Name: techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry
Uploaded: 2015-03-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
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著者は、機器の設定、フローサイトメーターとの彼の助けのための血液システム開発センターからデイルHirschkornに感謝したいと思います。この作品は、NIHの助成金HL095470とU01 HL072268と国防総省の契約W81XWH-10-1-0023とW81XWH-2から0028によってサポートされていました。

注：以下のプロトコルが人間の福祉のためにすべての、制度的、国内および国際的なガイドラインを遵守して行われてきた。すべてのヒト被験サンプルは、治験審査委員会（IRB）承認のプロトコルの下で被験者のインフォームドコンセントを用いて試験した。 1.方法A：個々の検出方法 EVの血液サンプル/単離の1.1）処理<ol><li>以下の2段階の分画遠心プロトコルを使用して（30分以内に最大）直ちにACD-A液1.5 mlまたは他の適当な抗凝固剤及びプロセスを含む2つの10 mlのガラスチューブ中にドナー/患者から血液を引き込む。 注：このプロトコルは、採取した血液の組み合わせ〜17ミリリットルから約10ミリリットル乏血小板血漿（PPP）のが得られます。多かれ少なかれPPPが必要な場合には、採血管の数は、それに応じて調整することができる。 </li><li> RTで10分間1500×gでサンプルを遠心軟膜と赤血球から血漿を分離する。軟膜と赤の細胞を含む下層を乱さないように注意しながら、1.5ミリリットル遠心管にプラズマ上清1.2mlのアリコートを転送します。 </li><li>血小板および大型細胞片を除去し、室温で10分間、13000×gでスピン。慎重にペレットを乱さないよう、新しいチューブにPPPを追加するために、200μlの後ろに残して、PPPを転送する。 </li><li>この時点で、後の分析のために、最大2つの年（概要については、 図1Aを参照）のために、-80℃で分析したり、新しい1.5ミリリットル遠心管に1.0ミリリットル分量で転送して保存のためにすぐにPPPを使用しています。 </li><li>精製された電気自動車は、機能的実験のために必要な場合、超遠心管にPPPの転送6ミリリットルし、0.2μm濾過したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）28mlを追加します。スイングバケットローターを備えた超遠心機を使用してRT 100,000×gで60分間スピン。上清を吸引し再懸濁EVペル1.5ミリリットルのメディアでみましょう。 注：最高の再現性のために、血液サンプルをドナーにドナーからのように一貫して可能な限り処理されるべきである。 EV分離法における任意の変動が大きく、検出EVの数と種類に影響を与える可能性がある。 </li></ol> 1.2）分析のためのサンプルを調製注：この時点から、ステップは3つのパネルで14マーカーの12個のサンプルを分析するためのハイスループットプロトコルを説明する。しかし、抗体の他の組み合わせは、ここで使用することができる。プロトコルは、関心のあるそれらのために提案マーカーを置換することによって、他のEV集団を研究するために適合させることができる。 <ol><li> （-80℃で保存した場合）冷凍庫から12のサンプルを取り出し、37℃で解凍。 </li><li>ピペットの内容を上下に数回混合する。各サンプルから320μlのを削除し、96ウェルプレートの一番上の行に追加します。 注：幅調節可能なマルチウェルピペットは、このとお尻の多くの他のステップのために非常に便利です一度に複数のサンプルを分析する場合は特に、AY。 </li></ol> 1.3）染色EVのサンプル<ol><li>染色前に、陽性シグナルが発生する可能性があり、凝集体を除去するためにすべての抗体（ABS）をフィルタリングする。 <ol><li> 2分間、室温で固定角度シングルスピード遠心分離機（〜750×gで）を使用して別個の0.22μmの遠心フィルターチューブと遠心分離機に3パネルの各々に使用される抗体を結合、または抗体の混合物のすべてがフィルターを通過するまでと全く抗体液がフィルターの表面上に残っていない。ストアのAb 2週間まで冷蔵庫でカクテルが、再フィルタ使用前に毎回。 </li></ol></li><li>よく行2の各フィルタのAb混合物の適切な量を追加します（ 例えば 、私はそれぞれのAbの2μLで染色されているパネルのサンプルは、そのようにフィルタリングのAbカクテル12μlの合計は、2行するウェルに添加されている）。提案のプレートマップの概要については、図1（b）を参照してください。これらの追加を繰り返します以上のパネルが実行された場合の下の行へのS（ここでは、ウェル4を行にパネルIIIカクテルの3及び11μL/行する8μL/ウェルパネルIIカクテルの追加、特定のパネル情報のための材料リストを参照してください）​​。 </li><li>マルチチャンネルピペットを用いて、上下の行1にPPPのサンプルを混合し、2ミックス上下の行のウェルに、行1のウェルから100μlを移す。ヒントを変更して、繰り返して、30分間の行4℃で3と4のインキュベートに行1から100μLを転送する。 </li></ol> 1.4）洗浄MVサンプル<ol><li> 4℃から96ウェルプレートを取り外し、生物学的安全キャビネットに移す。マルチチャンネルピペットを用いて、6-8（ステンドPPPを含むウェルを洗浄/すすぎのために使用される）の行に/ウェルのPBS 220μlを添加する。 </li><li>抗体の3つのパネル、12×3 = 36フィルターチューブで、12サンプルについて幅が調整可能なマルチチャンネルピペットを（使用して予め標識遠心フィルターチューブに、各ウェルの内容を転送します）が必要とされる。同じヒントを使用して、洗浄行から200μlのPBSを除去し、PPPがちょうど除去された対応するウェルに追加します。 </li><li>アップミックスダウン井戸をすすぎ、PPPが以前に添加した同じフィルタにリンス液を転送する。遠心分離フィルターのクローズトップス。変更のヒント。 </li><li>すべての染色のPPP試料は遠心分離フィルターへのリンスソリューションと一緒に転送されるまで、残りの染色したサンプルで、このプロセスを繰り返します。 </li><li> RTで3分間850×gで固定されたロータの遠心機とスピンに遠心分離フィルターを転送します。 注：液体がフィルターのトップスに残っていないことを確認してください。遠心分離した後、フィルターを上に残っている目に見える流体層と「ドライ」であることが表示されます。そうしながら、特定のPPPサンプルが効果的にフィルターを介して移動するために、より長い遠心分離時間が必要な場合があります。 </li><li>遠心フィルターチューブを外し、生物学的安全キャビネットに戻る。マルチチャンネルピペットを用いて、PBS300μlのフィルターのトップを懸濁します。再懸濁内容が即時のFCM解析のためのチューブを標識事前に転送します。 注：これは、サンプル間の変動を避けるために、サンプル間で一貫ピペットプランジャ窪みの力と数を維持することが非常に重要である。これは、理想的にピペッティングし、各サンプルのために特定のボリューム（ 例えば 、280μl）を正確な回数（ 例えば 、8回）上下するようにプログラムされた電子ピペットを用いて行われるべきである。 </li></ol> 1.5）サイトメーターのセットアップ<ol><li> FCMソフトウェアを開きます。 （製造者の指示に従って）機器のセットアップビーズを使用して毎日の機器較正およびセットアップを実行し、セットアップを実験の前に。 </li><li> EVサンプルは、複数の抗体で染色されており、複数の蛍光色素を一度に測定する場合、次のように、補正値を算出する。 <ol><li>事前に補償ビーズの2滴を追加します。チューブ（各蛍光標識抗体のための1管）標識抗体の、推奨量を追加します。染色していない補償制御として使用する別のチューブに負の補償ビーズの2滴を追加します。 </li><li> PBS400μlのPBSに再懸濁で洗浄し、30分間4℃でインキュベートする。 </li><li>楽器に付属のソフトウェアフローサイトメーターを用いて、各補償チューブを実行し、5-十年のログスケールで約10 4で各ピークを配置するために、蛍光電圧を調整します。蛍光ピークは、他のすべてのチャネルと比較して、独自の蛍光チャネルにおいて（最も明るい）が最も高く、かつ必要に応じて再度蛍光パラメータの電圧を調整すること。確実に各個別に染色されたCOMPチューブを実行し、チューブあたり少なくとも5000のイベントをキャプチャします。 </li><li>その後選択して &quot;、実験」タブを選択し、「報酬」を、すべてのサンプルに補正値を適用するために「計算補正」を選択します。 </li></ol></li><li&gt;スケールをログに記録し、それぞれのサイトメーター（FSC = 200およびSSC = 200）で許可されている最低のしきい値を選択するための前方散乱（FSC）および側方散乱（SSC）は、電圧パラメータを設定します。 </li><li> 0.22μmのフィルターPBSのチューブの実行中に、（ すなわち 、単にイベント発生率が5イベント/秒を上回るなる電圧閾値より下）バックグラウンドノイズの大部分を排除し、最も高い値にFSC＆SSC電圧を調整します。 </li><li>必要に応じて、PBSで希釈した1.0μmのビーズ、 - 次に、0.2ミクロンを含むチューブを実行します。 SSCプロット対FCSでは、0.2〜1.0μmの間でイベントをキャプチャするためにビーズ集団の周りにゲートを描きます。また、SSC-Hヒストグラムで、1.0μmのビーズよりも小さいすべてのイベントが含まれるようにゲートを描く。 </li><li> 「LO」（約8〜12μL/分）にサイトメーターの流量を設定します。ビーズチューブ（またはビーズの既知の濃度を含有する他のチューブ）を使用する直前まで、フローサイトメーター上での流量調整ツマミntの速度は約200イベント/秒に達する。同じ流速で、すべてのサンプル管を読み、その流速が実行間の一貫性を維持確保するために将来の実験で同じビーズ濃度を使用しています。 </li><li> PBSで希釈した虹の蛍光粒子のチューブを実行します。 5000のイベントを取得します。 FSC、SSC、および各カラーチャンネルの平均強度値を記録します。蛍光強度は、実験間の整合性を保つことを保証するために将来の実験で電圧を調整するために、これらの値を使用してください。 </li></ol> 1.6）サンプル読書<ol><li> 「LO」（約8〜12μL/分）にサイトメーターの流量を設定し、正確に1または2分間、各サンプルを実行します。 </li><li>最初の読み取りの後、各サンプルに10％のNP-40の20μlを添加、ピペット上下、及びで検出された陽性事象の減算を可能にするために同じ時間（1または2分）再読み込み同じ時間枠で溶解サンプル。 注：それは非常にIMPですサンプルはピペットのではなく、ボルテックスを用いて混合することがortant。我々の経験では、ボルテ​​ックスはEV-模倣陽性事象につながる、いくつかの抗体の自己凝集を引き起こす可能性があります。 </li><li>一旦全てのサンプルが読み取られてからFCM解析ソフトウェアを使用してさらに分析するために使用される別のファイルにすべて.fcsファイルを書き出す。 </li></ol> 1.7）データ解析<ol><li> FCM解析ソフトウェアを開きます。新しい実験ファイルに.fcsファイルをすべてインポートします。 </li><li>ビーズのみのチューブを開きます。 SSC-プロット対FSC-Aには、0.2μm程度と1.0μmの間で大きさのすべてのビーズをゲートを描く。これは、EVゲートである。すべてのサンプルに追加するドラッグします。 </li><li>陰性対照として、溶解したサンプルを使用して、使用する各蛍光チャネルにおけるバックグラウンド蛍光の端にゲートを描く。各対応する非溶解サンプルのEVゲートへの蛍光ゲートをドラッグします。 注：この時点で、それはまた、デュアル蛍光双方向パラメータプロットを検討することは有用である。ロケットの形で二重陽性象限凝集または他の小胞模倣事象からアーチファクトを示すことができる、マーカーは無関係の細胞型上に存在することが知られている場合は特に、（ 図8参照）。 </li><li>各蛍光マーカーの場合は、非溶解サンプル内のイベント数から溶解サンプル中のイベントの数を引く。必要に応じて、％正の値を取得するために非溶解されたEVゲート内EVの総数でこの数を割る。 </li></ol> 2.方法B：ビーズ法 EVの血液サンプル/単離の2.1）処理<ol><li>方法A（1.1節）に記載の血液処理方法を参照してください。 </li></ol> 2.2）分析のためのサンプルを調製<ol><li>必要に応じて、エキソソームと微小胞にPPPまたは超遠心のEVを分画。 0.22μmの遠心フィルターにPPPまたは超遠心EVの250μlを添加して、750 xで固定されたロータの遠心機とスピンに移転RTで2分間グラム。 注：液体がフィルターのトップスに残っていないことを確認してください。遠心分離した後、フィルターを上に残っている目に見える流体層と「ドライ」であることが表示されます。そうしながら、特定のサンプルが効果的にフィルターを介して移動する流体のためにわずかに長い遠心分離時間が必要な場合があります。 </li><li> 2ミリリットルでコーティングされていない6μmのポリスチレンビーズ（ 例えば 、負のABCビーズ）RPMI培地で2回、再懸濁を洗ってください。各FACSチューブに6000ビーズを追加します。ネガティブコントロール管に、ビーズに一人でRPMI培地400μlのを追加します。他のすべてのチューブに、PPPまたは超遠心のEV（またはその留分）を200μlとRPMI培地200μlを加える。 </li><li>メディア400μlに全てのチューブの最終容量を調整し、シェーカー上、4℃で一晩インキュベートする。 </li><li>翌朝は、メディアの2ミリリットルでビーズを洗浄する。上清を吸引除去する。 </li><li> 4＆で3時間培地（400μl）を、5％ウシ血清アルブミン（BSA）でブロックし＃176; Cシェーカー上。 </li><li>メディアの2ミリリットルでビーズを洗ってください。 100μlの培地で吸引し、ペレットを再懸濁し。 </li></ol> 2.3）染色EVのサンプル<ol><li>すべての抗体をフィルタリングします。方法Aで使用したのと同じ抗体のパネルを使用し、又は所望の場合に限り、それらの蛍光色素が互いに互換性があるように、抗体の異なる組み合わせを作成する。 </li><li> 0.22μmの遠心フィルターチューブに単一のパネルで使用されるすべての抗体を組み合わせる。 2分間、または抗体の混合物のすべてがフィルターを通過してない抗体液がフィルタの表面に残っていないまで、固定角シングルスピード遠心分離機を用いて遠心機。 </li><li>すべてのチューブに濾過抗体カクテルの適切なボリュームを追加し、4℃で30分間インキュベートする。 </li><li>フローサイトメーター上でメディア400μlのメディア、再懸濁の2ミリリットルでビーズを洗浄し、すぐに実行（または同じ日以内）。 </li></ol> 2.4）セットアップとサンプル読書サイトメーター<ol><li> FCMソフトウェアを開きます。 （製造者の指示に従って）機器のセットアップビーズを使用して毎日の機器較正およびセットアップを実行し、セットアップを実験の前に。 </li><li> EVサンプルは、複数の抗体で染色されており、複数の蛍光色素を一度に測定する場合、次のように、補正値を算出する。 <ol><li>予め標識するための補償ビーズの2滴のチューブ（各蛍光標識抗体のための1チューブ）を追加し、抗体の推奨される量を追加します。染色していない補償制御として使用する別のチューブに負の補償ビーズの2滴を追加します。 PBS400μlのPBSに再懸濁で洗浄し、30分間4℃でインキュベートする。 </li><li> FCMソフトウェアを使用して、各補償チューブを実行し、5年間の対数スケールで約10 4における各ピークを配置する蛍光の電圧を調整する。蛍光ピークが他のすべてのチャネルに比べて、独自の蛍光チャネルで（最も明るい）最高であることを確認し、必要に応じて再び蛍光パラメータの電圧を調整します。各個別に染色されたCOMPチューブを実行し、チューブあたり少なくとも5000のイベントをキャプチャします。 </li><li>すべてのサンプルに補正値を適用するには、タブ「実験、 &quot;その後&quot;の報酬、「その後」の計算補正」を選択します。 </li></ol></li><li>規模を記録し、それぞれのサイトメーター（FSC = 200およびSSC = 200）で許可されている最低のしきい値を選択するためのFSCとSSC電圧パラメータを変更します。 </li><li>実行したサンプル、一重ビーズ集団に対するゲートと、このゲートで2000のイベントを取得する。エクスポート.fcsファイル。 </li><li>ファイルを.fcs分析するFCM解析ソフトウェアを使用してください。一重ビーズ上のゲート。各蛍光色素のための幾何平均蛍光強度（MFI）を計算し、ネガティブコントロールのMFIと比較。 </li></ol>

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J. C., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+vs.+swarm+detection+of+microparticles+and+exosomes+by+flow+cytometry.">Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry.</a> Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 10 (5), 919-930 (2012).</li><li>Gy&#246;rgy, B., Szab&#243;, T. 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S., Aras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sickle+blood+contains+tissue+factor-positive+microparticles+derived+from+endothelial+cells+and+monocytes.">Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes.</a> Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).</li><li>Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D. F., Joseph, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+majority+of+circulating+platelet-derived+microparticles+fail+to+bind+annexin+V,+lack+phospholipid-dependent+procoagulant+activity+and+demonstrate+greater+expression+of+glycoprotein+Ib.">The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib.</a> Thrombosis and Haemostasis. 103 (5), 1044-1052 (2010).</li><li>Nolte-&#8217;t Hoen, E. N. M., van der Vlist, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+flow+cytometric+analysis+of+nanosized+cell-derived+membrane+vesicles.">Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, And Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).</li><li>Van der Vlist, E. J., Nolte-&#8217;t Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li><li>Orozco, A. F., Lewis, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+circulating+microparticles+in+plasma.">Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma.</a> Cytometry Part A. 77 A. 77A (6), 502-514 (2010).</li></ol>

著者らは、開示することは利害関係のない。

EVの単離、処置および分析のための2つの異なるプロトコルは、個々の検出またはビーズベースのアプローチのいずれかを使用して、提示された。使用する最も適切な方法を選択することは必ずしも容易ではなく、興味のある個々の亜集団と同様にテストされているサンプルを理解する必要があります。最も適切な方法を選択する際にさらに、取得のために使用されるサイトメーターの感度を...

細胞外小胞（電気自動車）は、高度に細胞間コミュニケーションに関与し、生物学的プロセスの多様な範囲を規制する助けている体液で見つかった小さな、膜由来小胞である。フローサイトメトリー（FCM）を使用して、電気自動車の分析は、その小さなサイズと、目的のマーカーに陽性の別個の集団の不足のために悪名高く困難であった。かなり過去10年間に改善し、EV分析のための方法は、まだ進行中の作業である。残念ながら、そこにはフリーサイズのプロトコルではなく、使用するのが最も適切な方法を決定する際にいくつかの側面を考慮しなければなりません。ここで提示個々の検出またはビーズベースのアプローチのいずれかを使用して電気自動車を分析するためにEVやつのプロトコルを処理するための幾つかの異なる技術である。ここに記載される方法は、一般に市販の調製物に見られる抗体の凝集体を排除する信号対雑音比を増加させる、および合理的なfのでゲートを設定して支援するバックグラウンド蛍光の検出を最小にashion。第二のプロトコルをキャプチャ小さいEVやエキソソームを検出するために、ビーズベースのアプローチを使用しながら、第一のプロトコルは、臨床サンプルの高容量を分析するために特によく適している個々の検出方法を使用する。 また、微粒子としても知られている電気自動車は、細胞間コミュニケーションに関与し、生物学的プロセス1の多様な調節を助けている体液中に見出される小さな膜由来の小胞である。 4 -様々な表面マーカーおよび/ ​​または生物学的物質の直接転写の発現を介して、電気自動車は、細胞間コミュニケーションに2を活性化または抑制の役割のいずれかを再生するためにレシピエント細胞の機能を変化させることができる。他の腫瘍metastaを促進するから、広範な条件に寄与することが示されているが、臨床的に、血小板由来電気自動車は、強力な抗凝固活性5を有することが知られている病気7からの保護にSIS 6。電気自動車は、発電8のサイズやメカニズムに応じて、そのようなエキソソームと微小胞（MVの）などの細胞由来の小胞の小さいカテゴリーに分類することができる。細胞由来の小胞の集団の命名法は、MVSは1,000百大きいながらしかし、エキソソームは、一般的に、形質膜とエンドソームの融合に由来し、小さな、40から100ナノメートルの粒子として記載されている、現在進行中の議論8,9の話題であり続け原形質膜10の脱落によって形成さ以下の粒子。ここで、一般的な用語「電気自動車」とは、細胞によって放出される細胞外の生物小胞の全てのタイプを指すために使用される。 全血からのEVの単離は、多段階の手順であり、多くの異なる処理変数は、保存温度および期間11,12を含む、EVの内容に影響することが示されている、抗凝固剤/防腐剤13を使用し遠心法14を用いた。これらの変数の標準化の必要性は、適切な血液処理とEV分離手順のための血栓止血科学と標準化委員会（ISTH SSC）に関する国際学会勧告15,16につながっている、まだ、最適なプロトコル上の研究者の間でコンセンサスは存在しない12を使用する。最も厳密に制御前分析変数は、正確で再現性のあるデータのために重要であることが同意する。 電気自動車を分析するために、研究者らは、透過型電子顕微鏡17、走査型電子顕微鏡18,19、原子間力顕微鏡、20,21およびウェスタンブロッティング22,23を動的光散乱を含む様々な方法を利用している。 FCMは、多くの研究9,24のための選択の方法であるが-高いスループット能力に起因26、FCMを用いた電気自動車の分析がされている32 -そのサイズと離散正の集団27の欠如に難しいことで知ら。細胞の分析に比べて、必要となる粒子当たりの抗原の少ない数に起因して放出された1）以下蛍光電気自動車結果のサイズが小さく、後染色洗浄2）限られた可能性は、バックグラウンド蛍光を減少させる。研究者の間で共通の課題は、免疫グロブリン凝集体27,28および抗体29の自己凝集から生じる信号を含む。さらに、長い処理時間と現在のプロトコル33,34の多くで使用される長い洗濯/単離方法は、高スループットのアプリケーションに理想的で、それらが少なくなって、少数のサンプルを分析するために、マルチ日の時間のコミットメントを必要とする。一部の研究者は、正確にBACを評価するため、蛍光マイナス1（FMO）と抗体アイソタイプ役に立たないとして伝統的に使用されるFCMネガティブコントロールのレンダリング、完全に洗浄ステップを見送るkground蛍光30。 抗体凝集体および他の非小胞、非結合抗体を除去するのに難しさ、および識別可能な正の集団の不足から生じる信号：我々のプロトコルは、EVの適切なFCM分析を妨げることができる3つの一般的な問題に対処する。ここで説明される技術は、一般に市販の調製物に見られる抗体凝集体を排除する信号対雑音比を増加させると、バックグラウンド蛍光の検出を最小限にする合理的な方法でゲートを設定することで支援する。二つの異なる検出方法がここに提示されている：第二のプロトコルをキャプチャ小さいEVやエキソソームを検出するために、ビーズベースのアプローチを使用しながら、第一のプロトコルは、臨床サンプルの高容量を分析するために特によく適している個々の検出方法を使用する。

<table><tbody><tr><td>LSR II benchtop flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm red)</td></tr><tr><td>FACS Diva software&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>PC version 6.0</td></tr><tr><td>FlowJo software&amp;nbsp;</td><td>Treestar US</td><td></td><td>Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5</td></tr><tr><td>Sphero Rainbow fluorescent particles</td><td>BD Biosciences</td><td>556298</td><td>used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ultra Rainbow fluorescent particles&amp;nbsp;</td><td>Spherotech</td><td>URFP-10-5</td><td>used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch</td></tr><tr><td>Megmix-Plus SSC beads</td><td>Biocytex</td><td>7803</td><td>used to adjust FSC and SSC&amp;nbsp; voltages to maintain&amp;nbsp; consistency&amp;nbsp; between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs</td></tr><tr><td>AbC Anti-Mouse Bead Kit</td><td>Life Technologies</td><td>A-10344</td><td>used for compensation controls &amp;amp; negative AbC beads used for beads-based method</td></tr><tr><td>Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9)</td><td>Santa Cruz&amp;nbsp;</td><td>sc-281108</td><td>used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month.</td></tr><tr><td>BD TruCOUNT Tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>340334</td><td>used whenver absolute EV concentrations are needed</td></tr><tr><td>Ultrafree-MC, GV 0.22 &amp;micro;m Centrifugal Filter Units</td><td>Millipore&amp;nbsp;</td><td>UFC30GVNB</td><td>used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size</td></tr><tr><td>Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A</td><td>BD Biosciences</td><td>364606</td><td></td></tr><tr><td>Facs tubes 12x75 polystrene</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Reservoirs individually wrapped&amp;nbsp;</td><td>Phenix</td><td>RR-50-1s</td><td></td></tr><tr><td>Green-Pak pipet tips - 10 &amp;micro;l</td><td>Rainin</td><td>GP-L10S</td><td></td></tr><tr><td>Green-Pak pipet tips -200 &amp;micro;l&amp;nbsp;</td><td>Rainin</td><td>GP-L250S</td><td></td></tr><tr><td>Green -Pak pipet tips - 1,000 &amp;micro;l&amp;nbsp;</td><td>Rainin</td><td>GP-L1000S</td><td></td></tr><tr><td>Stable Stack L300 tips presterilized</td><td>Rainin</td><td>SS-L300S</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite&amp;nbsp;XLS 8 Channel LTS&amp;nbsp;Adjustable&amp;nbsp;Spacer&amp;nbsp;</td><td>Rainin</td><td>LA8-300XLS</td><td></td></tr><tr><td>96 well tissue culture plates</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>EK-20180</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media (without Hepes)</td><td>UCSF Cell Culture Facility</td><td>CCFAE001</td><td>media used for bead-based detection method</td></tr><tr><td>Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2 &amp;micro;m filtered</td><td>UCSF Cell Culture Facility</td><td>CCFAL003</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear</td><td>BECKMAN COULTER INC</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>PANEL I</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD3 PerCP-Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>344808</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD14 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>301820</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD16 V450</td><td>BD Biosciences</td><td>560474</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD28 FITC</td><td>biolegend</td><td>302906</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD152 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>555855</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD19 A700</td><td>Biolegend</td><td>302226</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>PANEL II</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD41a PerCP-Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>340930</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD62L APC</td><td>Biolegend</td><td>304810</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD108 PE&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>552830</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD235a FITC</td><td>biolegend</td><td>349104</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>PANEL III</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>301322</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD62p APC</td><td>Biolegend</td><td>304910</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD66b PE&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>305106</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD15 FITC</td><td>exalpha</td><td>X1496M</td><td>5 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD9 PE</td><td>Biolegend</td><td>555372</td><td></td></tr><tr><td>CD63 APC</td><td>Biolegend</td><td>353008</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 Ms IgG2a, &amp;kappa;</td><td>Biolegend</td><td>400230</td><td></td></tr></tbody></table>

techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry

細胞外小胞（電気自動車）は、高度に細胞間コミュニケーションに関与し、生物学的プロセスの多様な範囲を規制する助けている体液で見つかった小さな、膜由来小胞である。フローサイトメトリー（FCM）を使用して、電気自動車の分析は、その小さなサイズと、目的のマーカーに陽性の別個の集団の不足のために悪名高く困難であった。かなり過去10年間に改善し、EV分析のための方法は、まだ進行中の作業である。残念ながら、そこにはフリーサイズのプロトコルではなく、使用するのが最も適切な方法を決定する際にいくつかの側面を考慮しなければなりません。ここで提示個々の検出またはビーズベースのアプローチのいずれかを使用して電気自動車を分析するためにEVやつのプロトコルを処理するための幾つかの異なる技術である。ここに記載される方法は、一般に市販の調製物に見られる抗体の凝集体を排除する信号対雑音比を増加させる、および合理的なfのでゲートを設定して支援するバックグラウンド蛍光の検出を最小にashion。第二のプロトコルをキャプチャ小さいEVやエキソソームを検出するために、ビーズベースのアプローチを使用しながら、第一のプロトコルは、臨床サンプルの高容量を分析するために特によく適している個々の検出方法を使用する。

<html> 図1は 、ビーズベースの方法または個々の検出方法のいずれかを使用してEVの分離および検出のための全体的な処理方式の概要を説明します。 FCMを使用したEVの個々の検出は、より大きな電気自動車の分析に適していますが、ほとんどのサイトメーターは、個別にエキソソームと小さい粒子を検出することができない。ビーズベースのアプローチは、一般的に、表1</stro...

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Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

多くの異なる方法は、フローサイトメトリー（FCM）を使用して、細胞外小胞（電気自動車）の測定のために存在する。使用する最も適切な方法を決定する際にいくつかの側面を考慮すべきである。電気自動車を測定するための2つのプロトコルは、個々の検出またはビーズベースのアプローチのいずれかを使用して、提示されている。

フローサイトメトリーを用いて細胞外小胞の分析のための技術

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

techniques-for-analysis-extracellular-vesicles-using-flow

Research

JoVE Journal

Biology

23.1K ビュー.  Blood Systems Research Institute. 多くの異なる方法は、フローサイトメトリー（FCM）を使用して、細胞外小胞（電気自動車）の測定のために存在する。使用する最も適切な方法を決定する際にいくつかの側面を考慮すべきである。電気自動車を測定するための2つのプロトコルは、個々の検出またはビーズベースのアプローチのいずれかを使用して、提示されている。 

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Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released from many cell types and play a pivotal role in regulating cell-cell communication and a diverse range of biological processes. Many different methods for the characterization of EVs have been described. However, most of these methods have the disadvantage that the preparation and characterization of the samples are very time-consuming, or it is extremely difficult to analyze specific markers of interest due to their small size and due to the lack of discrete populations. While methods for analysis of EVs have been considerably improved over the last decade, there is still no standardized method for characterization of single EVs. Here, we demonstrate a semi-automated method for characterization of single EVs by fluorescence-based nanoparticle-tracking analysis. The protocol that is presented addresses the common problem of many researchers in this field and provides the complete workflow for rapid isolation of EVs and characterization with PKH67, a general cell membrane linker, as well as with specific surface markers such as CD63, CD9, vimentin, and lysosomal-associated membrane protein 1 (LAMP-1). The presented results show a high level of reproducibility, as confirmed by other methods, such as Western blotting. In the conducted experiments, we exclusively used EVs isolated from human serum samples, but this method is also suitable for plasma or other body fluids and can be adjusted for characterization of EVs from cell culture supernatants. Irrespective of the future progress of research on EV biology, the protocol that is presented here provides a rapid and reliable method for rapid characterization of single EVs with specific markers.

In this protocol, we describe the complete workflow for rapid isolation of extracellular vesicles from human whole blood and characterization of specific markers by fluorescence-based nanoparticle-tracking analysis. The presented results show a high level of reproducibility and can be adjusted to cell culture supernatants.

ナノ粒子追跡によるひと血中の細胞小胞単一の急速な蛍光特性評価

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

生化学

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the physiological and pathological state of a cell. However, there is no standard method for sEV isolation, which prevents downstream biomarker identification and drug intervention studies. In this article, we provide a detailed protocol for the isolation and purification of 50-200 nm sEV by a flow cell sorter. For this, a 50 &#181;m nozzle and 80 psi sheath fluid pressure were selected to obtain a good sorting rate and stable side stream. Standard sized polystyrene microspheres were used to locate populations of 100, 200, and 300 nm particles. With additional optimization of the voltage, gain, and forward scatter (FSC) triggering threshold, the sEV signal could be separated from the background noise. These optimizations provide a panel of critical sort settings that enables one to obtain a representative population of sEV using FSC vs. side scatter (SSC) only. The flow cytometry-based isolation method not only allows for high-throughput analysis but also allows for synchronous classification or proteome analysis of sEV based on the biomarker expression, opening numerous downstream research applications.

This protocol provides a rapid and size-specific isolation method for small extracellular vesicles by optimizing the size of the air spray nozzle, sheath fluid pressure, sample flow pressure, voltage, gain, and triggering threshold parameters.

低分子細胞外小胞のハイスループット単離および精製のためのフローサイトメトリーソーティングパラメータの最適化(英語)

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of some of the EVs. Both virions and EVs carry proteins of the cells that generated them and are antigenically heterogeneous. In spite of their diversity, both viruses and EVs were characterized predominantly by bulk analysis. Here, we describe an original nanotechnology-based high throughput method that allows the characterization of antigens on individual small particles using regular flow cytometers. Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles (MNPs) coupled to antibodies recognizing one of the surface antigens. The captured virions or vesicles were incubated with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated on magnetic columns from unbound antibodies and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence. This method has wide applications and can be used to characterize the antigenic composition of any viral- and non-viral small particles generated by cells in vivo and in vitro. Here, we provide examples of the usage of this method to evaluate the distribution of host cell markers on individual HIV-1 particles, to study the maturation of individual Dengue virions (DENV), and to investigate extracellular vesicles released into the bloodstream.

Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles coupled to antibodies recognizing surface antigens. The captured virions or vesicles were labeled with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated in high magnetic field and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence.

ビリオンの抗原性スペクトルと細胞外ベシクルを分析するためのフローVirometry

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

免疫・感染学

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for phenotypic analyses of extracellular vesicles (EV) including exosomes (Exo) in the peripheral blood and other body fluids. The small size of EV mandates the use of dedicated instruments having a detection threshold around 50-100 nm. Alternatively, EV can be bound to latex microbeads that can be detected by FC. Microbeads, conjugated with antibodies that recognize EV-associated markers/Cluster of Differentiation CD63, CD9, and CD81 can be used for EV capture. Exo isolated from CM can be analyzed with or without pre-enrichment by ultracentrifugation. This approach is suitable for EV analyses using conventional FC instruments. Our results demonstrate a linear correlation between Mean Fluorescence Intensity (MFI) values and EV concentration. Disrupting EV through sonication dramatically decreased MFI, indicating that the method does not detect membrane debris. We report an accurate and reliable method for the analysis of EV surface antigens, which can be easily implemented in any laboratory.

The protocol describes a reproducible method designed for use with cell culture supernatants to detect surface epitopes on small extracellular vesicles (EV). It utilizes specific EV immunoprecipitation using beads coupled with antibodies that recognize surface antigen CD9, CD63, and CD81. The method is optimized for downstream flow cytometry analysis.

フローサイトメトリー法による細胞小胞細胞調節されたメディアからの解析します。

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

生物学

Size Determination and Phenotypic Analysis of Urinary Extracellular Vesicles using Flow Cytometry

Extracellular vesicles, EVs, are a heterogeneous complex of lipidic membranes, secreted by any cell type, in any fluid such as urine. EVs can be of different sizes ranging from 40-100 nm in diameter such as in exosomes to 100-1000 nm in microvesicles. They can also contain different molecules that can be used as biomarkers for the prognosis and diagnosis of many diseases. Many techniques have been developed to characterize these vesicles. One of these is flow cytometry. However, there are no existing reports to show how to quantify the concentration of EVs and differentiate them by size, along with biomarker detection. This work aims to describe a procedure for the isolation, quantification, and phenotypification of urinary extracellular vesicles, uEVs, using a conventional cytometer for the analysis without any modification to its configuration. The method&#39;s limitations include staining a maximum of four different biomarkers per sample. The method is also limited by the amount of EVs available in the sample. Despite these limitations, with this protocol and its subsequent analysis, we can obtain more information on the enrichment of EVs markers and the abundance of these vesicles present in urine samples, in diseases involving kidney and brain damage.

This protocol describes a method for the isolation of urinary extracellular vesicles, uEVs, from healthy human donors and their phenotypic characterization by the size and surface marker expression using flow cytometry.

Extracellular vesicles, EVs, are a heterogeneous complex of lipidic membranes, secreted by any cell type, in any fluid such as urine. EVs can be of ...

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and first-generation particle analysis to comprehensive multi-parameter measurements such as nano-flow cytometry (nFCM). nFCM is a form of flow cytometry that utilizes instrumentation specifically designed for nano-particle analysis, allowing for thousands of EVs to be characterized per minute both with and without the use of staining techniques. High resolution side scatter (SS) detection allows for size and concentration to be determined for all biological particles larger than 45 nm, while simultaneous fluorescence (FL) detection identifies the presence of labeled markers and targets of interest. Labeled subpopulations can then be described in quantitative units of particles/mL or as a percentage of the total particles identified by side scatter.
Here, EVs derived from conditioned cell culture media (CCM) are labeled with both a lipid dye, to identify particles with a membrane, and antibodies specific for CD9, CD63, and CD81 as common EV markers. Measurements of comparison material, a concentration standard and a size standard of silica nanospheres, as well as labeled sample material are analyzed in a 1-minute analysis. The software is then used to measure the concentration and size distribution profile of all particles, independent of labeling, before determining the particles that are positive for each of the labels.
Simultaneous SS and FL detection can be utilized flexibly with many different EV sources and labeling targets, both external and internal, describing EV samples in a comprehensive and quantitative manner.

The latest generation of EV characterization tools are capable of single EV analysis across multiple parameters simultaneously. Nano-flow cytometry measures all biological particles larger than 45 nm without labeling and identifies specific characteristics of subpopulations by a variety of fluorescent labeling techniques.

ナノフローサイトメトリーによる単一細胞外小胞膜貫通タンパク質の特性評価

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important players in the maintenance of organismal homeostasis and the progression of a wide spectrum of diseases. While the current research focuses on the characterization of endogenous exosomes with the endosomal origin, microvesicles blebbing from the plasma membrane have gained increasing attention in health and sickness, which are featured by an abundance of surface molecules recapitulating the membrane signature of parent cells. Here, a reproducible procedure is presented based on differential centrifugation for extracting and characterizing EVs from the plasma and solid tissues, such as the bone. The protocol further describes subsequent profiling of surface antigens and protein cargos of EVs, which are thus traceable for their derivations and identified with components related to potential function. This method will be useful for correlative, functional, and mechanistic analysis of EVs in biological, physiological, and pathological studies.

The present protocol describes a method to extract extracellular vesicles from the peripheral blood and solid tissues with subsequent profiling of surface antigens and protein cargos.

血漿および固体組織からのトレーサブルおよび機能化された細胞外小胞の単離と分析

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

輸出メカニズムを理解するためのフローサイトメトリープロトコール

Tracking miRNA Release into Extracellular Vesicles using Flow Cytometry

Extracellular vesicles (EVs) are important mediators of cellular communication that are secreted by a variety of different cells. These EVs shuttle bioactive molecules, including proteins, lipids, and nucleic acids (DNA, mRNAs, microRNAs, and other noncoding RNAs), from one cell to another, leading to phenotypic consequences in the recipient cells. Of all the various EV cargo, microRNAs (miRNAs) have garnered a great deal of attention for their role in shaping the microenvironment and in educating recipient cells because of their clear dysregulation and abundance in EVs. Additional data indicates that many miRNAs are actively loaded into EVs. Despite this clear evidence, research on the dynamics of export and mechanisms of miRNA sorting is limited. Here, we provide a protocol using flow cytometry analysis of EV-miRNA that can be used to understand the dynamics of EV-miRNA loading and identify the machinery involved in miRNA export. In this protocol, miRNAs predetermined to be enriched in EVs and depleted from donor cells are conjugated to a fluorophore and transfected into the donor cells. The fluorescently tagged miRNAs are then verified for loading into EVs and depletion from cells using qRT-PCR. As both a transfection control and a tool for gating the transfected population of cells, a fluorescently labeled cellular RNA (cell-retained and EV-depleted) is included. Cells transfected with both the EV-miRNA and cell-retained-miRNA are evaluated for fluorescent signals over the course of 72 h. The fluorescence signal intensity specific for the EV-miRNAs diminishes rapidly compared to the cell-retained miRNA. Using this straightforward protocol, one could now assess the dynamics of miRNA loading and identify various factors responsible for loading miRNAs into EVs.

著者スポットライト:がん進行における細胞外小胞へのマイクロRNAローディングのメカニズムの探索 

Here, we describe a straightforward protocol that enables in vitro assessment of the abundance of fluorescently labeled microRNAs to study the dynamics of microRNA packaging and export into extracellular vesicles (EVs).

フローサイトメトリーを用いた細胞外小胞へのmiRNA放出の追跡

Extracellular vesicles (EVs) are important mediators of cellular communication that are secreted by a variety of different cells. These EVs shuttle ...

フローサイトメトリーを用いて細胞外小胞の分析のための技術

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低分子細胞外小胞のハイスループット単離および精製のためのフローサイトメトリーソーティングパラメータの最適化(英語)

ビリオンの抗原性スペクトルと細胞外ベシクルを分析するためのフローVirometry

フローサイトメトリー法による細胞小胞細胞調節されたメディアからの解析します。

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ナノフローサイトメトリーによる単一細胞外小胞膜貫通タンパク質の特性評価

血漿および固体組織からのトレーサブルおよび機能化された細胞外小胞の単離と分析

フローサイトメトリーを用いた細胞外小胞へのmiRNA放出の追跡

フローサイトメトリーを用いた細胞外小胞へのmiRNA放出の追跡

フローサイトメトリーを用いた細胞外小胞へのmiRNA放出の追跡