Los autores desean agradecer a Dale Hirschkorn de Sistemas de Sangre del Instituto de Investigación por su ayuda con citómetro de flujo ajustes del instrumento. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones HL095470 y HL072268 U01 y contratos del Departamento de Defensa W81XWH-10-1-0023 y W81XWH-2-0028.

NOTA: Los siguientes protocolos se han realizado en cumplimiento de todas las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano. Todas las muestras de sujetos humanos se pusieron a prueba en virtud de una junta de revisión institucional (IRB) protocolo -aprobado y con el consentimiento informado de los sujetos. 1. MÉTODO A: Individual Método de detección 1.1) Tratamiento de Muestra de sangre / Aislamiento de vehículos eléctricos <ol><li> Extraer la sangre del donante / paciente en dos tubos de 10 ml de vidrio que contenían 1,5 ml de ACD-Solución A u otro anticoagulante adecuado y proceso inmediatamente (dentro de 30 min max) utilizando el siguiente protocolo de centrifugación diferencial 2-paso. NOTA: Este protocolo producirá aproximadamente 10 ml de plasma pobre en plaquetas (PPP) de los combinados ~ 17 ml de sangre extraídas. Si se necesita más o menos PPP, el número de tubos de sangre recogida se puede ajustar en consecuencia. </li><li> Centrifugar las muestras a 1500 xg durante 10 min a RTpara separar el plasma de la capa leucocitaria y glóbulos rojos. Transferir 1,2 ml alícuotas del sobrenadante de plasma a 1,5 ml tubos de centrífuga, teniendo cuidado de no molestar a las capas inferiores que contienen la capa leucocitaria y glóbulos rojos. </li><li> Giran a 13.000 xg durante 10 min a TA para eliminar las plaquetas y fragmentos de células grandes. Transferir cuidadosamente el PPP, dejando atrás 200 l para evitar alterar el sedimento y añadir el PPP a un nuevo tubo. </li><li> En este punto, utilice PPP inmediatamente para su análisis o transferencia en alícuotas de 1,0 ml a los nuevos tubos de centrífuga de 1,5 ml y se almacena a -80 ° C durante un máximo de dos años para su posterior análisis (consulte la Figura 1A para visión general). </li><li> Si se necesitan EVs purificados para los experimentos funcionales, la transferencia de 6 ml de la PPP a un tubo de ultracentrífuga y añadir 28 ml de 0,2 micras filtrada-solución salina tamponada con fosfato (PBS). Centrifugado durante 60 minutos a 100.000 xg a temperatura ambiente utilizando una ultracentrífuga equipado con un rotor de cubeta oscilante. Aspirar el sobrenadante y resuspender EV peldejar en 1,5 ml de medio. NOTA: Para mayor reproducibilidad, las muestras de sangre deben ser procesadas manera más coherente posible de un donante a. Cualquier variación en el método de aislamiento EV podría afectar significativamente el número y tipo de vehículos eléctricos detectados. </li></ol> 1.2) La preparación de muestras para el análisis NOTA: A partir de ahora, los pasos a hablarlo con un protocolo de alto rendimiento para el análisis de 12 muestras de 14 marcadores en 3 paneles. Sin embargo, otras combinaciones de anticuerpos pueden utilizarse aquí; el protocolo puede ser adaptado para estudiar otras poblaciones EV mediante la sustitución de los marcadores sugeridas para aquellos de interés. <ol><li> Retire 12 muestras del congelador (si se almacena a -80 ° C) y descongelar a 37 ° C. </li><li> Contenido de la pipeta arriba y abajo varias veces para mezclar. Quite 320 l de cada muestra y añadir a la fila superior de una placa de 96 pocillos. NOTA: A multi-así pipeta de ancho ajustable es muy útil para esto y muchas otras medidas en todo el culoay, particularmente cuando el análisis de múltiples muestras a la vez. </li></ol> 1.3) Las muestras de tinción EV <ol><li> Antes de la tinción, filtrar todos los anticuerpos (Abs) para eliminar los agregados, lo que puede causar señales positivas. <ol><li> Combinar anticuerpos para ser utilizados en cada uno de los 3 paneles en 0,22 micras tubos de filtro centrífugas separadas y centrifugar utilizando una centrífuga de ángulo fijo de una sola velocidad (~ 750 xg) a TA durante 2 min o hasta que toda la mezcla de Ab ha pasado a través del filtro y no hay líquido anticuerpo permanece en la superficie del filtro. Tienda cócteles Ab en el refrigerador hasta por dos semanas, pero re-filtro cada vez antes de usar. </li></ol></li><li> Añadir la cantidad apropiada de mezcla Ab filtrada a cada pocillo en la fila 2 (por ejemplo, muestras en Panel I se tiñen con 2 l de cada Ab, por lo que se añadieron un total de 12 l de cóctel Ab filtrada por pozo a remar 2). Consulte la Figura 1B para un esquema del mapa placa sugerido. Repita estos adicións de las filas por debajo si se ejecutan más paneles (en este caso, añadir 8 l / pocillo de cóctel Grupo II a la fila 3 y 11 l / pocillo de cóctel Panel III a la fila 4, consulte Lista de Materiales para la información del panel específico). </li><li> Usando la pipeta multicanal, mezclar las muestras de PPP en la fila 1 de arriba abajo y transferir 100 l de los pozos de la fila 1 a los pocillos de la fila 2. Mezcle arriba y hacia abajo. Cambie las puntas y la repetición, la transferencia de 100 l de la fila 1 a las filas 3 y 4. Incubar a 4 ° C durante 30 minutos. </li></ol> 1.4) MT Lavado Muestras <ol><li> Retire la placa de 96 pocillos de 4 ° C y traslado al gabinete de seguridad biológica. Usando una pipeta multicanal, añadir 220 l de PBS / pocillo a las filas 6-8 (para ser utilizado para el enjuague / lavado de los pocillos que contienen manchado PPP). </li><li> Transferir el contenido de cada pocillo para tubos de filtro centrífugas pre-etiquetados utilizando la pipeta multicanal ajustables en anchura (Para 12 muestras, con 3 paneles de anticuerpos, 12 x 3 = 36 tubos de filtroser necesario). Utilizando los mismos consejos, eliminar 200 l de PBS de las filas de lavado y añadir a los pocillos correspondientes de la que PPP se acaba de quitar. </li><li> Mezclar arriba y hacia abajo para enjuagar los pozos y pasar la solución de enjuague para los mismos filtros a los que se añadió previamente el PPP. Cerrar las tapas de filtros de centrífuga. Cambie las puntas. </li><li> Repita este proceso con las muestras teñidas restantes hasta que todas las muestras teñidas PPP se han transferido junto con sus soluciones de enjuague para filtros centrífugos. </li><li> Transferir los filtros centrífugos a una centrífuga de rotor fijo y centrifugado a 850 xg durante 3 min a TA. NOTA: Asegúrese de que el líquido no se mantiene en la parte superior del filtro. Después de la centrifugación, el filtro debe aparecer ser &quot;seca&quot;, sin capa de fluido visible que queda en la parte superior. Aunque es poco probable, ciertas muestras de PPP pueden requerir un tiempo de centrifugación más tiempo para moverse con eficacia a través del filtro. </li><li> Retire los tubos de filtro centrífugas y volver a la cabina de seguridad biológica.Usando la pipeta multicanal, resuspender las partes superiores de los filtros en 300 l de PBS. Transferir el contenido resuspendidas a tubos pre-etiquetados para su análisis inmediato FCM. NOTA: Es muy importante para mantener la fuerza y ​​el número de depresiones émbolo pipeta consistentes entre muestras para evitar los cambios de muestra a muestra. Esta idealmente debería hacerse utilizando un pipeta electrónica que ha sido programado para pipetear arriba y abajo de un volumen específico (por ejemplo, 280 l) un número exacto de veces (por ejemplo, 8 veces) para cada muestra. </li></ol> 1.5) Configuración citómetro <ol><li> Abra el software FCM. Antes del experimento de configuración, realice la calibración del instrumento diariamente y configuración utilizando cuentas de configuración del instrumento (siguiendo las instrucciones del fabricante). </li><li> Si las muestras EV se han teñido con más de un anticuerpo y múltiples fluorocromos se van a medir a la vez, calcular los valores de compensación como sigue: <ol><li> Añadir 2 gotas de cuentas de compensación de comprobar la valideztubos marcada con (1 tubo para cada anticuerpo conjugado a un fluorocromo) y añadir la cantidad recomendada de anticuerpo. Añadir 2 gotas de bolas de compensación negativos a otro tubo que se utiliza como control de compensación sin teñir. </li><li> Incubar a 4 ° C durante 30 min, se lava con PBS y resuspender en 400 l de PBS. </li><li> Utilizando el citómetro de flujo software incluido con el instrumento, ejecute cada tubo de compensación y ajustar los voltajes fluorescentes para colocar cada pico en aproximadamente 10 4 en una escala log-5 década. Asegúrese de que el pico de fluorescencia es más alta (más brillante) en su propio canal fluorescente en comparación con todos los demás canales, y ajustar los voltajes de los parámetros fluorescentes de nuevo si es necesario. Ejecutar cada tubo borrador manchado individualmente y capturar al menos 5000 eventos por tubo. </li><li> Seleccione el &quot;experimento&quot;, a continuación, seleccione la pestaña &quot;Compensación&quot;, a continuación, seleccione &quot;Calcular Compensación&quot; para aplicar los valores de compensación para todas las muestras. </li></ol></li><li&gt; Ajuste la dispersión frontal (FSC) y la dispersión lateral (SSC) parámetros de tensión a escala logarítmica y seleccione los umbrales más bajos permitidos por el citómetro (FSC = 200 y SSC = 200) para cada uno. </li><li> Mientras se ejecuta un tubo de PBS 0,22 micras filtrada, ajustar los voltajes del FSC y SSC a los valores más altos que excluyen a la mayoría de ruido de fondo (es decir, justo por debajo del umbral de la tensión a la que la tasa de eventos supera 5 eventos / seg). </li><li> A continuación, ejecute un tubo que contiene 0,2 m - 1,0 m perlas, diluidos en PBS si es necesario. En una FCS frente a SSC parcela, dibuja una puerta alrededor de la población de perlas para capturar eventos entre 0,2 micras y 1,0 micras. Por otra parte, en un histograma SSC-H, dibuja una puerta para incluir todos los eventos más pequeños que los 1,0 micras cuentas. </li><li> Ajuste del caudal del citómetro de &quot;Lo&quot; (aproximadamente 8-12 l / min). Usando el tubo de perlas (u otro tubo que contiene una concentración conocida de perlas) ajustar el dial de velocidad de flujo en el citómetro hasta la vísperatasa nt alcanza aproximadamente 200 eventos / seg. Leer todos los tubos de la muestra a la misma velocidad de flujo y el uso de la misma concentración del grano en experimentos futuros para garantizar que los caudales se mantienen consistentes entre las corridas. </li><li> Ejecutar un tubo de partículas fluorescentes arco iris diluidos en PBS. Adquirir 5000 eventos. Registre los valores medios de intensidad para FSC, SSC, y cada canal de color. Utilice estos valores para ajustar los voltajes en los experimentos futuros para asegurar que la intensidad de fluorescencia se mantienen consistentes entre los experimentos. </li></ol> 1.6) Ejemplo de Lectura <ol><li> Establecer velocidad de flujo del citómetro a &quot;Lo&quot; (aproximadamente 8-12 l / min) y ejecutar cada muestra durante exactamente 1 o 2 min. </li><li> Después de la primera lectura, añadir 20 l de 10% de NP-40 a cada muestra, la pipeta arriba y abajo, y volver a leer por la misma cantidad de tiempo (ya sea 1 o 2 min) para permitir la sustracción de eventos positivos detectados en la muestra lisada sobre un marco de tiempo igual. NOTA: Es muy importante que las muestras se mezclaron usando una pipeta en lugar de un vórtice. En nuestra experiencia, vórtice puede causar auto-agregación de algunos anticuerpos, lo que lleva a los acontecimientos positivos EV-imitando. </li><li> Una vez que todas las muestras han sido leídos, exportar todos los archivos .fcs en un archivo independiente que se utilizará para su posterior análisis utilizando el software de análisis FCM. </li></ol> 1.7) Análisis de Datos <ol><li> Abra el software de análisis de FCM. Importar todos los archivos .fcs en un archivo nuevo experimento. </li><li> Abra la cuentas de sólo tubo. En la FSC-A vs SSC-Una parcela, dibuja una puerta alrededor de todas las cuentas de tamaño entre 0,2 micras y 1,0 micras. Esta es la puerta EV. Arrastre para añadir a todas las muestras. </li><li> Utilizando las muestras lisadas como controles negativos, dibujar puertas en el borde de la fluorescencia de fondo en cada canal de fluorescencia utilizado. Arrastre puertas fluorescentes en la puerta EV de cada correspondiente muestra no lisadas. NOTA: En este punto también es útil examinar parcelas de parámetros bi fluorescentes duales. Formas Rocket enel cuadrante de doble positivo (véase la Figura 8), en particular si se conocen los marcadores para residir en tipos de células no relacionadas, puede ser indicativo de artefacto de agregación o otros eventos de vesículas imitando. </li><li> Para cada marcador fluorescente, restar el número de eventos de la muestra zadas por el número de eventos de la muestra no lisadas. Opcionalmente, se divide este número por el número total de vehículos eléctricos dentro de la puerta no lisadas EV para obtener valores positivos%. </li></ol> 2. FORMA B: Método de Cuentas 2.1) Tratamiento de Muestra de sangre / Aislamiento de vehículos eléctricos <ol><li> Consulte el método de procesamiento de sangre descrita en el Método A (Sección 1.1). </li></ol> 2.2) Preparación de muestras para el análisis <ol><li> Si lo desea, fraccionar PPP o EVs ultracentrifugó en exosomas y microvesículas. Añadir 250 l de PPP o EVs ultracentrifugó a 0,22 micras filtros centrífugos y transferir a una centrífuga rotor fijo y giran a 750 xg durante 2 min a TA. NOTA: Asegúrese de que el líquido no se mantiene en la parte superior del filtro. Después de la centrifugación, el filtro debe aparecer ser &quot;seca&quot;, sin capa de fluido visible que queda en la parte superior. Aunque es poco probable, ciertas muestras pueden requerir un tiempo de centrifugación ligeramente más largo para que el fluido se mueva de manera efectiva a través del filtro. </li><li> Lavar sin recubrimiento 6 micras perlas de poliestireno (por ejemplo, cuentas negativas ABC) 2 veces con medio RPMI y volver a suspender en 2 ml. Añadir 6,000 perlas a cada tubo de FACS. Para el tubo de control negativo, añadir 400 l de medio RPMI solo a las perlas. Para el resto de los tubos, añadir 200 l de PPP o EVs ultracentrifugó (o sus fracciones) y 200 l de medio RPMI. </li><li> Ajustar el volumen final de todos los tubos de 400 l con los medios de comunicación y se incuba durante la noche a 4 ° C en un agitador. </li><li> A la mañana siguiente, lavar los granos con 2 ml de medios de comunicación. Aspirar el sobrenadante. </li><li> Bloque con 5% de albúmina de suero bovino (BSA) en los medios (400 l) durante 3 horas a 4 y# 176; C en un agitador. </li><li> Lavar perlas con 2 ml de medios de comunicación. Aspirar y volver a suspender el sedimento en 100 l de medio. </li></ol> 2.3) Las muestras de tinción EV <ol><li> Filtra todos los anticuerpos. Usa los mismos paneles de anticuerpos utilizados en el Método A, o si se desea, crear una combinación diferente de anticuerpos siempre y cuando sus fluorocromos son compatibles uno con el otro. </li><li> Combinar todos los anticuerpos que se utilizarán en un único panel en un tubo de filtro de centrífuga 0,22 micras. Centrifugar el uso de un ángulo fijo de centrífuga de una sola velocidad durante 2 min o hasta que toda la mezcla de Ab ha pasado a través del filtro y el líquido no anticuerpo permanece en la superficie del filtro. </li><li> Añadir volumen apropiado de cóctel de anticuerpos se filtró a todos los tubos y se incuba durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Lavar perlas con 2 ml de medio, resuspender en 400 l de los medios de comunicación y ejecutar inmediatamente (o dentro del mismo día) en citómetro de flujo. </li></ol> 2.4) citómetro de configuración y la Muestra de Lectura<ol><li> Abra el software FCM. Antes del experimento de configuración, realice la calibración del instrumento diariamente y configuración utilizando cuentas de configuración del instrumento (siguiendo las instrucciones del fabricante). </li><li> Si las muestras EV se han teñido con más de un anticuerpo y múltiples fluorocromos se van a medir a la vez, calcular los valores de compensación como sigue: <ol><li> Añadir 2 gotas de cuentas de compensación para tubos pre-etiquetados (1 tubo para cada anticuerpo conjugado a un fluorocromo) y agregue la cantidad recomendada de anticuerpo. Añadir 2 gotas de bolas de compensación negativos a otro tubo que se utiliza como control de compensación sin teñir. Incubar a 4 ° C durante 30 min, se lava con PBS y resuspender en 400 l de PBS. </li><li> Usando el software FCM, ejecute cada tubo de compensación y ajustar los voltajes fluorescentes para colocar cada pico en aproximadamente 10 4 en una escala log-5 década. Asegúrese de que el pico de fluorescencia es más alto (el más brillante) en su propio canal fluorescente en comparación con todos los demás canales, yajustar las tensiones de los parámetros fluorescentes de nuevo si es necesario. Ejecutar cada tubo borrador manchado individualmente y capturar al menos 5000 eventos por tubo. </li><li> Seleccione la pestaña &quot;Experimento&quot;, luego &quot;Compensación&quot;, luego &quot;Calcular Compensación&quot; para aplicar los valores de compensación para todas las muestras. </li></ol></li><li> Cambie el FSC y parámetros de tensión SSC a escala logarítmica y seleccione los umbrales más bajos permitidos por el citómetro (FSC = 200 y SSC = 200) para cada uno. </li><li> Muestras Ejecutar, puerta sobre la población cuentas singlete y adquieren 2.000 eventos en esta puerta. Exportar archivos .fcs. </li><li> Utilice el software de análisis FCM para analizar .fcs archivos. Puerta en cuentas singlete. Calcular la intensidad de fluorescencia media geométrica (MFI) para cada fluorocromo y comparar con el MFI del control negativo. </li></ol>

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M., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+discovery+of+21+proteins+expressed+in+human+plasma-derived+but+not+platelet-derived+microparticles.">Proteomic discovery of 21 proteins expressed in human plasma-derived but not platelet-derived microparticles.</a> Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 67-80 (2007).</li><li>Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+Limitations+of+Microparticle+Measurement+by+Flow+Cytometry.">Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (08), 807-818 (2010).</li><li>Mobarrez, F., Antovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolor+flow+cytometric+assay+for+measurement+of+platelet-derived+microparticles.">A multicolor flow cytometric assay for measurement of platelet-derived microparticles.</a> Thrombosis Research. 125 (3), e110-e116 (2010).</li><li>Van der Pol, E., van Gemert, M. J. C., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+vs.+swarm+detection+of+microparticles+and+exosomes+by+flow+cytometry.">Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry.</a> Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 10 (5), 919-930 (2012).</li><li>Gy&#246;rgy, B., Szab&#243;, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Flow+Cytometric+Assessment+Reveals+Distinct+Microvesicle+(Cell-Derived+Microparticle)+Signatures+in+Joint+Diseases.">Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases.</a> PLoS ONE. 7 (11), e49726 (2012).</li><li>Gy&#246;rgy, B., M&#243;dos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+isolation+of+cell-derived+microparticles+are+compromised+by+protein+complexes+resulting+from+shared+biophysical+parameters.">Detection and isolation of cell-derived microparticles are compromised by protein complexes resulting from shared biophysical parameters.</a> Blood. 117 (4), e39-e48 (2011).</li><li>Gy&#246;rgy, B., Pasztoi, M., Buzas, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response:+systematic+use+of+Triton+lysis+as+a+control+for+microvesicle+labeling.">Response: systematic use of Triton lysis as a control for microvesicle labeling.</a> Blood. 119 (9), 2175-2176 (2012).</li><li>Trummer, A., De Rop, C., Tiede, A., Ganser, A., Eisert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotype+controls+in+phenotyping+and+quantification+of+microparticles:+a+major+source+of+error+and+how+to+evade+it.">Isotype controls in phenotyping and quantification of microparticles: a major source of error and how to evade it.</a> Thrombosis Research. 122 (5), 691-700 (2008).</li><li>Shet, A. S., Aras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sickle+blood+contains+tissue+factor-positive+microparticles+derived+from+endothelial+cells+and+monocytes.">Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes.</a> Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).</li><li>Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D. F., Joseph, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+majority+of+circulating+platelet-derived+microparticles+fail+to+bind+annexin+V,+lack+phospholipid-dependent+procoagulant+activity+and+demonstrate+greater+expression+of+glycoprotein+Ib.">The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib.</a> Thrombosis and Haemostasis. 103 (5), 1044-1052 (2010).</li><li>Nolte-&#8217;t Hoen, E. N. M., van der Vlist, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+flow+cytometric+analysis+of+nanosized+cell-derived+membrane+vesicles.">Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, And Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).</li><li>Van der Vlist, E. J., Nolte-&#8217;t Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li><li>Orozco, A. F., Lewis, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+circulating+microparticles+in+plasma.">Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma.</a> Cytometry Part A. 77 A. 77A (6), 502-514 (2010).</li></ol>

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses a revelar.

Se presentaron dos protocolos diferentes para el aislamiento, tratamiento y análisis de EVs, utilizando ya sea un individuo o de detección de enfoque basado en perlas. Al seleccionar el método más apropiado utilizar no siempre es sencillo y requiere una comprensión de la muestra a analizar, así como las subpoblaciones individuales de interés. Además, la sensibilidad de la citómetro utilizado para la adquisición se debe considerar al elegir el método más apropiado. A menudo no existe una única mejor protocol...

Extracelular vesículas (EVs) son vesículas pequeñas, provenientes de las membranas que se encuentran en los fluidos corporales que son altamente involucrados en la comunicación celular y ayudan a regular una amplia gama de procesos biológicos. Análisis de los vehículos eléctricos utilizando citometría de flujo (FCM) ha sido notoriamente difícil debido a su pequeño tamaño y falta de poblaciones discretas positivos para los marcadores de interés. Métodos para el análisis EV, mientras mejorado considerablemente en la última década, son todavía un trabajo en progreso. Desafortunadamente, no hay una talla única para todos los protocolos, y varios aspectos deben ser considerados al determinar el método más apropiado para su uso. Aquí se presentan son varias técnicas diferentes para vehículos eléctricos de procesamiento y dos protocolos para el análisis de los vehículos eléctricos usando la detección de individuo o de un enfoque basado en perlas. Los métodos descritos aquí se ayudar con la eliminación de los agregados de anticuerpos que se encuentran comúnmente en las preparaciones comerciales, el aumento de la relación señal-ruido y la configuración de las puertas en una f racionalashion que minimiza la detección de la fluorescencia de fondo. El primer protocolo utiliza un método de detección individual que es especialmente adecuado para el análisis de un gran volumen de muestras clínicas, mientras que el segundo protocolo utiliza un enfoque basado en perlas para capturar y detectar los vehículos eléctricos y los exosomas más pequeñas. Vehículos eléctricos, también conocidas como micropartículas, son vesículas pequeñas, provenientes de las membranas que se encuentran en los fluidos corporales que están involucrados en la comunicación celular y ayudan a regular una amplia gama de procesos biológicos 1. A través de la expresión de diversos marcadores de superficie y / o transferencia directa de material biológico, los vehículos eléctricos son capaces de alterar la función de las células receptoras para jugar ya sea activar o suprimir funciones en la comunicación intercelular 2-4. EVs Clínicamente, los derivados de las plaquetas se sabe que tienen una fuerte actividad anticoagulante 5, mientras que otros han demostrado que contribuyen a una amplia gama de condiciones, desde la promoción metasta tumorsis 6 a proteger contra la enfermedad 7. EVs se pueden clasificar en categorías más pequeñas de las vesículas derivadas de células tales como los exosomas y microvesículas (MVs), dependiendo de su tamaño y el mecanismo de la generación de 8. La nomenclatura de las subpoblaciones de vesículas derivadas de células sigue siendo un tema de debate en curso 8,9, sin embargo, los exosomas se describen generalmente como pequeñas, de 40 a 100 nm partículas derivadas de la fusión endosomal con la membrana plasmática, mientras que MVs son más grandes de 100 a 1000 partículas nm formadas por el desprendimiento de la membrana plasmática 10. Aquí, el término general &quot;vehículos eléctricos&quot; se utiliza para referirse a todos los tipos de vesículas biológicos extracelulares liberados por las células. Aislamiento de los vehículos eléctricos de la sangre entera es un procedimiento multi-etapa y se han mostrado muchos diferentes variables de proceso para afectar el contenido EV, incluyendo la temperatura de almacenamiento y la duración 11,12, anticoagulante / conservante utilizado 13 ymétodo de centrifugación utilizado 14. Una necesidad de estandarización de estas variables ha llevado a las recomendaciones de la Sociedad Internacional de Trombosis y procesamiento de la sangre y de aislamiento EV procedimientos Hemostasia Comité Científico y Normalización (ISTH SSC) para su correcto 15,16, todavía no existe un consenso entre los investigadores sobre el protocolo óptimo para utilizar 12. La mayoría coincide, sin embargo, que las variables pre-analíticos muy controladas son cruciales para los datos exactos y reproducibles. Para el análisis de los vehículos eléctricos, los investigadores han utilizado diversos métodos, incluyendo la microscopía electrónica de transmisión 17, microscopía electrónica de barrido 18,19, microscopía de fuerza atómica, luz dinámica de dispersión 20,21 y occidental blot 22,23. Mientras FCM es el método de elección para muchos investigadores 9,24 - 26 debido a sus capacidades de alto rendimiento, el análisis de los vehículos eléctricos utilizando FCM ha sidonotoriamente difícil debido a su tamaño y falta de poblaciones positivas discretos 27-32. En comparación con el análisis de las células, el pequeño tamaño de los EVs resultados en 1) menos fluorescencia emitida debido al menor número de antígenos por partícula y 2) la viabilidad limitada de lavado post-mancha, que es necesaria para reducir la fluorescencia de fondo. Los desafíos comunes entre los investigadores incluyen señales que surgen de agregados de inmunoglobulinas 27,28 y auto-agregación de anticuerpos 29. Además, los tiempos de procesamiento largos y largos procedimientos de lavado / aislamiento utilizados por muchos de los protocolos actuales 33,34 requieren compromisos de tiempo de varios días para analizar un pequeño número de muestras, haciendo que sea menos que ideal para aplicaciones de alto rendimiento. Algunos investigadores renuncian a un paso de lavado completo, haciendo controles negativos FCM utilizados tradicionalmente como menos fluorescencia uno (FMO) y isotipos de anticuerpos inútil para evaluar con precisión bacfluorescencia kground 30. Nuestros protocolos abordan tres problemas comunes que pueden impedir el análisis FCM adecuado de los vehículos eléctricos: Las señales derivadas de los agregados de anticuerpos y otros no-vesículas, dificultad para eliminar el anticuerpo no unido, y la falta de poblaciones positivos perceptibles. Las técnicas descritas aquí serán ayudar con la eliminación de los agregados de anticuerpos que se encuentran comúnmente en las preparaciones comerciales, relación señal a ruido creciente, y el establecimiento de puertas de una manera racional que minimiza la detección de la fluorescencia de fondo. Dos métodos de detección diferentes se presentan aquí: el primer protocolo utiliza un método de detección individual que es especialmente adecuado para el análisis de un gran volumen de muestras clínicas, mientras que el segundo protocolo utiliza un enfoque basado en perlas para capturar y detectar los vehículos eléctricos y los exosomas más pequeñas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >LSR II benchtop flow cytometer</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td ></td>
			<td >3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633nm red)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FACS Diva software&#160;</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td ></td>
			<td >PC version 6.0</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FlowJo software&#160;</td>
			<td >Treestar US</td>
			<td ></td>
			<td >Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sphero Rainbow fluorescent particles</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >556298</td>
			<td >used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultra Rainbow fluorescent particles&#160;</td>
			<td >Spherotech</td>
			<td >URFP-10-5</td>
			<td >used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Megmix-Plus SSC beads</td>
			<td >Biocytex</td>
			<td >7803</td>
			<td >used to adjust FSC and SSC&#160; voltages to maintain&#160; consistency&#160; between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AbC Anti-Mouse Bead Kit</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >A-10344</td>
			<td >used for compensation controls &#38; negative AbC beads used for beads-based method</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9)</td>
			<td >Santa Cruz&#160;</td>
			<td >sc-281108</td>
			<td >used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD TruCOUNT Tubes</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >340334</td>
			<td >used whenver absolute EV concentrations are needed</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultrafree-MC, GV 0.22 &#181;m Centrifugal Filter Units</td>
			<td >Millipore&#160;</td>
			<td >UFC30GVNB</td>
			<td >used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >364606</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Facs tubes 12x75 polystrene</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >352058</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50mL Reservoirs individually wrapped&#160;</td>
			<td >Phenix</td>
			<td >RR-50-1s</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Green-Pak pipet tips - 10&#181;L</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >GP-L10S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Green-Pak pipet tips -200&#181;L&#160;</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >GP-L250S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Green -Pak pipet tips - 1000&#181;L&#160;</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >GP-L1000S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stable Stack L300 tips presterilized</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >SS-L300S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet-Lite&#160;XLS 8 Channel LTS&#160;Adjustable&#160;Spacer&#160;</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >LA8-300XLS</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96 well tissue culture plates</td>
			<td >E&#38;K Scientific</td>
			<td >EK-20180</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640 Media (without Hepes)</td>
			<td >UCSF Cell Culture Facility</td>
			<td >CCFAE001</td>
			<td >media used for bead-based detection method</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2&#181;m filtered</td>
			<td >UCSF Cell Culture Facility</td>
			<td >CCFAL003</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear</td>
			<td >BECKMAN COULTER INC</td>
			<td >344058</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PANEL I</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD3 PerCP-Cy5.5</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >344808</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD14 APC-Cy7</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >301820</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD16 V450</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >560474</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD28 FITC</td>
			<td >biolegend</td>
			<td >302906</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD152 APC</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >555855</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD19 A700</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >302226</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PANEL II</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD41a PerCP-Cy5.5</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >340930</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD62L APC</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >304810</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD108 PE&#160;</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >552830</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD235a FITC</td>
			<td >biolegend</td>
			<td >349104</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PANEL III</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD11b PE-Cy7</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >301322</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD62p APC</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >304910</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD66b PE&#160;</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >305106</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD15 FITC</td>
			<td >exalpha</td>
			<td >X1496M</td>
			<td >5 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD9 PE</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >555372</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD63 APC</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >353008</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >APC-Cy7 Ms IgG2a, &#954;</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >400230</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry

Extracelular vesículas (EVs) son vesículas pequeñas, provenientes de las membranas que se encuentran en los fluidos corporales que son altamente involucrados en la comunicación celular y ayudan a regular una amplia gama de procesos biológicos. Análisis de los vehículos eléctricos utilizando citometría de flujo (FCM) ha sido notoriamente difícil debido a su pequeño tamaño y falta de poblaciones discretas positivos para los marcadores de interés. Métodos para el análisis EV, mientras mejorado considerablemente en la última década, son todavía un trabajo en progreso. Desafortunadamente, no hay una talla única para todos los protocolos, y varios aspectos deben ser considerados al determinar el método más apropiado para su uso. Aquí se presentan son varias técnicas diferentes para vehículos eléctricos de procesamiento y dos protocolos para el análisis de los vehículos eléctricos usando la detección de individuo o de un enfoque basado en perlas. Los métodos descritos aquí se ayudar con la eliminación de los agregados de anticuerpos que se encuentran comúnmente en las preparaciones comerciales, el aumento de la relación señal-ruido y la configuración de las puertas en una f racionalashion que minimiza la detección de la fluorescencia de fondo. El primer protocolo utiliza un método de detección individual que es especialmente adecuado para el análisis de un gran volumen de muestras clínicas, mientras que el segundo protocolo utiliza un enfoque basado en perlas para capturar y detectar los vehículos eléctricos y los exosomas más pequeñas.

<html> La Figura 1 describe el esquema general de procesamiento para el aislamiento y la detección de los vehículos eléctricos utilizando el método basado en perlas o método de detección individual. Detección individual de los vehículos eléctricos utilizando FCM trabaja bien para el análisis de los vehículos eléctricos más grandes, pero la mayoría de citómetros no son capaces de detectar individualmente partículas tan pequeñas como exosomas. Un enfoque basado en perlas permite pequeños ...

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Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Existen muchos métodos diferentes para la medición de las vesículas extracelulares (SVE) utilizando citometría de flujo (FCM). Varios aspectos deben ser considerados al determinar el método más apropiado para su uso. Se presentan dos protocolos para vehículos eléctricos de medición, usando la detección de individuo o de un enfoque basado en perlas.

Técnicas para el Análisis de extracelular vesículas Usando citometría de flujo

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

techniques-for-analysis-extracellular-vesicles-using-flow

Research

JoVE Journal

Biology

23.0K vistas.  Blood Systems Research Institute.  Existen muchos métodos diferentes para la medición de las vesículas extracelulares (SVE) utilizando citometría de flujo (FCM). Varios aspectos deben ser considerados al determinar el método más apropiado para su uso. Se presentan dos protocolos para vehículos eléctricos de medición, usando la detección de individuo o de un enfoque basado en perlas. 

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Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Citometría de flujo de purificación de las células de ratón meiótica

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Investigación

Biología

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimizado manchas y Proliferación métodos de modelización para la vigilancia del uso de tintes División Celular Celulares de seguimiento

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Spermatozoa are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be prepared to face a constantly changing environment and to overcome several physical barriers. Being in essence transcriptionally and translationally silent, these motile cells rely profoundly on diverse signaling mechanisms to orient themselves and swim in a directed fashion, and to contend with challenging environmental conditions during their journey to find the egg. In particular, Ca2+-mediated signaling is pivotal for several sperm functions: activation of motility, capacitation (a complex process that prepares sperm for the acrosome reaction) and the acrosome reaction (an exocytotic event that allows sperm-egg fusion). The use of fluorescent dyes to track intracellular fluctuations of this ion is of remarkable importance due to their ease of application, sensitivity, and versatility of detection. Using one single dye-loading protocol we utilize four different fluorometric techniques to monitor sperm Ca2+ dynamics. Each technique provides distinct information that enables spatial and/or temporal resolution, generating data both at single cell and cell population levels.

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Intracellular Ca2+ dynamics are very important in sperm physiology and Ca2+-sensitive fluorescent dyes constitute a versatile tool to study them. Population experiments (fluorometry and stopped flow fluorometry) and single cell experiments (flow cytometry and single cell imaging) are used to track spatio-temporal [Ca2+] changes in human sperm cells.

Medición de Ca intracelular<sup&gt; 2 +</sup&gt; Cambios en el esperma humano mediante cuatro técnicas: Fluorometría convencional, se detuvo Fluorometría Flow, citometría de flujo y Single imágenes de células

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

This protocol describes the use of bromodeoxyuridine (BrdU) uptake to permit the temporal tracking of cells that were in S phase at a specific point in time. Addition of DNA dyes and antibody labeling facilitates detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

Seguimiento temporal de la progresión del ciclo celular El uso de citometría de flujo sin la necesidad de sincronización

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Preparación de muestras para análisis de masas Citometría

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

LED Thermo Flow &amp;#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

Thermo LED Flujo - Combinando optogenética con Citometría de Flujo

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Análisis de suspensiones celulares aisladas de tejidos sólidos por Spectral Citometría de Flujo

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for phenotypic analyses of extracellular vesicles (EV) including exosomes (Exo) in the peripheral blood and other body fluids. The small size of EV mandates the use of dedicated instruments having a detection threshold around 50-100 nm. Alternatively, EV can be bound to latex microbeads that can be detected by FC. Microbeads, conjugated with antibodies that recognize EV-associated markers/Cluster of Differentiation CD63, CD9, and CD81 can be used for EV capture. Exo isolated from CM can be analyzed with or without pre-enrichment by ultracentrifugation. This approach is suitable for EV analyses using conventional FC instruments. Our results demonstrate a linear correlation between Mean Fluorescence Intensity (MFI) values and EV concentration. Disrupting EV through sonication dramatically decreased MFI, indicating that the method does not detect membrane debris. We report an accurate and reliable method for the analysis of EV surface antigens, which can be easily implemented in any laboratory.

The protocol describes a reproducible method designed for use with cell culture supernatants to detect surface epitopes on small extracellular vesicles (EV). It utilizes specific EV immunoprecipitation using beads coupled with antibodies that recognize surface antigen CD9, CD63, and CD81. The method is optimized for downstream flow cytometry analysis.

Análisis Cytometric del vesículas extracelulares de medios acondicionado de célula de flujo

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

Purificación y análisis de las vesículas extracelulares de Caenorhabditis elegans

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving area of research. There are many different methods for EV isolation, each with distinct advantages and disadvantages that affect the downstream yield and purity of EVs. Thus, characterizing the EV prep isolated from a given source by a chosen method is important for interpretation of downstream results and comparison of results across laboratories. Various methods exist for determining the size and quantity of EVs, which can be altered by disease states or in response to external conditions. Nanoparticle tracking analysis (NTA) is one of the prominent technologies used for high-throughput analysis of individual EVs. Here, we present a detailed protocol for quantification and size determination of EVs isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma using a breakthrough technology for NTA representing major advances in the field. The results demonstrate that this method can deliver reproducible and valid total particle concentration and size distribution data for EVs isolated from different sources using different methods, as confirmed by transmission electron microscopy. The adaptation of this instrument for NTA will address the need for standardization in NTA methods to increase rigor and reproducibility in EV research.

We demonstrate how to use a novel nanoparticle tracking analysis instrument to estimate the size distribution and total particle concentration of extracellular vesicles isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma.

Análisis de seguimiento de nanopartículas para la cuantificación y determinación del tamaño de vesículas extracelulares

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...