Ce travail a été soutenu par des subventions de l&#39;Institut National Heart and Lung (R01 HL086582) et le Fonds pour la science des cellules souches de New York (NYSTEM, contrat # &#160; C024316) à STA et DDS illustrations utilisées dans JoVE vidéo ont été réalisées par John Nyquist; Illustrateur médical de l&#39;Université d&#39;État de New York à Buffalo.

NOTE: Ce protocole a été approuvé par le Comité des soins et de l&#39;utilisation des animaux à l&#39;Université d&#39;État de New York à Buffalo. Préparation 1. Pré-chirurgicale <ol><li> Utilisez moutons (Dorset croisé, femelle, âgé d&#39;environ 1-3 ans avec un poids de 40-60 kg) pour l&#39;étude suivante. Administrer la cyclosporine A (200 mg / jour), l&#39;aspirine (975 mg / jour), et coumadin (20-30 mg / jour) par voie orale, en commençant 3 jours avant la chirurgie et se poursuivre pendant la durée de toutes les études. </li><li> Assurer le mouton a jeûné 12 heures avant la chirurgie (alimentation normale = 1,8 kg de foin et de grain 0,4 kg). </li><li> Stériliser tous les fournitures chirurgicales utilisant un autoclave à vapeur à 121 ° C et 15 psi pendant 30 min. </li><li> Placez les éléments suivants dans un dessiccateur 48 h paraformaldehyde avant la chirurgie: 4 mm sondes de flux Doppler, 1 mm de cristaux ultrasoniques, cathéters à demeure artérielles, des tubes d&#39;extension, et 42 &quot;Tygon. REMARQUE: Un tableau de matériel médical pertinentes nécessaires pour lala chirurgie et pour la stérilisation est répertorié dans le tableau 1. Pré-placement de l&#39;instrumentation dans le tuyau Tygon à cette étape permettra de gagner du temps pendant la chirurgie. <ol><li> Étiqueter chaque extrémité des sondes, cathéters et les cristaux comme gauche et à droite, le cas échéant. </li></ol></li></ol> 2. Opération chirurgicale <ol><li> Provoquer des moutons pour l&#39;anesthésie avec le diazépam (0,5 mg / kg) et la kétamine (4 mg / kg) par voie intraveineuse (IV). Vous pouvez également utiliser Telazol (4 mg / kg) IV. <ol><li> Effectuer intubation orotrachéale avec une sonde endotrachéale de 8,5 à 10,0 mm de diamètre interne menottées 7. </li><li> Administrer une anesthésie d&#39;inhalation à travers un circuit de régénération d&#39;air avec un ventilateur de marée de volume (7-10 ml / kg) ou un ventilateur à régulation de pression (15 à 20 cm H 2 O). Utilisez un vaporisateur de précision pour administrer l&#39;isoflurane ou le sévoflurane à un montant approprié (3% -4% initialement) pour atteindre un milieu à l&#39;étape de l&#39;anesthésie chirurgicale profonde. La concentration alvéolaire minimale pourmoutons est de 1,4% ou 1,9%, respectivement 8. </li><li> Évaluer profondeur de l&#39;anesthésie en observant la réponse motrice à un stimulus, réflexe palpébral, position de l&#39;œil, et le rythme cardiaque. Surveiller la saturation en oxygène du sang (95% -100%) en utilisant l&#39;oxymétrie de pouls, la concentration de CO 2 (45-55 mm de Hg) dans les gaz expiratoires utilisant capnographie et maintenir la température du corps au cours de la procédure (38,5 à 39,5 ° C) à l&#39;aide d&#39;une couverture chauffante à réglage automatique. </li></ol></li><li> Rasez la laine de l&#39;ensemble du cou du mouton, et plus d&#39;un veine céphalique, en utilisant une lame # 40 sur tondeuses standard. Préparer la peau de deux sites pour la chirurgie en utilisant 70% d&#39;alcool isopropylique et 7,5% de la bétadine gommage gaze saturé. Commencer avec de la gaze à l&#39;alcool pour faciliter l&#39;élimination des huiles de la peau. Alternez entre la gaze de la bétadine et de l&#39;alcool gaze trois fois. </li><li> Passer mouton sur la table d&#39;opération en décubitus dorsal sur une couverture chauffante. Passez un tube orogastrique de taille moyenne pour permettre l&#39;expulsion passive de contenu de l&#39;estomac. Étendre ladu cou et de brebis utiliser rembourrage de soutien au besoin pour maintenir le placement. <ol><li> Effectuez un gommage aseptique final en utilisant 7,5% de la bétadine gaze imbibée et laisser reposer pendant 5 minutes avant la chirurgie. </li></ol></li><li> Administrer des liquides IV (la de solution de Ringer lactate ou saline à 0,9%) à 10 ml / kg / h à travers un angiocath placé dans la veine céphalique. Administrer des antibiotiques peropératoires et l&#39;analgésie: pénicilline G procaïne 6600 U / kg par voie intramusculaire (IM), la gentamicine 1,6 mg / kg IM, et de 0,005 à 0,01 mg buprénorphine IV ou IM. </li><li> Faire une incision cm ~ 12 longueur sur le col de la ligne médiane ventrale aide d&#39;une coagulation électro. Isoler gauche et droite artères carotides (~ 6 cm) en enlevant du tissu conjonctif en utilisant une technique de dissection émoussé. Attacher et cautériser micro-vaisseaux de ramification des artères carotides de minimiser le saignement. </li><li> Maintenir la stérilité en utilisant (un non-stérile) infirmière en chirurgie pour aider à terriers tout le câblage et les tubes (sonde de débit, fils de cristal ultrasonset un tube de cathéter) dans la couche sous-cutanée de la peau. Utilisez un trocart émoussée, qui sort par l&#39;incision chirurgicale préparée au niveau du cou dorsolatéral. <ol><li> Atteindre sous le champ stérile et tourner la tête de la brebis de sorte que le côté du cou peut être visualisé sous le drap. </li><li> Utiliser une pince hémostatique courbe de 8 cm de tunnel à travers l&#39;espace sous-cutané entre l&#39;incision du col de la ligne médiane ventrale et du côté du cou. Ouvrez et fermez la pince hémostatique à disséquer carrément un espace pour le tube ~ 1,5 cm de large. Les conseils de la pince hémostatique doivent résider mi-chemin entre la tête et les épaules, environ 10 cm caudale à l&#39;oreille gauche ou droite. Tournez la pince hémostatique sorte que les pointes sont dirigées vers la peau superficielle. </li><li> Atteindre sous le champ stérile et faire une incision de 1,5 cm à travers la peau, sur les conseils de la pince hémostatique stérile avec un n ° 11 lame. Visualisez les conseils de la pince hémostatique pour confirmer une sortie claire à travers la peau. </li><li> Passez le tube Tygon contenant unll câblage et les tubes à travers le tunnel sous-cutanée. Maintenez les fils et les tubes au-dessus du champ stérile. </li><li> Atteindre sous le drap pour retirer le tube Tygon externe du goulot, ce qui expose le câblage implanté à la sortie du col du mouton. Tirez des lignes individuelles de manière à minimiser tout mou dans l&#39;espace sous-cutanée. Laissez suffisamment de distance pour fixer correctement l&#39;instrumentation à l&#39;artère. </li></ol></li><li> Placez les sondes de flux Doppler 4 mm sur les deux artères carotides et d&#39;atteindre une première lecture (Figure 1). Administrer 100 U / kg d&#39;héparine IV 30 min avant le clampage de l&#39;artère. </li><li> Continuer l&#39;administration d&#39;héparine à 100 U / kg / h jusqu&#39;à la fin de la chirurgie. Fixer l&#39;artère carotide en utilisant non-broyage clamps vasculaires et exciser une partie (environ 4 cm de longueur). Le débit de la carotide controlatérale augmentera 50% à 100% pour maintenir le flux sanguin vers le cerveau. NOTE: Il est possible de limiter étirage longitudinal par recul du vaisseau natif en supprimantsegments plus courts que d&#39;être remplacés et / ou étirement de l&#39;artère native avec vasculaire pinces de raccourcir écart jusqu&#39;à ce que la procédure anastomotique complet est terminé. Cela aidera à limiter la tension sur les sutures de maintien individuels et le greffon implanté. </li><li> Suturer la TEV en place en utilisant des points de suture interrompues simples avec 7-0 proline ethalloy à double suture monofilament armé. Si nécessaire, appliquer des relaxants musculaires vasculaires lisses comme les papavérine (15 mg / ml) ou la nicardipine (1,25 mg / ml) par voie topique sur le système vasculaire natif afin de prévenir la vasoconstriction qui gênerait suture anastomotique. REMARQUE: commencer à placer des sutures avec un espacement d&#39;environ 1 mm. Cela peut considérablement varier d&#39;un cas à l&#39;autre. La composition et l&#39;épaisseur TEV affecteront la distance effective entre les sutures. Comme l&#39;épaisseur du tissu natif ou TEV diminue, il peut être nécessaire de placer les fils de suture à se rapprocher. <ol><li> Première ancre quatre points de la TEV à l&#39;artère native en plaçant deux s opposéestitches sur les deux extrémités proximale et distale (figure 2 -di). Maintenez chaque ancrage enseigné en utilisant des pinces hémostatiques. REMARQUE: descriptions proximale et distale sont en référence à la direction du flux sanguin à travers le papier. </li><li> 6.5 Ajouter plusieurs sutures sur le côté superficiel des deux extrémités proximale et distale pour commencer l&#39;anastomose. (Figure 2-Pr). Simultanément tourner vasculaire pinces 180 degrés. </li><li> Rétablir la tension sur les sutures d&#39;ancrage. Ajouter additionnel (5-6) interrompue sutures à extrémités proximale et distale sur le côté tourné du TEV. </li></ol></li><li> Une fois que la TEV est solidement suturée en place, tournez de nouveau à la position initiale et retirez la vasculaire pinces un à la fois, pince distale en premier. Un léger saignement au niveau des sites d&#39;anastomose est commun. Cela peut naturellement résoudre après plusieurs minutes de serrage de presse et resserrage ou exiger le placement des sutures supplémentaires. Placer la sonde de débit Doppler (Figure 3-Fl) De retour sur proximale de l&#39;artère native à l&#39;écoulement de sang entrant dans la VET et le débit du moniteur. REMARQUE: Attendez les taux de la carotide gauche et à droite flux se équilibrer après environ 15 min. Si le débit de l&#39;artère carotide avec TEV implanté diminue régulièrement, il est possible de la TEV est de coagulation. Autres anomalies possibles concernant flux peuvent être attribués à la constriction des artères proximales de maternelle ou en aval de la TEV. Si cela se produit, l&#39;utilisation de plus lisse vasculaire relaxant musculaire peut être appliquée, et le navire natif devrait revenir à un ton de base après 30 à 60 minutes après la fermeture de tissu sur le site de la greffe. <ol><li> Si vous le souhaitez, exciser l&#39;artère carotide controlatérale et suturer le remettre en place comme un contrôle «Sham». Ce est plus cliniquement pertinente de laisser l&#39;artère carotide droite et la seule fixation de la sonde seulement d&#39;écoulement, des cristaux à ultrasons, et le cathéter. Si un contrôle factice est voulu, effectuer cette avant de continuer à l&#39;étape 2.11. </li></ol></li><li> Suturer une mm cristaux à ultrasons (Figure 3 -cr1 CR2) à des côtés opposés de la TEV en utilisant 7-0 Proline. Enfilez suture à travers la tête de cristal ultrasons et coudre uniquement à la couche superficielle de la TEV. </li><li> Cathétériser l&#39;artère en utilisant un cathéter G 18 modifié avec une patte de Téflon tissé (Figure 3- Ca et figure 4A). Placez l&#39;extrémité distale du cathéter à la TEV sur le tissu artériel natif. <ol><li> Suturer la patte à la paroi artérielle avec 5/0 Ethibond à contrôler les saignements. Utilisation cyclohexanone pour faire adhérer le tube microbore au cathéter qui a été rincé avec une solution saline. Utilisez la tubulure comme une ligne d&#39;extension. </li><li> Utilisez un G Luer Stub adaptateur 20 avec un bouchon d&#39;injection Surflo pour sceller la fin extériorisé de tubes (figure 4B). Pour maintenir la perméabilité du cathéter, obtenir le volume d&#39;amorçage de la ligne et le rincer avec 10 ml de solution saline et ensuite 5,000 U / ml d&#39;héparine sodique injection tous les 2-3 jours. </li></ol></li><li> Enregistrer la distance entre la sonde d&#39;écoulement et les cristaux à ultrasons, ainsi que la distance entre la sonde d&#39;écoulement et le cathéter. Cette vitesse permettra d&#39;onde de pouls à être calculée en conjonction avec le logiciel. Si ces calculs ne sont pas nécessaires, ne pas implanter un cathéter. </li><li> Obtenir une lecture peropératoire si désiré pour assurer tout le matériel implanté est fonctionnel (voir section 3). </li><li> Fixez lignes et fils implantés à proximité musculature utilisant 2/0 soie et une aiguille conique (Figure 3). <ol><li> Positionner la sonde de flux vasculaire fil parallèle au navire, à l&#39;caudale de la sonde et le fil se étendant crânienne, et ensuite faire un «U-Turn» vers la musculature latérale. Fixez le fil à la musculature adjacente, en utilisant 2-0 soie sur une aiguille conique à deux endroits, de sorte que la sonde de fil ou flux ne est pas en mesure de placer ne importe quelle souche sur le navire. Soyez sûr sutures sont bien ajustées, mais ne pas trop serrer et étrangler musculature (figure 3). </li><li> Suture de la ligne des fils de cristal et cathéter artériel à la musculature latérale, ce qui permet de ~ 1,5 cm de mou, analogue aux étapes précédentes pour fixer la sonde de débit (Figure 3). </li><li> Groupe tous les fils et les lignes ensemble et de les ancrer à la musculature juste avant de sortir à travers le tunnel sous-cutanée, similaires aux étapes précédentes. </li></ol></li><li> Fermez le site chirurgical avec une suture Vicryl 2-0 en couches utilisant un dessin de surjet sur planche de bord et sous-cutané, la course matelas le point sur la peau (planche de bord, l&#39;aiguille non-coupe, la peau, l&#39;aiguille de coupe). Fermez le 1,5 cm incision au niveau du cou dorsale autour des fils extériorisées et lignes en utilisant 2/0 Vicryl et une aiguille de coupe. </li><li> La place des fils de sonde d&#39;écoulement, les lignes de cathéters et de fils de cristal ultrasonore dans une poche (10 cm x 10 cm) qui est solidement suturées sur la peau du mouton (Figure 5 - après récupération). </li><li> Se sevrer progressivement les brebis hors anesthésieet le ventilateur de volume courant puis extubation les moutons lorsque la respiration spontanée est reprise. Retirez le angiocath inséré dans la veine céphalique et un bandage si nécessaire. </li><li> Bander le cou à l&#39;aide triple onguent antibiotique sur les incisions, un pad Telfa, gaze de rouleau étirement et elasticon. </li><li> Administrer l&#39;analgésie post-opératoire: méglumine de flunixine 2,2 mg / kg IM une fois lors de la récupération, puis 1,1 mg / kg IM une fois par jour pendant deux jours, la buprénorphine 0,005-0,01 mg IV ou IM deux fois par jour pendant une journée. </li></ol> 3. In Vivo surveillance <ol><li> Placez moutons dans chariot mobile pour assurer la retenue appropriée. Cela permet aux moutons de rester calme et consciente sans compromettre le matériel. Peut-être besoin de se acclimater moutons au panier 2 ou 3 fois pendant 30 minutes avant d&#39;obtenir des enregistrements d&#39;instrumentation. </li><li> Retirez tous les fils et les lignes de la poche et se connecter à des dispositifs de surveillance. Connectez sonde de débit à un débitmètre, cristaux 1 mm à ultrasons relié à TRB-USB Boîte, et des lignes à cathéter transducteurs de pression. Un organigramme de cette configuration est fourni (Figure 6). </li><li> Calibrer sondes de flux et des transducteurs de pression avant l&#39;acquisition de données. NOTE: En raison de la variabilité potentielle entre les versions de logiciels et les différences dans les équipements utilisés, les étalonnages et les réglages varient d&#39;un cas à l&#39;autre. </li><li> Utiliser un oscilloscope pour affiner la mesure de cristal Sonometrics, selon le protocole du fabricant. </li><li> Enregistrer les données en utilisant un logiciel informatique (figure 7). Traces dans la moitié supérieure de la figure 7 dans la couleur blanche correspond à la TEV implanté, tandis que des traces dans la moitié inférieure de couleur rouge correspond à la Sham / autochtone. Dans les deux cas la TEV et Sham le débit (ml / min), la pression artérielle (mm Hg) et le diamètre (mm) sont enregistrées en temps réel. </li><li> Dossier pendant au moins 1 min sans perturbations. Exporter ces données pour une analyse plus détaillée. Après l&#39;enregistrement, DISCONNect tous les fils et le lieu de retour dans la poche suturé sur le cou du mouton. </li></ol>

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There are no disclosures to report.

Le but de ce rapport est de fournir une procédure fiable et reproductible pour TeV implants d&#39;intérêt dans l&#39;artère carotide ovine. Les artères carotides indigènes des animaux utilisés dans ce modèle étaient 0,5 à 0,75 mm d&#39;épaisseur et de 4,5 à 5 mm de diamètre extérieur. La technique chirurgicale décrite ici a été un succès pour l&#39;implantation de différentes géométries TeV mesure de 0,25 à 1 mm d&#39;épaisseur, 4-5 mm de diamètre extérieur et 4 cm de longueur avec un grand succ...

L&#39;objectif principal pour le développement de TeV a été de fournir un substitut pour le remplacement de greffe autologue lorsque les navires autologues ne sont pas disponibles et de limiter les donateurs de vue de la morbidité. Par exemple, le nombre de pontages coronariens de l&#39;artère par année a dépassé 350 000 aux Etats-Unis, et la source idéale de greffons appropriés reste la gauche artère mammaire interne, descendante antérieure gauche artère coronaire et une veine saphène. Depuis de nombreuses personnes qui souffrent de maladies vasculaires peuvent ne pas avoir les artères et les veines convenables pour le remplacement de greffe autologue, le développement de TeV est ainsi devenue un champ intense de la recherche depuis des décennies 1-6. Alors que l&#39;ingénierie et l&#39;optimisation de nouveaux TeV ont subi de nombreux progrès, les rapports sur les techniques chirurgicales employées pour implanter les TeV eux n&#39;a pas été un sujet d&#39;une telle discussion intense. Plutôt, les protocoles concernant l&#39;implantation de TeV dans des modèles animaux sont largement laisséesjusqu&#39;à enquêteurs recherche. Le manuscrit suivant montre comment implanter TeV en utilisant une approche de bout-en-bout anastomose. Cette procédure a été optimisé par l&#39;utilisation d&#39;un modèle spécifique de suture anastomotique, stabilisant technique de suture, l&#39;optimisation de la tension longitudinale et l&#39;addition d&#39;instrumentation suivi in vivo. Cette méthode est en contraste avec certaines des nombreuses variantes qui ont été utilisés précédemment. En outre, cette procédure décrit comment acquérir des paramètres tels que la pression artérielle, TEV diamètre / la conformité et le débit à travers la TEV après la chirurgie jusqu&#39;à l&#39;explantation. Cette collection de données comprend une analyse de la TEV indispensable alors qu&#39;il est dans le processus de remodelage.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1505">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td dir="LTR" height="43" style="height:43px;width:335px;">Equipment</td>
			<td dir="LTR" style="width:208px;">Manufacturer</td>
			<td dir="LTR" style="width:311px;">Serial/Catalog #</td>
			<td dir="LTR" style="width:363px;">Notes</td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td dir="LTR" height="94" rowspan="2" style="height:94px;width:335px;">Pressure Transducer</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:208px;">Becton Dickinson</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:311px;">P23XL-1</td>
			<td dir="LTR" style="width:291px;">1+ (1 for each artery) 
			&#160;Used with water-filled diaphragm domes</td>
		</tr>
		<tr height="172">
			<td dir="LTR" height="172" style="height:172px;width:335px;">Amplifier and transducer box</td>
			<td dir="LTR" style="width:208px;">Gould</td>
			<td dir="LTR" style="width:311px;">5900 Signal Conditioner Cage</td>
			<td dir="LTR" style="width:291px;">1 
			Two transducers and amplifiers should be included in cage. While this specific unit may be discontinued, other commercially available pressure transducers with a BNC/analog output will communicate with the Sonometrics equipment</td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td dir="LTR" height="121" style="height:121px;width:335px;">T403 Console with TS420 perivascular flowmeter module(x2)&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:208px;">Transonic Systems</td>
			<td dir="LTR" style="width:311px;">T403 module and TS420 (x2)</td>
			<td dir="LTR" style="width:291px;">1 
			Flow probes measuring flow through each of the carotid arteries will connect to each of the TS420 units.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td dir="LTR" height="126" style="height:126px;width:335px;">Digital ultrasonic measurement unit</td>
			<td dir="LTR" style="width:208px;">Sonometrics</td>
			<td dir="LTR" style="width:311px;">TR-USB</td>
			<td dir="LTR" style="width:291px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td dir="LTR" height="48" style="height:48px;width:335px;">Flow Probe Precision S-Series 4mm</td>
			<td dir="LTR" rowspan="4" style="width:208px;">Transonic Systems Inc.</td>
			<td dir="LTR" rowspan="4" style="width:311px;">MC4PSS-LS-WC100-CM4B-GA</td>
			<td dir="LTR" rowspan="4" style="width:291px;">2</td>
			<td dir="LTR" rowspan="4" style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td dir="LTR" height="49" rowspan="2" style="height:49px;width:335px;">1mm&#160; Sonometrics Crystals</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:208px;">Sonometrics Systems</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:311px;">1R-38S-20-NC-SH</td>
			<td dir="LTR" style="width:291px;">&#160;2-4 (2 for each artery)</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td dir="LTR" height="134" rowspan="2" style="height:134px;width:335px;">Catheter for implantation</td>
			<td dir="LTR" style="width:208px;">BD (Becton Dickinson)</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:311px;">&#160;381447</td>
			<td dir="LTR" style="width:291px;">&#160;1+ (1 for each artery) 
			Catheter is cut and secured to microbore tubing, stylette is utilized for insertion&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td dir="LTR" height="73" rowspan="2" style="height:73px;width:335px;">Tygon Microbore Tubing</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:208px;">Norton Performance Plastics</td>
			<td dir="LTR" style="width:311px;">(AAQ04127) Formulation S-54-HL</td>
			<td dir="LTR" style="width:291px;">NA (cut to length for an extension set)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td dir="LTR" height="49" rowspan="2" style="height:49px;width:335px;">Luer Stub Adapter</td>
			<td dir="LTR" style="width:208px;">BD (Becton Dickinson)</td>
			<td dir="LTR" style="width:311px;">427564 (20 gauge)</td>
			<td dir="LTR" style="width:291px;">1+ (1 for each arterial catheter)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td dir="LTR" height="82" rowspan="2" style="height:82px;width:335px;">Surflo Injection Plug</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:208px;">Terumo</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:311px;">SR-IP2</td>
			<td dir="LTR" style="width:291px;">1+ (1 for each arterial catheter)</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td dir="LTR" height="128" rowspan="2" style="height:128px;width:335px;">Meadox</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:208px;">PTFE (Teflon) Felt</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:311px;">19306</td>
			<td dir="LTR" style="width:291px;">NA (cut to size) 
			The PTFE felt used in our studies was discontinued. However, comparable companies such as &#8220;Surgical Mesh&#8221; offer products which are equivalent.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surgical technique for the implantation of tissue engineered vascular grafts and subsequent in vivo monitoring

Le développement des navires de l&#39;ingénierie tissulaire (TeV) de est avancé par la capacité de TeV routinière et efficacement implant (4-5 mm de diamètre) dans un grand modèle animal. Un protocole étape par étape pour le placement inter-position de l&#39;évaluation numérique TEV et en temps réel de la TEV et les artères carotides indigènes est décrite ici. Surveillance in vivo est rendue possible par l&#39;implantation de sondes de flux, cathéters et des cristaux à ultrasons (capable d&#39;enregistrement des variations de dynamiques de diamètre TeV implantés et les artères carotides natifs) au moment de la chirurgie. Une fois implantées, les chercheurs peuvent calculer modèles artères de la circulation sanguine, pression artérielle invasive et diamètre de l&#39;artère rendement paramètres tels que la vitesse de l&#39;onde de pouls, l&#39;indice d&#39;augmentation, les pressions d&#39;impulsions et de conformité. L&#39;acquisition des données est réalisée en utilisant un programme informatique pour l&#39;analyse unique pendant toute la durée de l&#39;expérience. Ces données inestimable donne un aperçu de TEV remodelage de la matrice, sa resemblanCE pour les contrôles natifs / faux et la performance globale de TEV in vivo.

Plus de 30 moutons ont subi la technique chirurgicale décrite dans le présent rapport pour l&#39;implantation de TeV (sous presse) 9. Un tableau résumant les plus récentes opérations de moutons après optimisation des protocoles sont présentés dans le tableau 2. Tous les moutons récupérés après TEV implantation sans complications potentiellement mortelles. Chez certains animaux, la fibrose a été observée dans l&#39;artère native près de la pointe de la sonde à demeure artéri...

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Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Un protocole étape par étape pour le placement inter-position des navires de l&#39;ingénierie tissulaire (de TeV) dans l&#39;artère carotide d&#39;un mouton en utilisant une anastomose de bout en bout et l&#39;évaluation numérique en temps réel in vivo jusqu&#39;au sacrifice des animaux.

Technique chirurgicale pour l&#39;implantation de l&#39;ingénierie tissulaire vasculaires greffes et suivantes<em&gt; In Vivo</em&gt; Surveillance

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

surgical-technique-for-implantation-tissue-engineered-vascular-grafts

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

11.6K vues.  State University of New York Buffalo School of Medicine.  Un protocole étape par étape pour le placement inter-position des navires de l'ingénierie tissulaire (de TeV) dans l'artère carotide d'un mouton en utilisant une anastomose de bout en bout et l'évaluation numérique en temps réel in vivo jusqu'au sacrifice des animaux. 

Vidéo: Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT)

Various techniques of cardiac tissue engineering have been pursued in the past decades including scaffolding strategies using either native or bioartificial scaffold materials, entrapment of cardiac myocytes in hydrogels such as fibrin or collagen and stacking of myocyte monolayers 1. These concepts aim at restoration of compromised cardiac function (e.g. after myocardial infarction) or as experimental models (e.g. predictive toxicology and substance screening or disease modelling). Precise monitoring of cell survival after implantation of engineered heart tissue (EHT) has now become possible using in-vivo bioluminescence imaging (BLI) techniques 2. Here we describe the generation of fibrin-based EHT from a transgenic rat strain with ubiquitous expression of firefly luciferase (ROSA/luciferase-LEW Tg; 3). Implantation is performed into the greater omentum of different rat strains to assess immune responses of the recipient organism following EHT implantation. Comparison of results generated by BLI and the Enzyme Linked Immuno Spot Technique (ELISPOT) confirm the usability of BLI for the assessment of immune responses.

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue EHT

This video demonstrates the use of in vivo bioluminescence imaging to study immune responses after implantation of Engineered Heart Tissue (EHT) in rats.

Imagerie par bioluminescence pour l&#39;évaluation des réponses immunitaires après l&#39;implantation du tissu cardiaque d&#39;ingénierie (ISE)

Various techniques of cardiac tissue engineering have been pursued in the past decades including scaffolding strategies using either native or ...

Recherche

Bio-ingénierie

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

Greffes d&#39;ingénierie biologique vasculaire basé sur l&#39;aide d&#39;un bioréacteur pulsatile

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Sans contact, sans étiquette de surveillance des cellules et la matrice extracellulaire en utilisant la spectroscopie Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

Production, la caractérisation et utilisations potentielles d&#39;un humain de l&#39;oesophage muqueux modèle 3D de l&#39;ingénierie tissulaire

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Athymic Rat Model for Evaluation of Engineered Anterior Cruciate Ligament Grafts

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without intervention. Current treatment strategies include ligament reconstruction with either autograft or allograft, which each have their associated limitations. Thus, there is interest in designing a tissue-engineered graft for use in ACL reconstruction. We describe the fabrication of an electrospun polymer graft for use in ACL tissue engineering. This polycaprolactone graft is biocompatible, biodegradable, porous, and is comprised of aligned fibers. Because an animal model is necessary to evaluate such a graft, this paper describes an intra-articular athymic rat model of ACL reconstruction that can be used to evaluate engineered grafts, including those seeded with xenogeneic cells. Representative histology and biomechanical testing results at 16 weeks postoperatively are presented, with grafts tested immediately post-implantation and contralateral native ACLs serving as controls. The present study provides a reproducible animal model with which to evaluate tissue engineered ACL grafts, and demonstrates the potential of a regenerative medicine approach to treatment of ACL rupture.

Animal models are important tools for the evaluation of tissue-engineered grafts. This paper presents the protocol for preparing an electrospun biodegradable polymer graft for use in anterior cruciate ligament tissue engineering, as well as a surgical protocol for implantation in a rat model.

Athymiques Rat Modèle d&#39;évaluation des Engineered ligament croisé antérieur greffes

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Ingénierie 3D cellularisé collagène Gels pour la régénération tissulaire vasculaire

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

des applications de<em&gt; In Vivo</em&gt; Tests fonctionnels du Rat jambier antérieur pour l&#39;évaluation de l&#39;ingénierie tissulaire Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, engineered grafts offer great potential for patient treatment. However, engineered vascular grafts are generally not easily scalable, requiring manufacture of custom molds or polymer tubes in order to customize to different sizes, constituting a time-consuming and costly practice. Human arteries range in lumen diameter from about 2.0-38 mm and in wall thickness from about 0.5-2.5 mm. We have created a method, termed the "Ring Stacking Method," in which variable size rings of tissue of the desired cell type, demonstrated here with vascular smooth muscle cells (SMCs), can be created using guides of center posts to control lumen diameter and outer shells to dictate vessel wall thickness. These tissue rings are then stacked to create a tubular construct, mimicking the natural form of a blood vessel. The vessel length can be tailored by simply stacking the number of rings required to constitute the length needed. With our technique, tissues of tubular forms, similar to a blood vessel, can be readily manufactured in a variety of dimensions and lengths to meet the needs of the clinic and patient.

Scalable engineered blood vessels would improve clinical applicability. Using easily sizable 3D-printed guides, rings of vascular smooth muscle were created and stacked into a tubular form, forming a vascular graft. Grafts can be sized to meet the range of human coronary artery dimensions by simply changing the 3D-printed guide size.

Mise à l&#39;échelle de l&#39;ingénierie vasculaire Greffes Utilisation 3D Printed Guides et Méthode d&#39;empilage Anneau

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.

Une nouvelle technique de suture Tenorrhaphy avec greffe de collagène issue d’une ingénierie tissulaire pour réparer les gros défauts tendineux

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.