ou de la nicotine sera 200 pl / puits. </li><li> Couvrir la plaque et incuber pendant 3 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Laver les cellules à la température ambiante par centrifugation à 300 x g pendant 3 min, l&#39;aspiration du surnageant, vortexer le fond de la plaque à plaque recouverte et finalement remise en suspension les cellules avec 200 ul de tampon de migration du froid de la glace, et répéter l&#39;étape de lavage une fois de plus. </li><li> Ajouter 200 pi de milieu RPMI complet à la plaque, et répéter l&#39;étape de lavage une fois de plus. </li><li> Préparer les concentrations de travail de 2 ul / ml GolgiPlug et 10 ug / ml de LPS en utilisant un milieu RPMI complet et ajouter 200 ul dans chaque puits. </li><li> Incuber la plaque pendant 6 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> A la fin de l&#39;étape 9.8, laver les cellules avec un tampon en cours d&#39;exécution (4 ° C) et tournant à 300g pendant 3 min à 4 ° C. </li><li> Ajouter 100 ul de Cytofix à chaque puits et incuber pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Laver les cellules trois fois comme décrit dans l&#39;étape 9.9 avec 1x Permwash (4 ° C) à 300 g pendant 3 min à 4 ° C. </li><li> Ajouter 45 ul de 1 x Cytoperm à chaque puits suivi par 5 ul de chacun de l&#39;un des anticorps suivants dans chaque puits: TNF-α-Alexa Fluor 488, l&#39;IFN-γ V500, MIP-1α PE. Incuber à 4 ° C pendant 30 min. </li><li> Laver les cellules deux fois comme décrit à l&#39;étape 9.9 avec 1x Permwash (4 ° C) et une fois avec du tampon (4 ° C) fonctionnant à 300 x g pendant 3 min à 4 ° C. </li><li> Remettre en suspension les cellules avec 200 pi de paraformaldehyde à 2% (4 ° C). Transférer les cellules dans 12 × 75 mm tubes, et analyser les échantillons sur cytomètre de flux. ATTENTION: Paraformaldéhyde est corrosive, très toxique et dangereux pour la santé. </li></ol> 10. K562 Assay Tuer REMARQUE: les cellules K562 doivent être cultivéesen culture à 37 ° C et 5% de CO 2 avec un milieu RPMI complet jusqu&#39;à ce qu&#39;elles atteignent 80% de confluence avant l&#39;essai. <ol><li> Préparer une solution 5 mM carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE) du stock en ajoutant 18 pi de DMSO dans le flacon. </li><li> Diluer WS-CM nicotine ou dans une plaque à 96 puits en utilisant un milieu RPMI complet à un volume total de 100 ul / puits pour atteindre les unités d&#39;équi-nicotine ou les concentrations souhaitées de nicotine pour chaque puits. ATTENTION: La nicotine est extrêmement toxique et dangereux pour l&#39;environnement. </li><li> Ajouter 100 ul de PBMC dans un milieu RPMI complet à une concentration de 1,5 x 10 6 cellules / puits. Le volume total des cellules avec ou WS-CM nicotine sera de 200 pl / puits. </li><li> Couvrir la plaque et incuber pendant 3 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Laver les cellules K562 en ajoutant 10 ml de DPBS et centrifuger à 400 g pendant 8 min à température ambiante. </li><li> Remettre en suspension les cellules avec 10 ml de DPBS et compter les cellules K562. </li><li> Préparer CFSE working solution en ajoutant 1 pl de CFSE solution stock à 1 ml DPBS. </li><li> Ajouter 1 ml de la solution de travail CFSE à 1 ml de la suspension de cellules K562 contenant 1 à 2 x 10 7 cellules. Vortexer et incuber pendant exactement 2 minutes à température ambiante. </li><li> Immédiatement ajouter 200 pi de FBS. Vortexer et incuber pendant exactement 2 minutes à température ambiante. </li><li> Ajouter 10 ml de milieu RPMI complet et centrifuger le tube à 400 g pendant 8 min à température ambiante. </li><li> Eliminer le surnageant RPMI et de briser le culot et remettre en suspension les cellules avec 10 ml de milieu RPMI complet et compter les cellules K562 CFSE-étiquetés. </li><li> Laver les PBMC par centrifugation de la plaque à 300 g pendant 3 min à température ambiante. Aspirer le surnageant par décantation le liquide. Replacer le couvercle et Vortex bas de la plaque. Ajouter 200 ul de milieu RPMI complet et répéter l&#39;étape de lavage une fois de plus. </li><li> Ajouter des cellules K562 marquées au CFSE dans un rapport de 1:15 (100,000 K562s: 1,5 x 10 6 CMSP) à chaque puits d&#39;échantillon de la plaque et en outre i PBMCncubate pendant 5 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Laver le mélange de cellules par centrifugation à 300 g pendant 3 min à température ambiante. Aspirer le surnageant en éliminant le liquide. Placer le couvercle et vortexer le bas de la plaque. </li><li> Ajouter 200 ul de tampon de migration et répéter l&#39;étape de lavage décrit dans l&#39;étape 10,14 une fois de plus. </li><li> Ajouter 95 ul de tampon de migration suivi par 5 ul de 7AAD à chaque puits pour un volume total de 100 pl / puits. Incuber la plaque à l&#39;obscurité à température ambiante pendant 15 min. </li><li> Ajouter 100 ul de tampon en cours d&#39;exécution à chaque puits et transférer la totalité du volume de la suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque à tubes de munitions et d&#39;acquérir les échantillons sur cytomètre de flux. </li><li> Déterminer le pourcentage de cellules positives et 7AAD CFSE-positifs en utilisant la cytométrie de flux logiciel d&#39;analyse. </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+leukocyte+subsets+from+fresh+and+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+clinical+research.">Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research.</a> Cryo Letters. 33, 376-384 (2012).</li><li>Schmid, I., Krall, W. J., Uittenbogaart, C. H., Braun, J., Giorgi, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dead+cell+discrimination+with+7-amino-actinomycin+D+in+combination+with+dual+color+immunofluorescence+in+single+laser+flow+cytometry.">Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry.</a> Cytometry. 13, 204-208 (1992).</li><li>Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+multiparametric+flow+cytometry-based+cytotoxicity+assay+simultaneously+immunophenotypes+effector+cells:+comparisons+to+a+4+h+51Cr-release+assay.">A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay.</a> J. Immunol. Methods. 325, 51-66 (2007).</li><li>Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-induced+death+by+apoptosis+in+human+lymphokine-activated+natural+killer+cells.">Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells.</a> Blood. 87, 2411-2418 (1996).</li></ol>

The authors declare that there are no conflicts of interest.

Nous et d&#39;autres avons précédemment démontré que le traitement des PBMC avec PPT inhibe plusieurs réponses, y compris l&#39;expression et la sécrétion de cytokines et les mesures fonctionnelles telles que la cellule cible 14 tuant. Les méthodes expérimentales décrites dans l&#39;ouvrage précédent nécessitent des périodes d&#39;incubation plus longues et ont été modestes en amplitude 14. Étant donné les applications potentielles de cette jolie modèle ex vivo pour la r...

Un ensemble considérable de points de connaissances sur les effets néfastes sur la santé du tabagisme chronique, notamment les maladies cardiovasculaires (MCV), la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) et le cancer 1,2. Chronique tabagisme a été connu pour causer l&#39;inflammation et l&#39;immunosuppression, et ces modifications sont signalés à contribuer à un risque accru d&#39;infection microbienne et le cancer chez les fumeurs 3. In vitro et ex vivo techniques sont utiles pour élucider la base moléculaire des effets physiopathologiques de la fumée de cigarette 4-9 (tableau 1) et sont reconnus comme des outils importants pour guider la réglementation émergent de différents produits du tabac 10,11. Par exemple, nous avons démontré que les préparatifs combustibles de produits du tabac (PPT) comme milieu complet de fumée conditionné (WS-CM) et la matière particulaire totale (TPM) sont beaucoup plus cytotoxique et dommageable pourADN que PPT non combustibles ou de la nicotine 12,13. Conformément à l&#39;ouvrage publié, il a été récemment rapporté que PPT combustibles ou de la nicotine 12,13. Conformément à l&#39;ouvrage publié, nous avons récemment signalé que PPT combustibles causés immunosuppression marquée. Ceci a été démontré par la suppression de Toll Like Receptor (TLR) -ligands, stimulé la sécrétion de cytokines, et la cellule ciblée (K562) tuer par les PBMC dans un modèle ex vivo 14. Étant donné l&#39;importance de l&#39;inflammation dans les processus de la maladie induite fumée cigarettes, poursuite de l&#39;optimisation des conditions d&#39;essai pour évaluer les effets immunomodulateurs de la fumée de cigarette est présenté dans ce rapport. Les essais ex vivo typiquement mesurés et intracellulaire des cytokines ainsi que la fonction cytolytique de cellules NK et T cytotoxiques dans la cellule K562 tuant des dosages 14 sécrétées. Les dosages impliqués pré-incubation avec WS-CM et la nicotine et la stimulation ultérieure de PBMCs avec agonistes de TLR pendant une période de 3 jours; les lectures finales sont effectuées en utilisant des dosages immuno-enzymatiques (ELISA) et / ou la cytométrie de flux. Nous avons utilisé le lipopolysaccharide bactérien (LPS), qui se lie à des récepteurs TLR-4 stimule les PBMC et conduisant à la production de cytokines intracellulaires et la sécrétion de cytokines. En plus de l&#39;optimisation des différentes étapes essai pour l&#39;évaluation des effets immunomodulateurs de PPT, nous avons également présents procédés pour isoler les PBMC, des dosages de mort cellulaire et de l&#39;IL-8 quantification. Ces méthodes peuvent être appliquées pour aborder d&#39;autres questions de recherche et affinés pour évaluer les produits du tabac dans le contexte réglementaire. Tableau 1. Publié rapports de in vitro et ex vivo méthodes utilisées pour étudier les effets physiopathologiques Varilux de préparations de produits du tabac CS, le milieu de la fumée de cigarette. SCC, la fumée de cigarette condensat; CST, cigarette extrait de fumée; ELISA, enzyme dosage immunoenzymatique; GADPH, la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase; qPCR, réaction quantitative en chaîne par polymérase; RT en temps réel réaction en chaîne par polymérase quantitative; TS, la fumée de tabac. <table><tbody><tr><td> Auteur (Année de l&#39;étude) </td><td> Laan et al. (2004) </td><td> Moodie et al. (2004) </td><td> Oltmanns et al. (2005) </td><td> Vayssier (1998) </td><td> Witherden et al. (2004) </td><td> Birrell et al. (2008) </td></tr><tr><td> Les cellules utilisées </td><td> Cellules bronchiques humaines de l&#39;endothélium (BEAS-2B), les neutrophiles humains </td><td> Cellules épithéliales alvéolaires humaines (A549) </td><td> Les cellules musculaires lisses des voies respiratoires humaines (HASMC) </td><td> Cellules U937 prémonocytique humaines, des monocytes humains </td><td> Alvéolaires de type II cellules épithéliales (ATII) </td><td> Monocytaire humainelignée cellulaire (THP-1), les macrophages pulmonaires humaines </td></tr><tr><td> TPP utilisé </td><td> CST </td><td> SCC </td><td> CST </td><td> TS </td><td> CST </td><td> CS </td></tr><tr><td> Méthode utilisée </td><td> ELISA, qPCR, la migration, l&#39;électromobilité changement </td><td> Immuno-chimie, électrophorèse, kit ArrayScan, RT-PCR, ELISA </td><td> ELISA, RT-PCR, PCR quantitative, l&#39;électrophorèse </td><td> Gel-décalage de mobilité </td><td> La microscopie optique, la microscopie électronique, l&#39;électrophorèse, ELISA </td><td> qPCR, ELISA, kit E-TOXATE (Sigma), plaque de p65 dosage (TransAM), électrophorèse, diverses trousses d&#39;immunoessais </td></tr><tr><td> Mesure </td><td> IL-8, GM-CF, AP-1, NF-kB, la migration </td><td> histones acétyltransférases, les histones désacétylases, NF-kB, IL-8, pI-kB α, GADPH </td><td> HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, l&#39;éotaxine </td><td> Heat Shock / protéines de stress (HSP / Hsp70), HF facteur de transcription NF-kB,TNF-α </td><td> Protéine tensioactif (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, le TNF-α, IL-1β, l&#39;IFN-γ </td><td> IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, α-MIP1, GRO-α, MAPK / JNK / phosphorylation de ERK, cJun: liaison à l&#39;ADN, le glutathion, p65: liaison à l&#39;ADN </td></tr><tr><td> Résultat final </td><td> CST régule à la baisse la production de cytokines par la suppression de l&#39;AP-1 activation. </td><td> H 2 O 2 et SCC améliorer acétylation des histones, diminuer l&#39;activité histone déacétylase, différentielle régulent la libération de cytokines pro-inflammatoires. </td><td> La fumée de cigarette peut causer la libération d&#39;IL-8 de HASMC, renforcée par le TNF-α, 20% moins CST IL-8 libération, inhibition de l&#39;éotaxine et RANTES par la fumée de cigarette. </td><td> TS HF activés facteur de transcription qui a été associée à la surexpression de la Hsp70 et l&#39;inhibition de l&#39;activité NFkB et de TNF-α libération de liaison. </td><td> Réduction ATII niveaux de chimiokines dérivées de cellules compromis alveolar réparation, contribuant à la cigarette induit fumée lésions alvéolaires et l&#39;emphysème. </td><td> Données fournissent explication mécaniste pour les infections respiratoires pourquoi les fumeurs ont augmenté. Suppression de la réponse innée se accompagne d&#39;une augmentation de l&#39;IL-8. </td></tr></tbody></table>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="712">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:148px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:223px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">12 X 75 tubes</td>
			<td style="width:148px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">15 ml conical tubes</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">2 mL Microtubes</td>
			<td style="width:148px;">Axygen</td>
			<td style="width:119px;">MCT-150-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">3R4F reference cigarettes&#160;&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Univ. of Kentucky, College of Agriculture</td>
			<td style="width:119px;">3R4F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">500 ml bottle</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">7AAD</td>
			<td style="width:148px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:119px;">559925</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well flat bottom plate</td>
			<td>Termo Nunc</td>
			<td>439454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">96 well round bottom plates</td>
			<td style="width:148px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cell culture hood</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1300 Series A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">58110R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">CFSE</td>
			<td style="width:148px;">Molecular Probes Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cluster tubes</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td>4401</td>
			<td>Harmful if swallowed, carcinogen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cytofix/Cytoperm (Permwash)</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555028</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide )</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DPBS</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">FBS</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">FCAP Array</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">652099</td>
			<td>Software analyzes CBA data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Filter unit</td>
			<td style="width:148px;">Nalgene</td>
			<td style="width:119px;">156-4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Flow Cytometer</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">FACS Canto II</td>
			<td>&#160;8 colors, at Ex 405 and Em785.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Flow Cytometer</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">FACS Calibur</td>
			<td>&#160;4 colors at Ex 495 and Em 785.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Flow cytometry analysis software</td>
			<td style="width:148px;">Tree Star</td>
			<td style="width:119px;">FlowJo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Freezing Container</td>
			<td style="width:148px;">Nalgene</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Contains DMSO,&#160; irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">GogliPlug</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555029</td>
			<td>Carcinogen, Irritant, Corrosive&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:223px;">H2SO4</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Human Inflammatory Cytokine Kit</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">551811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">IFN-&#947; V-500 Antibody</td>
			<td style="width:148px;">BD Horizon</td>
			<td style="width:119px;">561980</td>
			<td>&#160;skin sensitizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">IL-8 ELISA Kit</td>
			<td style="width:148px;">R and D Systems</td>
			<td style="width:119px;">DY208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Isolation Buffer</td>
			<td style="width:148px;">Isolymph, CTL Scientific Corp.</td>
			<td style="width:119px;">1114868</td>
			<td>Flammable liquid, Irritant&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:148px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">LPS</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">MIP1-&#945; PE Antibody</td>
			<td style="width:148px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:119px;">554730</td>
			<td>Acute toxicity, Oral</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Monensin</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M5273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaCl</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotine</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N3876</td>
			<td>Acute toxicity, Environmental hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Parafilm</td>
			<td style="width:148px;">Bemis</td>
			<td style="width:119px;">&#8220;M&#8221;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td>Flammable, Skin irritation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Pen/strep</td>
			<td style="width:148px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:148px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Running buffer</td>
			<td style="width:148px;">MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:119px;">130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Th1/Th2 CBA Kit</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">551809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:223px;">TNF-&#945; Alexa Fluor 488 Antibody</td>
			<td style="width:148px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">502915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Transfer pipette</td>
			<td style="width:148px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tris Base</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to evaluate cytotoxicity and immunosuppression of combustible tobacco product preparations

Parmi les autres modifications physiopathologiques, l&#39;exposition chronique à la fumée de cigarette provoque une inflammation et une suppression immunitaire, qui ont été liés à une sensibilité accrue des fumeurs à des infections microbiennes et l&#39;incidence des tumeurs. Ex vivo suppression des réponses immunitaires médiés par les récepteurs dans les cellules mononucléaires périphériques humaines du sang (PBMC) traité avec constituants de la fumée est une approche intéressante pour étudier les mécanismes et d&#39;évaluer les effets probables à long terme de l&#39;exposition aux produits du tabac. Ici, nous avons optimisé méthodes pour effectuer des dosages ex vivo en utilisant des PBMC stimulés par un lipopolysaccharide bactérien, un récepteur de ligand-4 de type Toll. Les effets de milieu de la fumée conditionné ensemble (WS-CM), une préparation de produits du tabac combustible (TPP), et la nicotine ont été étudiés sur la sécrétion de cytokines et de destruction des cellules cible par les PBMC dans les tests ex vivo. Nous montrons que des cytokines sécrétées IFN-γ, le TNF, l&#39;IL-10, IL-6 et IL-8 et des cytokines intracellulaires IFN47 ;, TNF-α, MIP-1α et ont été supprimées dans les CMSP WS-CM-exposées. La fonction cytolytique des PBMC effectrices, telle que déterminée par un dosage de cellules cibles K562 tuant a également été réduite par exposition à WS-CM; la nicotine est très peu efficace dans ces essais. En résumé, nous présentons un ensemble de tests améliorés pour évaluer les effets du PPT en essais ex vivo, et ces méthodes pourraient être facilement adaptés pour tester d&#39;autres produits d&#39;intérêt.

Les résultats ont été présentés sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne (quatre échantillons de donneurs). T-test de Student entre les échantillons de contrôle traités et non traités a été réalisée en utilisant le logiciel Excel ainsi que des comparaisons t-test pour tous les traitements avec leurs contrôles correspondants. La signification statistique est indiquée par: *, P &lt;0,05; **, P &lt;0,005; ***, P &lt;0,0005. Pour mesurer l&#39;effet de l&#39;exposit...

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Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations

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11.3K vues.  Wake Forest University Health Sciences. Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure. 

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A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

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Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in human non-hepatic and murine cell lines, the efficiency was very low and required long-term selection procedures using HCV replicon constructs expressing dominant antibiotic-selectable markers1-5. HCV in vitro research is therefore limited to human hepatoma cell lines permissive for virus entry and completion of the viral life cycle. Due to HCVs narrow species tropism, there is no immunocompetent small animal model available that sustains the complete HCV replication cycle 6-8. Inefficient replication of HCV in non-human cells e.g. of mouse origin is likely due to lack of genetic incompatibility of essential host dependency factors and/or expression of restriction factors.
We investigated whether HCV propagation is suppressed by dominant restriction factors in either human cell lines derived from non-hepatic tissues or in mouse liver cell lines. To this end, we developed two independent conditional trans-complementation methods relying on somatic cell fusion. In both cases, completion of the viral replication cycle is only possible in the heterokaryons. Consequently, successful trans-complementation, which is determined by measuring de novo production of infectious viral progeny, indicates absence of dominant restrictions.
Specifically, subgenomic HCV replicons carrying a luciferase transgene were transfected into highly permissive human hepatoma cells (Huh-7.5 cells). Subsequently, these cells were co-cultured and fused to various human and murine cells expressing HCV structural proteins core, envelope 1 and 2 (E1, E2) and accessory proteins p7 and NS2. Provided that cell fusion was initiated by treatment with polyethylene-glycol (PEG), the culture released infectious viral particles which infected na&iuml;ve cells in a receptor-dependent fashion.
To assess the influence of dominant restrictions on the complete viral life cycle including cell entry, RNA translation, replication and virus assembly, we took advantage of a human liver cell line (Huh-7 Lunet N cells 9) which lacks endogenous expression of CD81, an essential entry factor of HCV. In the absence of ectopically expressed CD81, these cells are essentially refractory to HCV infection 10 . Importantly, when co-cultured and fused with cells that express human CD81 but lack at least another crucial cell entry factor (i.e. SR-BI, CLDN1, OCLN), only the resulting heterokaryons display the complete set of HCV entry factors requisite for infection. Therefore, to analyze if dominant restriction factors suppress completion of the HCV replication cycle, we fused Lunet N cells with various cells from human and mouse origin which fulfill the above mentioned criteria. When co-cultured cells were transfected with a highly fusogenic viral envelope protein mutant of the prototype foamy virus (PFV11) and subsequently challenged with infectious HCV particles (HCVcc), de novo production of infectious virus was observed. This indicates that HCV successfully completed its replication cycle in heterokaryons thus ruling out expression of dominant restriction factors in these cell lines. These novel conditional trans-complementation methods will be useful to screen a large panel of cell lines and primary cells for expression of HCV-specific dominant restriction factors.

We describe two methods for conditional trans-complementation of hepatitis C virus (HCV) assembly and the completion of the full viral life cycle, which rely on heterokaryon formation. These techniques are suitable to screen for cell lines that express dominant restriction factors, which preclude production of infectious HCV progeny.

Deux méthodes de formation hétérocaryons à découvrir les facteurs de restriction du VHC

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Quantitative à haut débit Test de cytotoxicité cellulaire unique pour les cellules T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

Création et optimisation d&#39;une installation à haut débit pour l&#39;étude<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Et<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infection comme un modèle pour la découverte de médicaments

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

Here we describe a newly developed hepatitis B virus (HBV) reporter system to monitor the early stages of the HBV life cycle. This simplified in vitro system will aid in the screening of anti-HBV agents using a high-throughput strategy.

Développement d&#39;un système de virus de l&#39;hépatite B Reporter pour surveiller les premiers stades du cycle de réplication

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&amp;#947; Receptor-mediated Phagocytosis

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

Utilisation d&#39;un monocytes monocouche Assay pour évaluer phagocytose Fcy Receptor médiée

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to stimulate cell migration. Importantly, cell migration is a rate-limiting event during the wound-healing process to re-establish the integrity and normal function of tissue layers after injury. The advantage of this method over the classical assay, which is based on a manually made scratch in a cell monolayer, is the usage of special silicone culture inserts providing two compartments to create a cell-free pseudo-wound field with a well-defined width (500 &#956;m). In addition, due to an automated image analysis platform, it is possible to rapidly obtain quantitative data on the speed of wound closure and cell migration. More precisely, the effect of two frog-skin AMPs on the migration of bronchial epithelial cells will be shown. Furthermore, pretreatment of these cells with specific inhibitors will provide information on the molecular mechanisms underlying such events.

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Here, we present a protocol to evaluate the effect of peptides on the migration of bronchial epithelial cells. This method allows for the rapid and highly reproducible obtainment of quantitative data on the speed of cell migration and wound closure.

Un roman In Vitro de la plaie guérison test afin d’évaluer la Migration cellulaire

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

Design of Cecal Ligation and Puncture and Intranasal Infection Dual Model of Sepsis-Induced Immunosuppression

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple organs. With the development of therapies, most patients survive the hyperinflammatory phase but progress to an immunosuppressive phase, which increases the emergence of secondary infections. Therefore, improved understanding of the pathogenesis underlying secondary hospital-acquired infections in the immunosuppressive phase during sepsis is of tremendous importance. Reported here is a model to test infectious outcomes by creating double-hit infections in mice. A standard surgical procedure is used to induce polymicrobial peritonitis by cecal ligation and puncture (CLP) and followed by intranasal infection of Staphylococcus aureus to simulate pneumonia occurring in immune suppression that is frequently seen in septic patients. This dual model can reflect the immunosuppressive state occurring in patients with protracted sepsis and susceptibility to secondary infection from nosocomial pneumonia. Hence, this model provides a simple experimental approach to investigate the pathophysiology of sepsis-induced secondary bacterial pneumonia, which may be used for discovering novel treatments for sepsis and its complications.

This protocol describes techniques to measure infectious outcomes underlying secondary hospital-acquired infections in the immunosuppressive condition, first by establishing cecal ligation/puncture mice then challenging them with intranasal infection to create a clinically relevant model of immunosuppression sepsis.

Conception de la ligation et de la perforation et de l'infection intranasale Double modèle de l'immunosuppression induite par la septicémie

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte (CTL) responses elicited against tumor- and pathogen-derived peptides. They offer several advantages over traditional killing assays. First, they permit the monitoring of CTL-mediated cytotoxicity within architecturally intact secondary lymphoid organs, typically in the spleen. Second, they allow for mechanistic studies during the priming, effector and recall phases of CTL responses. Third, they provide useful platforms for vaccine/drug efficacy testing in a truly in vivo setting. Here, we provide an optimized protocol for the examination of concomitant CTL responses against more than one peptide epitope of a model tumor antigen (Ag), namely, simian virus 40 (SV40)-encoded large T Ag (T Ag). Like most other clinically relevant tumor proteins, T Ag harbors many potentially immunogenic peptides. However, only four such peptides induce detectable CTL responses in C57BL/6 mice. These responses are consistently arranged in a hierarchical order based on their magnitude, which forms the basis for TCD8 &#8220;immunodominance&#8221; in this powerful system. Accordingly, the bulk of the T Ag-specific TCD8 response is focused against a single immunodominant epitope while the other three epitopes are recognized and responded to only weakly. Immunodominance compromises the breadth of antitumor TCD8 responses and is, as such, considered by many as an impediment to successful vaccination against cancer. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular factors and mechanisms that dictate or shape TCD8 immunodominance. The protocol we describe here is tailored to the investigation of this phenomenon in the T Ag immunization model, but can be readily modified and extended to similar studies in other tumor models. We provide examples of how the impact of experimental immunotherapeutic interventions can be measured using in vivo cytotoxicity assays.

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

We describe here a flow cytometry-based in vivo killing assay that enables examination of immunodominance in cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses to a model tumor antigen. We provide examples of how this elegant assay may be employed for mechanistic studies and for drug efficacy testing.

Adaptation des dosages de cytotoxicité in vivo à l’étude de l’immunodominance dans des réponses cellulaires spécifiques à la tumeur et aux lymphocytes T

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

Test ELISA in Vitro pour évaluer la puissance vaccinale contre la rage

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...