Les auteurs tiennent à remercier Dale Hirschkorn de Blood Systems Research Institute pour son aide avec cytomètre de flux réglages de l&#39;appareil. Ce travail a été soutenu par le NIH et accorde HL095470 U01 HL072268 et contrats DoD W81XWH-10-1-0023 et W81XWH-2-0028.

REMARQUE: Les protocoles suivants ont été réalisées en conformité avec toutes les directives institutionnelles, nationales et internationales pour le bien-être humain. Tous les échantillons des sujets humains ont été testés dans un conseil d&#39;examen institutionnel (IRB) -approuvé protocole et avec le consentement éclairé des sujets. 1. Méthode A: Méthode de détection individuelle 1.1) Le traitement de l&#39;échantillon de sang / Isolation des véhicules électriques <ol><li> Prélever le sang du donneur / patient dans deux tubes de 10 ml en verre contenant 1,5 ml d&#39;ACD-Solution A ou un autre anticoagulant approprié et processus immédiatement (dans les 30 minutes max) en utilisant le 2-step protocole de centrifugation différentielle suivante. NOTE: Ce protocole donnera environ 10 ml de plasma pauvre en plaquettes (PPP) des combinés ~ 17 ml de sang prélevé. Si plus ou moins PPP est nécessaire, le nombre de tubes de sang collecté peut être ajustée en conséquence. </li><li> Centrifuger les échantillons à 1500 g pendant 10 min à température ambiantepour séparer le plasma de la couche leucocytaire et les globules rouges. Transférer 1,2 ml aliquotes du surnageant de plasma pour 1,5 ml tubes de centrifugation, en faisant attention de ne pas déranger les couches inférieures contenant la couche leucocytaire et les globules rouges. </li><li> Tourner à 13 000 g pendant 10 min à température ambiante pour éliminer les plaquettes et les grands fragments cellulaires. Transférer soigneusement le PPP, laissant derrière 200 pi pour éviter de perturber le culot et ajouter le PPP dans un nouveau tube. </li><li> À ce stade, utiliser PPP immédiatement pour l&#39;analyse ou le transfert dans aliquotes de 1,0 ml à 1,5 ml de nouveaux tubes de centrifugeuse et conserver à -80 ° C pendant jusqu&#39;à deux ans pour une analyse ultérieure (voir la figure 1A pour un aperçu). </li><li> Si VE purifiés sont nécessaires pour les expériences fonctionnelles, transfert 6 ml de PPP à un tube d&#39;ultracentrifugeuse et ajouter 28 ml de 0,2 um filtré la solution tampon phosphate (PBS). Spin pendant 60 min à 100 000 x g à la température ambiante en utilisant une ultracentrifugeuse équipé d&#39;un rotor à godet oscillant. Aspirer le surnageant et remettre en suspension EV pellaisser dans 1,5 ml de milieu. NOTE: Pour plus reproductibilité, des échantillons de sang doivent être traités de manière aussi cohérente que possible d&#39;un donneur à. Toute variation dans la méthode d&#39;isolement EV pourrait avoir une incidence significative le nombre et le type de véhicules électriques détectés. </li></ol> 1.2) Préparation des échantillons pour analyse NOTE: A partir de là, les étapes expliquer un protocole à haut débit pour l&#39;analyse de 12 échantillons pour 14 marqueurs en trois panneaux. Cependant, d&#39;autres combinaisons d&#39;anticorps peuvent être utilisés ici; le protocole peut être adapté à l&#39;étude d&#39;autres populations EV en substituant les marqueurs ont été proposées pour ceux d&#39;intérêt. <ol><li> Retirer du congélateur 12 échantillons (se il est stocké à -80 ° C) et du dégel à 37 ° C. </li><li> contenu de la pipette de haut en bas plusieurs fois pour mélanger. Retirer 320 pi de chaque échantillon et ajouter à la rangée du haut d&#39;une plaque de 96 puits. REMARQUE: Un multi-puits pipette réglable en largeur est extrêmement utile pour cela et bien d&#39;autres étapes tout au long de l&#39;âneay, en particulier lors de l&#39;analyse de plusieurs échantillons à la fois. </li></ol> 1.3) Les échantillons coloration EV <ol><li> Avant coloration, filtrer tous les anticorps (ABS) pour éliminer les agrégats, ce qui peut provoquer des signaux positifs. <ol><li> Moissonneuses anticorps à utiliser dans chacun des trois panneaux à 0,22 um tubes filtrants centrifuges séparées et centrifugation en utilisant une centrifugeuse à angle fixe unique de vitesse (~ 750 x g) à température ambiante pendant 2 min, ou jusqu&#39;à ce que la totalité du mélange Ab a traversé le filtre et qu&#39;aucun liquide ne reste d&#39;anticorps sur la surface du filtre. Magasin Ab cocktails dans le réfrigérateur jusqu&#39;à deux semaines, mais re-filtre à chaque fois avant de l&#39;utiliser. </li></ol></li><li> Ajouter la quantité appropriée de mélange Ab filtré pour chaque puits dans la rangée 2 (par exemple, des échantillons de Groupe I sont colorées avec 2 pi de chaque Ab, soit un total de 12 ul du cocktail Ab filtrée est ajouté par puits à la ligne 2). Reportez-vous à la figure 1B pour un aperçu de la carte de la plaque suggéré. Répétez ces pluss pour les lignes en dessous si plusieurs panneaux sont exécutés (ici, ajouter 8 pl / puits du cocktail Panel II à la ligne 3 et 11 pl / puits du cocktail Panel III à ramer 4; se référer à la liste de matériaux pour des informations spécifiques du panneau). </li><li> Utilisation de la pipette multicanaux, mélanger les échantillons de PPP dans la rangée 1 de haut en bas et de transférer 100 pi des puits dans la rangée 1 dans les puits dans la rangée 2. Mix de haut en bas. conseils de changement et de répétition, le transfert de 100 pi de la ligne 1 aux lignes 3 et 4. Incuber à 4 ° C pendant 30 min. </li></ol> 1,4) échantillons de MT à laver <ol><li> Retirer la plaque de 96 puits de 4 ° C et le transfert au Cabinet de sécurité biologique. En utilisant une pipette multicanaux, ajouter 220 pi de PBS / bien rangées 6-8 (à utiliser pour le rinçage / lavage des puits contenant teinté PPP). </li><li> Transférer le contenu de chaque puits pour tubes filtrants centrifuges pré-étiquetés en utilisant le multicanal pipette réglable en largeur (Pour 12 échantillons, avec 3 panneaux d&#39;anticorps, 12 x 3 = 36 tubes de filtreêtre nécessaire). En utilisant les mêmes conseils, retirer 200 pi de PBS à partir des lignes de lavage et ajouter aux puits correspondants à partir de laquelle PPP a été juste enlevé. </li><li> Mélanger haut et bas pour rincer les puits et transférer la solution de rinçage pour les mêmes filtres à laquelle le PPP a déjà été ajouté. Fermer sommets des filtres centrifuges. Changer conseils. </li><li> Répétez ce processus avec les échantillons colorés restants jusqu&#39;à ce que tous les échantillons PPP colorées ont été transférés avec leurs solutions de rinçage à filtres centrifuges. </li><li> Transférer les filtres centrifuges à rotor d&#39;une centrifugeuse de filage fixe et à 850 g pendant 3 minutes à température ambiante. REMARQUE: Veiller à ce qu&#39;aucun liquide reste sur les sommets de filtre. Après centrifugation, le filtre doit apparaître comme &quot;sec&quot; sans couche de fluide restant visible sur le dessus. Bien que peu probable, certains échantillons PPP peuvent nécessiter un temps de centrifugation plus à se déplacer efficacement à travers le filtre. </li><li> Retirer les tubes de filtre centrifuge et revenir à l&#39;enceinte de sécurité biologique.En utilisant la pipette à canaux multiples, remettre en suspension les sommets des filtres dans 300 ul de PBS. Transférer le contenu remises en suspension dans des tubes pré-étiquetés pour une analyse immédiate FCM. NOTE: Il est très important de garder la force et le nombre de dépressions pipette à piston cohérentes parmi les échantillons pour éviter la variation échantillon à échantillon. Ce devrait idéalement être fait en utilisant une pipette électronique qui a été programmé pour pipette de haut en bas un volume spécifique (par exemple, 280 pi) d&#39;un nombre exact de fois (par exemple, 8 fois) pour chaque échantillon. </li></ol> 1.5) la configuration du cytomètre <ol><li> Ouvrez le logiciel FCM. Avant d&#39;expérimenter l&#39;installation, effectuer l&#39;étalonnage de l&#39;instrument par jour et la configuration utilisant des billes de configuration de l&#39;appareil (en suivant les instructions du fabricant). </li><li> Si les échantillons EV ont été colorées avec plus d&#39;un anticorps et multiples fluorochromes sont à mesurer à la fois, calculer les valeurs de rémunération comme suit: <ol><li> Ajouter deux gouttes de perles de compensation de prétubes marqué au (1 tube pour chaque anticorps conjugué à un fluorochrome) et ajouter la quantité recommandée d&#39;anticorps. Ajouter deux gouttes de perles négatifs de compensation dans un autre tube à utiliser comme commande de compensation sans tache. </li><li> Incuber à 4 ° C pendant 30 min, on lave avec du PBS et remettre en suspension dans 400 ul de PBS. </li><li> Utilisation du cytomètre de flux logiciel fourni avec l&#39;appareil, exécutez chaque tube de compensation et de régler les tensions fluorescentes de placer chaque pic à environ 10 4 sur une échelle de 5 log-décennie. Assurez-vous que le pic de fluorescence est le plus élevé (le plus clair) dans son propre canal fluorescente par rapport à tous les autres canaux, et d&#39;ajuster les paramètres de tensions fluorescentes à nouveau si nécessaire. Exécutez chaque tube maquette individuellement colorées et de capturer au moins 5000 événements par tube. </li><li> Sélectionnez l&#39;onglet &quot;Expérience&quot;, puis sélectionnez «Rémunération», puis sélectionnez «Calculer la rémunération» pour appliquer les valeurs de rémunération à tous les échantillons. </li></ol></li><li&gt; Régler la diffusion vers l&#39;avant (FSC) et la diffusion latérale (SSC) paramètres de tension à échelle logarithmique et sélectionnez les seuils les plus bas permis par le cytomètre (FSC et SSC = 200 = 200) pour chaque. </li><li> Lors de l&#39;exécution d&#39;un tube de 0,22 um filtré PBS, régler les tensions FSC et SSC aux valeurs les plus élevées qui excluent la majorité du bruit de fond (ce est à dire, juste en dessous du seuil de tension à laquelle le taux d&#39;événements dépasse 5 événements / sec). </li><li> Ensuite, exécutez un tube contenant 0,2 um - 1,0 um perles, dilué dans du PBS si nécessaire. Dans un complot FCS vs SSC, dessiner une grille autour de la population de billes pour capturer les événements entre 0,2 um et 1,0 um. Alternativement, dans un histogramme SSC-H, dessiner une porte d&#39;inclure tous les événements plus petits que les 1,0 um perles. </li><li> Réglez le débit du cytomètre à «Lo» (environ 8 à 12 pi / min). En utilisant le tube de perles (ou autre tube contenant une concentration connue de perles) régler le cadran de débit sur le cytomètre jusqu&#39;à la veillent taux atteint environ 200 événements / sec. Lire tous les tubes échantillons au même débit et utiliser la même concentration de billes dans des expériences futures pour se assurer que les débits restent cohérents entre les courses. </li><li> Exécutez un tube de particules fluorescentes arc dilué dans du PBS. Acquérir 5000 événements. Notez les valeurs d&#39;intensité moyenne pour FSC, SSC, et chaque canal de couleur. Utilisez ces valeurs pour ajuster les tensions dans les expériences futures à assurer que les intensités de fluorescence restent cohérents entre les expériences. </li></ol> 1,6) lecture de l&#39;échantillon <ol><li> Réglez le débit du cytomètre à «Lo» (environ 8 à 12 pi / min) et tester chaque échantillon pendant exactement 1 ou 2 min. </li><li> Après la première lecture, ajouter 20 ul de 10% de NP-40 à chaque échantillon, une pipette de haut en bas, et pour relire la même quantité de temps (soit une ou deux minutes) pour permettre la soustraction d&#39;événements positifs détectés dans l&#39;échantillon lysées sur un laps de temps égal. NOTE: Il est extrêmement important que les échantillons soient mélangés à l&#39;aide d&#39;une pipette plutôt que d&#39;un vortex. Dans notre expérience, vortex peut causer l&#39;auto-agrégation de certains anticorps, conduisant à des événements positifs EV-imitant. </li><li> Une fois que tous les échantillons ont été lus, l&#39;exportation de tous les fichiers .fcs dans un fichier séparé pour être utilisé pour l&#39;analyse en outre l&#39;utilisation des logiciels d&#39;analyse de la FCM. </li></ol> 1.7) Analyse de données <ol><li> Ouvrez le logiciel d&#39;analyse de la FCM. Importer tous les fichiers de .fcs dans un nouveau fichier de l&#39;expérience. </li><li> Ouvrez le perles seule tube. Dans le FSC-A vs SSC-Un complot, dessiner une grille autour de toutes les perles de taille entre 0,2 um et 1,0 um. Ce est la porte d&#39;EV. Faites glisser pour ajouter à tous les échantillons. </li><li> En utilisant les échantillons lysées comme témoins négatifs, dessiner portes au bord de la fluorescence de fond dans chaque canal de fluorescence utilisé. Faites glisser portes fluorescents dans la porte EV de chaque échantillon non-lysées correspondant. NOTE: A ce stade, il est également utile d&#39;examiner fluorescentes deux parcelles bi-paramètres. formes de fuséele quadrant double positif (voir figure 8), en particulier si les marqueurs sont connus pour se trouver sur les types de cellules non liées, peuvent être le signe d&#39;artefact à partir de l&#39;agrégation ou d&#39;autres événements imitant des vésicules. </li><li> Pour chaque marqueur fluorescent, soustraire le nombre d&#39;événements dans l&#39;échantillon lysé du nombre d&#39;événements dans l&#39;échantillon non-lysées. Eventuellement, diviser ce nombre par le nombre total de véhicules électriques au sein de la grille non-lysées EV pour obtenir% des valeurs positives. </li></ol> 2. Méthode B: Méthode Perles 2.1) Le traitement de l&#39;échantillon de sang / Isolation des véhicules électriques <ol><li> Reportez-vous à la méthode de traitement du sang décrit dans la méthode A (article 1.1). </li></ol> 2.2) Préparation des échantillons pour analyse <ol><li> Si vous le souhaitez, fractionner PPP ou EVS ultracentrifugés en exosomes et microvésicules. Ajouter 250 pi de PPP ou EVS ultracentrifugés à 0,22 um filtres centrifuges et transfert à une centrifugeuse à rotor fixe et tournent à 750 xg pendant 2 minutes à température ambiante. REMARQUE: Veiller à ce qu&#39;aucun liquide reste sur les sommets de filtre. Après centrifugation, le filtre doit apparaître comme &quot;sec&quot; sans couche de fluide restant visible sur le dessus. Bien que peu probable, certains échantillons peuvent nécessiter un temps de centrifugation légèrement plus longue pour le fluide de se déplacer de manière efficace à travers le filtre. </li><li> Lavez non couchés 6 um billes de polystyrène (par exemple, perles négatifs ABC) 2x avec les médias RPMI, et remettre en suspension dans 2 ml. Ajouter 6000 perles à chaque tube FACS. Pour le tube de contrôle négatif, ajouter 400 ul de milieu RPMI seul à billes. Pour tous les autres tubes, ajouter 200 pi de PPP ou EVS ultracentrifugés (ou de leurs fractions) et 200 pi de milieu RPMI. </li><li> Ajuster le volume final de tous les tubes avec 400 ul de médias et incuber une nuit à 4 ° C sur un agitateur. </li><li> Le lendemain matin, lavez perles avec 2 ml de milieu. Aspirer le surnageant. </li><li> Bloquer avec 5% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) dans un milieu (400 ul) pendant 3 heures à 4 &amp;# 176; C sur un agitateur. </li><li> Lavez perles avec 2 ml de milieu. Aspirer et remettre en suspension le culot dans 100 pl de milieu. </li></ol> 2.3) Les échantillons coloration EV <ol><li> Filtrer tous les anticorps. Utiliser les mêmes panneaux anticorps utilisé dans la méthode A, ou si on le souhaite, de créer une combinaison différente d&#39;anticorps aussi longtemps que leurs fluorochromes sont compatibles entre eux. </li><li> Mélanger tous les anticorps à utiliser dans un seul panneau dans un tube de filtre centrifuge de 0,22 um. Centrifugeuse utilisant une centrifugeuse à angle fixe à une seule vitesse pendant 2 minutes ou jusqu&#39;à ce que la totalité du mélange Ab a traversé le filtre et qu&#39;aucun liquide ne reste d&#39;anticorps sur la surface du filtre. </li><li> Ajouter le volume approprié de cocktail d&#39;anticorps filtré à tous les tubes et incuber pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Lavez perles avec 2 ml de médias, remettre en suspension dans 400 pi de milieu et l&#39;exécuter immédiatement (ou dans la même journée) sur cytomètre de flux. </li></ol> 2.4) cytomètre installation et lecture d&#39;échantillon<ol><li> Ouvrez le logiciel FCM. Avant d&#39;expérimenter l&#39;installation, effectuer l&#39;étalonnage de l&#39;instrument par jour et la configuration utilisant des billes de configuration de l&#39;appareil (en suivant les instructions du fabricant). </li><li> Si les échantillons EV ont été colorées avec plus d&#39;un anticorps et multiples fluorochromes sont à mesurer à la fois, calculer les valeurs de rémunération comme suit: <ol><li> Ajouter deux gouttes de perles de compensation à des tubes pré-étiquetés (1 tube pour chaque anticorps conjugué à un fluorochrome) et ajouter la quantité recommandée d&#39;anticorps. Ajouter deux gouttes de perles négatifs de compensation dans un autre tube à utiliser comme commande de compensation sans tache. Incuber à 4 ° C pendant 30 min, on lave avec du PBS et remettre en suspension dans 400 ul de PBS. </li><li> Utilisation du logiciel de la FCM, exécutez chaque tube de compensation et ajuster tensions fluorescentes de placer chaque pic à environ 10 4 sur une échelle logarithmique 5-décennie. Assurez-vous que le pic de fluorescence est le plus élevé (le plus clair) dans son propre canal fluorescente par rapport à tous les autres canaux, etajuster les tensions de paramètres fluorescentes à nouveau si nécessaire. Exécutez chaque tube maquette individuellement colorées et de capturer au moins 5000 événements par tube. </li><li> Sélectionnez l&#39;onglet &quot;Expérience&quot;, puis &quot;rémunération&quot;, puis &quot;Calculer la rémunération» pour appliquer les valeurs de rémunération à tous les échantillons. </li></ol></li><li> Changez le FSC et les paramètres de tension SSC à échelle logarithmique et sélectionnez les seuils les plus bas permis par le cytomètre (FSC et SSC = 200 = 200) pour chaque. </li><li> Échantillons terme, porte sur la population des perles de singlet et acquièrent 2000 événements dans cette porte. Les dossiers de l&#39;exportation. </li><li> Utilisez le logiciel d&#39;analyse de la FCM pour analyser .fcs fichiers. Porte sur des billes de singlet. Calculer l&#39;intensité de fluorescence moyenne géométrique (IMF) pour chaque fluorochrome et comparer avec l&#39;IMF du contrôle négatif. </li></ol>

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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles,+current+state-of-the-art:+emerging+role+of+extracellular+vesicles.">Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).</li><li>Miguet, L., Be&#769;chade, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analysis+of+Malignant+B-Cell+Derived+Microparticles+Reveals+CD148+as+a+Potentially+Useful+Antigenic+Biomarker+for+Mantle+Cell+Lymphoma+Diagnosis.">Proteomic Analysis of Malignant B-Cell Derived Microparticles Reveals CD148 as a Potentially Useful Antigenic Biomarker for Mantle Cell Lymphoma Diagnosis.</a> Journal of Proteome Research. 8 (7), 3346-3354 (2009).</li><li>Smalley, D. M., Root, K. E., Cho, H., Ross, M. M., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+discovery+of+21+proteins+expressed+in+human+plasma-derived+but+not+platelet-derived+microparticles.">Proteomic discovery of 21 proteins expressed in human plasma-derived but not platelet-derived microparticles.</a> Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 67-80 (2007).</li><li>Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+Limitations+of+Microparticle+Measurement+by+Flow+Cytometry.">Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (08), 807-818 (2010).</li><li>Mobarrez, F., Antovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolor+flow+cytometric+assay+for+measurement+of+platelet-derived+microparticles.">A multicolor flow cytometric assay for measurement of platelet-derived microparticles.</a> Thrombosis Research. 125 (3), e110-e116 (2010).</li><li>Van der Pol, E., van Gemert, M. J. C., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+vs.+swarm+detection+of+microparticles+and+exosomes+by+flow+cytometry.">Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry.</a> Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 10 (5), 919-930 (2012).</li><li>Gy&#246;rgy, B., Szab&#243;, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Flow+Cytometric+Assessment+Reveals+Distinct+Microvesicle+(Cell-Derived+Microparticle)+Signatures+in+Joint+Diseases.">Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases.</a> PLoS ONE. 7 (11), e49726 (2012).</li><li>Gy&#246;rgy, B., M&#243;dos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+isolation+of+cell-derived+microparticles+are+compromised+by+protein+complexes+resulting+from+shared+biophysical+parameters.">Detection and isolation of cell-derived microparticles are compromised by protein complexes resulting from shared biophysical parameters.</a> Blood. 117 (4), e39-e48 (2011).</li><li>Gy&#246;rgy, B., Pasztoi, M., Buzas, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response:+systematic+use+of+Triton+lysis+as+a+control+for+microvesicle+labeling.">Response: systematic use of Triton lysis as a control for microvesicle labeling.</a> Blood. 119 (9), 2175-2176 (2012).</li><li>Trummer, A., De Rop, C., Tiede, A., Ganser, A., Eisert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotype+controls+in+phenotyping+and+quantification+of+microparticles:+a+major+source+of+error+and+how+to+evade+it.">Isotype controls in phenotyping and quantification of microparticles: a major source of error and how to evade it.</a> Thrombosis Research. 122 (5), 691-700 (2008).</li><li>Shet, A. S., Aras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sickle+blood+contains+tissue+factor-positive+microparticles+derived+from+endothelial+cells+and+monocytes.">Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes.</a> Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).</li><li>Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D. F., Joseph, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+majority+of+circulating+platelet-derived+microparticles+fail+to+bind+annexin+V,+lack+phospholipid-dependent+procoagulant+activity+and+demonstrate+greater+expression+of+glycoprotein+Ib.">The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib.</a> Thrombosis and Haemostasis. 103 (5), 1044-1052 (2010).</li><li>Nolte-&#8217;t Hoen, E. N. M., van der Vlist, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+flow+cytometric+analysis+of+nanosized+cell-derived+membrane+vesicles.">Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, And Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).</li><li>Van der Vlist, E. J., Nolte-&#8217;t Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li><li>Orozco, A. F., Lewis, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+circulating+microparticles+in+plasma.">Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma.</a> Cytometry Part A. 77 A. 77A (6), 502-514 (2010).</li></ol>

Les auteurs ne ont aucun conflit d&#39;intérêt à divulguer.

Deux protocoles différents pour l&#39;isolement, le traitement et l&#39;analyse des véhicules électriques ont été présentés, soit en utilisant une détection individuelle ou une approche à base de billes. Sélection de la méthode la plus appropriée à utiliser ne est pas toujours simple et nécessite une compréhension de l&#39;échantillon testé ainsi que les sous-populations individuelles d&#39;intérêt. En outre, la sensibilité du cytomètre utilisée pour l&#39;acquisition doit être considéré au mome...

Extracellulaire vésicules (VE) sont de petites vésicules membranaires dérivés trouvés dans les fluides corporels qui sont très impliqués dans la communication cellulaire et aident à réguler un large éventail de processus biologiques. Analyse des véhicules électriques en utilisant la cytométrie de flux (FCM) a été notoirement difficile en raison de leur petite taille et le manque de populations distinctes positifs pour les marqueurs d&#39;intérêt. Méthodes d&#39;analyse des EV, alors considérablement améliorée au cours de la dernière décennie, sont encore un travail en cours. Malheureusement, il n&#39;y a pas de one-size-fits-all protocole, et plusieurs aspects doivent être considérés au moment de déterminer la méthode la plus appropriée à utiliser. Présenté voici plusieurs techniques différentes pour les véhicules électriques de traitement et deux protocoles d&#39;analyse véhicules électriques en utilisant soit la détection individu ou une approche à base de billes. Les méthodes décrites ici vont aider à éliminer les agrégats d&#39;anticorps trouve couramment dans les préparations commerciales, l&#39;augmentation du rapport signal-bruit, et les portes de réglage dans un f rationnelleashion qui minimise la détection de la fluorescence de fond. Le premier protocole utilise une méthode de détection qui est particulièrement bien adapté pour l&#39;analyse d&#39;un volume élevé d&#39;échantillons cliniques, tandis que le second protocole utilise une approche fondée sur bourrelet de capturer et de détecter les plus petits véhicules électriques et des exosomes. VE, aussi connu comme microparticules, sont de petites vésicules membranaires dérivés trouvés dans les fluides corporels qui sont impliqués dans la communication cellulaire et aident à réguler un large éventail de processus biologiques 1. À travers l&#39;expression de différents marqueurs de surface et / ou le transfert direct de matériel biologique, les véhicules électriques sont en mesure de modifier la fonction des cellules réceptrices de jouer soit l&#39;activation ou la suppression de rôles dans la communication intercellulaire 2-4. VE, dérivées des plaquettes cliniquement sont connus pour avoir une forte activité anticoagulante 5, tandis que d&#39;autres ont été montrés pour contribuer à une large gamme de conditions, de la promotion tumorale metasta6 sis à protéger contre la maladie 7. VE peuvent être classés en catégories plus petites vésicules de dérivés de cellules tels que les exosomes et microvésicules (MV), en fonction de leur taille et le mécanisme de génération 8. La nomenclature des sous-populations de vésicules dérivées de cellules continue d&#39;être un sujet de débat en cours 8,9, cependant, les exosomes sont généralement décrits comme petite, de 40 à 100 nm particules provenant de la fusion des endosomes avec la membrane plasmique, tandis que MV sont plus de 100 à 1000 des particules nm formés par l&#39;excrétion de la membrane plasmique 10. Ici, le terme général &quot;VE&quot; sera utilisé pour désigner tous les types de vésicules biologiques extracellulaires libérés par les cellules. Isolement des véhicules électriques à partir de sang entier est une procédure en plusieurs étapes et de nombreuses variables différentes de traitement se sont révélés affecter le contenu EV, y compris la température et la durée de stockage 11,12, anticoagulant / conservateur utilisé 13 etméthode de centrifugation utilisée 14. Un besoin de standardisation de ces variables a abouti à des recommandations de la Société internationale de thrombose et de traitement du sang et d&#39;isolement EV procédures du Comité de normalisation (ISTH SSC) pour le bon Hémostase scientifiques et 15,16, mais il ne existe aucun consensus parmi les chercheurs sur le protocole optimal à utiliser 12. La plupart conviennent, cependant, que les variables pré-analytiques étroitement contrôlées sont cruciales pour les données précises et reproductibles. Afin d&#39;analyser les véhicules électriques, les chercheurs ont utilisé diverses méthodes, y compris la microscopie électronique à transmission 17, la microscopie électronique à balayage 18,19, microscopie à force atomique, la lumière diffusion dynamique de 20,21 et 22,23 western blot. Alors que la FCM est la méthode de choix pour de nombreux chercheurs 9,24 - 26 en raison de ses capacités à haut débit, analyse des véhicules électriques en utilisant la FCM a éténotoirement difficile en raison de leur taille et le manque de populations positifs discrets 27-32. Par rapport à l&#39;analyse des cellules, la petite taille des résultats de SVE en 1) moins de fluorescence émise en raison du nombre inférieur d&#39;antigènes par particule et 2) la faisabilité limitée de post-tache lavage, ce qui est nécessaire pour réduire la fluorescence de fond. Défis communs entre les chercheurs comprennent signaux issus agrégats d&#39;immunoglobulines 27,28 et auto-agrégation des anticorps 29. En outre, les longs délais de traitement et procédures de lavage / d&#39;isolement de longs utilisés par un grand nombre de protocoles actuels 33,34 nécessitent des engagements de temps de plusieurs jours pour analyser un petit nombre d&#39;échantillons, ce qui les rend moins idéal pour les applications à haut débit. Certains chercheurs renoncent à une étape de lavage tout à fait, rendant traditionnellement utilisés contrôles négatifs FCM telles que la fluorescence moins un (FMO) et isotypes d&#39;anticorps inutile pour évaluer précisément bacfluorescence kground 30. Nos protocoles portent sur trois problèmes communs qui peuvent entraver l&#39;analyse de la FCM correcte des véhicules électriques: signaux issus des agrégats d&#39;anticorps et d&#39;autres non-vésicules, de la difficulté à éliminer l&#39;anticorps non lié, et le manque de populations positifs perceptibles. Les techniques décrites ici seront utiles pour éliminer les agrégats d&#39;anticorps on trouve couramment dans les préparations commerciales, l&#39;augmentation du rapport signal-sur-bruit, et la mise en portes de façon rationnelle qui minimise la détection de la fluorescence de fond. Deux méthodes de détection différentes sont présentés ici: le premier protocole utilise une méthode de détection qui est particulièrement bien adapté pour l&#39;analyse d&#39;un volume élevé d&#39;échantillons cliniques, tandis que le second protocole utilise une approche fondée sur des perles-de capturer et de détecter les plus petits véhicules électriques et des exosomes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >LSR II benchtop flow cytometer</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td ></td>
			<td >3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633nm red)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FACS Diva software&#160;</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td ></td>
			<td >PC version 6.0</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FlowJo software&#160;</td>
			<td >Treestar US</td>
			<td ></td>
			<td >Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sphero Rainbow fluorescent particles</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >556298</td>
			<td >used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultra Rainbow fluorescent particles&#160;</td>
			<td >Spherotech</td>
			<td >URFP-10-5</td>
			<td >used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Megmix-Plus SSC beads</td>
			<td >Biocytex</td>
			<td >7803</td>
			<td >used to adjust FSC and SSC&#160; voltages to maintain&#160; consistency&#160; between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AbC Anti-Mouse Bead Kit</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >A-10344</td>
			<td >used for compensation controls &#38; negative AbC beads used for beads-based method</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9)</td>
			<td >Santa Cruz&#160;</td>
			<td >sc-281108</td>
			<td >used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD TruCOUNT Tubes</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >340334</td>
			<td >used whenver absolute EV concentrations are needed</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultrafree-MC, GV 0.22 &#181;m Centrifugal Filter Units</td>
			<td >Millipore&#160;</td>
			<td >UFC30GVNB</td>
			<td >used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >364606</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Facs tubes 12x75 polystrene</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >352058</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50mL Reservoirs individually wrapped&#160;</td>
			<td >Phenix</td>
			<td >RR-50-1s</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Green-Pak pipet tips - 10&#181;L</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >GP-L10S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Green-Pak pipet tips -200&#181;L&#160;</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >GP-L250S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Green -Pak pipet tips - 1000&#181;L&#160;</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >GP-L1000S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stable Stack L300 tips presterilized</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >SS-L300S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet-Lite&#160;XLS 8 Channel LTS&#160;Adjustable&#160;Spacer&#160;</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >LA8-300XLS</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96 well tissue culture plates</td>
			<td >E&#38;K Scientific</td>
			<td >EK-20180</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640 Media (without Hepes)</td>
			<td >UCSF Cell Culture Facility</td>
			<td >CCFAE001</td>
			<td >media used for bead-based detection method</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2&#181;m filtered</td>
			<td >UCSF Cell Culture Facility</td>
			<td >CCFAL003</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear</td>
			<td >BECKMAN COULTER INC</td>
			<td >344058</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PANEL I</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD3 PerCP-Cy5.5</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >344808</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD14 APC-Cy7</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >301820</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD16 V450</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >560474</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD28 FITC</td>
			<td >biolegend</td>
			<td >302906</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD152 APC</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >555855</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD19 A700</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >302226</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PANEL II</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD41a PerCP-Cy5.5</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >340930</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD62L APC</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >304810</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD108 PE&#160;</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >552830</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD235a FITC</td>
			<td >biolegend</td>
			<td >349104</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PANEL III</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD11b PE-Cy7</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >301322</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD62p APC</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >304910</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD66b PE&#160;</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >305106</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD15 FITC</td>
			<td >exalpha</td>
			<td >X1496M</td>
			<td >5 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD9 PE</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >555372</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD63 APC</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >353008</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >APC-Cy7 Ms IgG2a, &#954;</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >400230</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry

Extracellulaire vésicules (VE) sont de petites vésicules membranaires dérivés trouvés dans les fluides corporels qui sont très impliqués dans la communication cellulaire et aident à réguler un large éventail de processus biologiques. Analyse des véhicules électriques en utilisant la cytométrie de flux (FCM) a été notoirement difficile en raison de leur petite taille et le manque de populations distinctes positifs pour les marqueurs d&#39;intérêt. Méthodes d&#39;analyse des EV, alors considérablement améliorée au cours de la dernière décennie, sont encore un travail en cours. Malheureusement, il n&#39;y a pas de one-size-fits-all protocole, et plusieurs aspects doivent être considérés au moment de déterminer la méthode la plus appropriée à utiliser. Présenté voici plusieurs techniques différentes pour les véhicules électriques de traitement et deux protocoles d&#39;analyse véhicules électriques en utilisant soit la détection individu ou une approche à base de billes. Les méthodes décrites ici vont aider à éliminer les agrégats d&#39;anticorps trouve couramment dans les préparations commerciales, l&#39;augmentation du rapport signal-bruit, et les portes de réglage dans un f rationnelleashion qui minimise la détection de la fluorescence de fond. Le premier protocole utilise une méthode de détection qui est particulièrement bien adapté pour l&#39;analyse d&#39;un volume élevé d&#39;échantillons cliniques, tandis que le second protocole utilise une approche fondée sur bourrelet de capturer et de détecter les plus petits véhicules électriques et des exosomes.

<html> La figure 1 présente le schéma général de traitement pour l&#39;isolement et la détection des véhicules électriques en utilisant soit la méthode de la tringle ou de la méthode de détection utilisée. Détection individuelle des véhicules électriques utilisant FCM fonctionne bien pour l&#39;analyse de grands véhicules électriques mais la plupart des cytomètres sont pas capables de détecter individuellement des particules aussi petites que les exosomes. Une approche basée bourrelet ...

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Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

De nombreux procédés existent pour la mesure de vésicules extracellulaires (VE) à l&#39;aide de la cytométrie de flux (FCM). Plusieurs aspects doivent être considérés au moment de déterminer la méthode la plus appropriée à utiliser. Deux protocoles de mesure pour les véhicules électriques sont présentés, en utilisant soit la détection individu ou une approche à base de billes.

Techniques pour l&#39;analyse des vésicules extracellulaire par cytométrie en flux

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

techniques-for-analysis-extracellular-vesicles-using-flow

Research

JoVE Journal

Biology

22.9K vues.  Blood Systems Research Institute.  De nombreux procédés existent pour la mesure de vésicules extracellulaires (VE) à l'aide de la cytométrie de flux (FCM). Plusieurs aspects doivent être considérés au moment de déterminer la méthode la plus appropriée à utiliser. Deux protocoles de mesure pour les véhicules électriques sont présentés, en utilisant soit la détection individu ou une approche à base de billes. 

Vidéo: Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Purification cytométrie en flux des cellules de souris méiotique

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Recherche

Biologie

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimisé méthodes de modélisation de coloration et de prolifération pour la surveillance division cellulaire en utilisant des colorants Suivi cellulaires

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

This protocol describes the use of bromodeoxyuridine (BrdU) uptake to permit the temporal tracking of cells that were in S phase at a specific point in time. Addition of DNA dyes and antibody labeling facilitates detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

Suivi temporel de la progression du cycle cellulaire par cytométrie en flux, sans la nécessité pour la synchronisation

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Préparation d&#39;échantillons pour l&#39;analyse de masse Cytométrie

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

LED Thermo Flow &amp;#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

LED Thermo Flow - Optogenetics Combinant avec cytométrie de flux

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Analyse des suspensions de cellules isolées de tissus solides par Spectral cytométrie en flux

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for phenotypic analyses of extracellular vesicles (EV) including exosomes (Exo) in the peripheral blood and other body fluids. The small size of EV mandates the use of dedicated instruments having a detection threshold around 50-100 nm. Alternatively, EV can be bound to latex microbeads that can be detected by FC. Microbeads, conjugated with antibodies that recognize EV-associated markers/Cluster of Differentiation CD63, CD9, and CD81 can be used for EV capture. Exo isolated from CM can be analyzed with or without pre-enrichment by ultracentrifugation. This approach is suitable for EV analyses using conventional FC instruments. Our results demonstrate a linear correlation between Mean Fluorescence Intensity (MFI) values and EV concentration. Disrupting EV through sonication dramatically decreased MFI, indicating that the method does not detect membrane debris. We report an accurate and reliable method for the analysis of EV surface antigens, which can be easily implemented in any laboratory.

The protocol describes a reproducible method designed for use with cell culture supernatants to detect surface epitopes on small extracellular vesicles (EV). It utilizes specific EV immunoprecipitation using beads coupled with antibodies that recognize surface antigen CD9, CD63, and CD81. The method is optimized for downstream flow cytometry analysis.

Analyse par cytométrie en flux de vésicules extracellulaires de médias conditionné par cellule d’écoulement

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

Purification et analyse de Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving area of research. There are many different methods for EV isolation, each with distinct advantages and disadvantages that affect the downstream yield and purity of EVs. Thus, characterizing the EV prep isolated from a given source by a chosen method is important for interpretation of downstream results and comparison of results across laboratories. Various methods exist for determining the size and quantity of EVs, which can be altered by disease states or in response to external conditions. Nanoparticle tracking analysis (NTA) is one of the prominent technologies used for high-throughput analysis of individual EVs. Here, we present a detailed protocol for quantification and size determination of EVs isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma using a breakthrough technology for NTA representing major advances in the field. The results demonstrate that this method can deliver reproducible and valid total particle concentration and size distribution data for EVs isolated from different sources using different methods, as confirmed by transmission electron microscopy. The adaptation of this instrument for NTA will address the need for standardization in NTA methods to increase rigor and reproducibility in EV research.

We demonstrate how to use a novel nanoparticle tracking analysis instrument to estimate the size distribution and total particle concentration of extracellular vesicles isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma.

Analyse de suivi des nanoparticules pour la quantification et la détermination de la taille des vésicules extracellulaires

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and first-generation particle analysis to comprehensive multi-parameter measurements such as nano-flow cytometry (nFCM). nFCM is a form of flow cytometry that utilizes instrumentation specifically designed for nano-particle analysis, allowing for thousands of EVs to be characterized per minute both with and without the use of staining techniques. High resolution side scatter (SS) detection allows for size and concentration to be determined for all biological particles larger than 45 nm, while simultaneous fluorescence (FL) detection identifies the presence of labeled markers and targets of interest. Labeled subpopulations can then be described in quantitative units of particles/mL or as a percentage of the total particles identified by side scatter.
Here, EVs derived from conditioned cell culture media (CCM) are labeled with both a lipid dye, to identify particles with a membrane, and antibodies specific for CD9, CD63, and CD81 as common EV markers. Measurements of comparison material, a concentration standard and a size standard of silica nanospheres, as well as labeled sample material are analyzed in a 1-minute analysis. The software is then used to measure the concentration and size distribution profile of all particles, independent of labeling, before determining the particles that are positive for each of the labels.
Simultaneous SS and FL detection can be utilized flexibly with many different EV sources and labeling targets, both external and internal, describing EV samples in a comprehensive and quantitative manner.

The latest generation of EV characterization tools are capable of single EV analysis across multiple parameters simultaneously. Nano-flow cytometry measures all biological particles larger than 45 nm without labeling and identifies specific characteristics of subpopulations by a variety of fluorescent labeling techniques.

Caractérisation de la protéine transmembranaire d’une vésicule extracellulaire unique par cytométrie nano-flux

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and ...