著者は、機器の設定、フローサイトメーターとの彼の助けのための血液システム開発センターからデイルHirschkornに感謝したいと思います。この作品は、NIHの助成金HL095470とU01 HL072268と国防総省の契約W81XWH-10-1-0023とW81XWH-2から0028によってサポートされていました。

注：以下のプロトコルが人間の福祉のためにすべての、制度的、国内および国際的なガイドラインを遵守して行われてきた。すべてのヒト被験サンプルは、治験審査委員会（IRB）承認のプロトコルの下で被験者のインフォームドコンセントを用いて試験した。 1.方法A：個々の検出方法 EVの血液サンプル/単離の1.1）処理<ol><li>以下の2段階の分画遠心プロトコルを使用して（30分以内に最大）直ちにACD-A液1.5 mlまたは他の適当な抗凝固剤及びプロセスを含む2つの10 mlのガラスチューブ中にドナー/患者から血液を引き込む。 注：このプロトコルは、採取した血液の組み合わせ〜17ミリリットルから約10ミリリットル乏血小板血漿（PPP）のが得られます。多かれ少なかれPPPが必要な場合には、採血管の数は、それに応じて調整することができる。 </li><li> RTで10分間1500×gでサンプルを遠心軟膜と赤血球から血漿を分離する。軟膜と赤の細胞を含む下層を乱さないように注意しながら、1.5ミリリットル遠心管にプラズマ上清1.2mlのアリコートを転送します。 </li><li>血小板および大型細胞片を除去し、室温で10分間、13000×gでスピン。慎重にペレットを乱さないよう、新しいチューブにPPPを追加するために、200μlの後ろに残して、PPPを転送する。 </li><li>この時点で、後の分析のために、最大2つの年（概要については、 図1Aを参照）のために、-80℃で分析したり、新しい1.5ミリリットル遠心管に1.0ミリリットル分量で転送して保存のためにすぐにPPPを使用しています。 </li><li>精製された電気自動車は、機能的実験のために必要な場合、超遠心管にPPPの転送6ミリリットルし、0.2μm濾過したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）28mlを追加します。スイングバケットローターを備えた超遠心機を使用してRT 100,000×gで60分間スピン。上清を吸引し再懸濁EVペル1.5ミリリットルのメディアでみましょう。 注：最高の再現性のために、血液サンプルをドナーにドナーからのように一貫して可能な限り処理されるべきである。 EV分離法における任意の変動が大きく、検出EVの数と種類に影響を与える可能性がある。 </li></ol> 1.2）分析のためのサンプルを調製注：この時点から、ステップは3つのパネルで14マーカーの12個のサンプルを分析するためのハイスループットプロトコルを説明する。しかし、抗体の他の組み合わせは、ここで使用することができる。プロトコルは、関心のあるそれらのために提案マーカーを置換することによって、他のEV集団を研究するために適合させることができる。 <ol><li> （-80℃で保存した場合）冷凍庫から12のサンプルを取り出し、37℃で解凍。 </li><li>ピペットの内容を上下に数回混合する。各サンプルから320μlのを削除し、96ウェルプレートの一番上の行に追加します。 注：幅調節可能なマルチウェルピペットは、このとお尻の多くの他のステップのために非常に便利です一度に複数のサンプルを分析する場合は特に、AY。 </li></ol> 1.3）染色EVのサンプル<ol><li>染色前に、陽性シグナルが発生する可能性があり、凝集体を除去するためにすべての抗体（ABS）をフィルタリングする。 <ol><li> 2分間、室温で固定角度シングルスピード遠心分離機（〜750×gで）を使用して別個の0.22μmの遠心フィルターチューブと遠心分離機に3パネルの各々に使用される抗体を結合、または抗体の混合物のすべてがフィルターを通過するまでと全く抗体液がフィルターの表面上に残っていない。ストアのAb 2週間まで冷蔵庫でカクテルが、再フィルタ使用前に毎回。 </li></ol></li><li>よく行2の各フィルタのAb混合物の適切な量を追加します（ 例えば 、私はそれぞれのAbの2μLで染色されているパネルのサンプルは、そのようにフィルタリングのAbカクテル12μlの合計は、2行するウェルに添加されている）。提案のプレートマップの概要については、図1（b）を参照してください。これらの追加を繰り返します以上のパネルが実行された場合の下の行へのS（ここでは、ウェル4を行にパネルIIIカクテルの3及び11μL/行する8μL/ウェルパネルIIカクテルの追加、特定のパネル情報のための材料リストを参照してください）​​。 </li><li>マルチチャンネルピペットを用いて、上下の行1にPPPのサンプルを混合し、2ミックス上下の行のウェルに、行1のウェルから100μlを移す。ヒントを変更して、繰り返して、30分間の行4℃で3と4のインキュベートに行1から100μLを転送する。 </li></ol> 1.4）洗浄MVサンプル<ol><li> 4℃から96ウェルプレートを取り外し、生物学的安全キャビネットに移す。マルチチャンネルピペットを用いて、6-8（ステンドPPPを含むウェルを洗浄/すすぎのために使用される）の行に/ウェルのPBS 220μlを添加する。 </li><li>抗体の3つのパネル、12×3 = 36フィルターチューブで、12サンプルについて幅が調整可能なマルチチャンネルピペットを（使用して予め標識遠心フィルターチューブに、各ウェルの内容を転送します）が必要とされる。同じヒントを使用して、洗浄行から200μlのPBSを除去し、PPPがちょうど除去された対応するウェルに追加します。 </li><li>アップミックスダウン井戸をすすぎ、PPPが以前に添加した同じフィルタにリンス液を転送する。遠心分離フィルターのクローズトップス。変更のヒント。 </li><li>すべての染色のPPP試料は遠心分離フィルターへのリンスソリューションと一緒に転送されるまで、残りの染色したサンプルで、このプロセスを繰り返します。 </li><li> RTで3分間850×gで固定されたロータの遠心機とスピンに遠心分離フィルターを転送します。 注：液体がフィルターのトップスに残っていないことを確認してください。遠心分離した後、フィルターを上に残っている目に見える流体層と「ドライ」であることが表示されます。そうしながら、特定のPPPサンプルが効果的にフィルターを介して移動するために、より長い遠心分離時間が必要な場合があります。 </li><li>遠心フィルターチューブを外し、生物学的安全キャビネットに戻る。マルチチャンネルピペットを用いて、PBS300μlのフィルターのトップを懸濁します。再懸濁内容が即時のFCM解析のためのチューブを標識事前に転送します。 注：これは、サンプル間の変動を避けるために、サンプル間で一貫ピペットプランジャ窪みの力と数を維持することが非常に重要である。これは、理想的にピペッティングし、各サンプルのために特定のボリューム（ 例えば 、280μl）を正確な回数（ 例えば 、8回）上下するようにプログラムされた電子ピペットを用いて行われるべきである。 </li></ol> 1.5）サイトメーターのセットアップ<ol><li> FCMソフトウェアを開きます。 （製造者の指示に従って）機器のセットアップビーズを使用して毎日の機器較正およびセットアップを実行し、セットアップを実験の前に。 </li><li> EVサンプルは、複数の抗体で染色されており、複数の蛍光色素を一度に測定する場合、次のように、補正値を算出する。 <ol><li>事前に補償ビーズの2滴を追加します。チューブ（各蛍光標識抗体のための1管）標識抗体の、推奨量を追加します。染色していない補償制御として使用する別のチューブに負の補償ビーズの2滴を追加します。 </li><li> PBS400μlのPBSに再懸濁で洗浄し、30分間4℃でインキュベートする。 </li><li>楽器に付属のソフトウェアフローサイトメーターを用いて、各補償チューブを実行し、5-十年のログスケールで約10 4で各ピークを配置するために、蛍光電圧を調整します。蛍光ピークは、他のすべてのチャネルと比較して、独自の蛍光チャネルにおいて（最も明るい）が最も高く、かつ必要に応じて再度蛍光パラメータの電圧を調整すること。確実に各個別に染色されたCOMPチューブを実行し、チューブあたり少なくとも5000のイベントをキャプチャします。 </li><li>その後選択して &quot;、実験」タブを選択し、「報酬」を、すべてのサンプルに補正値を適用するために「計算補正」を選択します。 </li></ol></li><li&gt;スケールをログに記録し、それぞれのサイトメーター（FSC = 200およびSSC = 200）で許可されている最低のしきい値を選択するための前方散乱（FSC）および側方散乱（SSC）は、電圧パラメータを設定します。 </li><li> 0.22μmのフィルターPBSのチューブの実行中に、（ すなわち 、単にイベント発生率が5イベント/秒を上回るなる電圧閾値より下）バックグラウンドノイズの大部分を排除し、最も高い値にFSC＆SSC電圧を調整します。 </li><li>必要に応じて、PBSで希釈した1.0μmのビーズ、 - 次に、0.2ミクロンを含むチューブを実行します。 SSCプロット対FCSでは、0.2〜1.0μmの間でイベントをキャプチャするためにビーズ集団の周りにゲートを描きます。また、SSC-Hヒストグラムで、1.0μmのビーズよりも小さいすべてのイベントが含まれるようにゲートを描く。 </li><li> 「LO」（約8〜12μL/分）にサイトメーターの流量を設定します。ビーズチューブ（またはビーズの既知の濃度を含有する他のチューブ）を使用する直前まで、フローサイトメーター上での流量調整ツマミntの速度は約200イベント/秒に達する。同じ流速で、すべてのサンプル管を読み、その流速が実行間の一貫性を維持確保するために将来の実験で同じビーズ濃度を使用しています。 </li><li> PBSで希釈した虹の蛍光粒子のチューブを実行します。 5000のイベントを取得します。 FSC、SSC、および各カラーチャンネルの平均強度値を記録します。蛍光強度は、実験間の整合性を保つことを保証するために将来の実験で電圧を調整するために、これらの値を使用してください。 </li></ol> 1.6）サンプル読書<ol><li> 「LO」（約8〜12μL/分）にサイトメーターの流量を設定し、正確に1または2分間、各サンプルを実行します。 </li><li>最初の読み取りの後、各サンプルに10％のNP-40の20μlを添加、ピペット上下、及びで検出された陽性事象の減算を可能にするために同じ時間（1または2分）再読み込み同じ時間枠で溶解サンプル。 注：それは非常にIMPですサンプルはピペットのではなく、ボルテックスを用いて混合することがortant。我々の経験では、ボルテ​​ックスはEV-模倣陽性事象につながる、いくつかの抗体の自己凝集を引き起こす可能性があります。 </li><li>一旦全てのサンプルが読み取られてからFCM解析ソフトウェアを使用してさらに分析するために使用される別のファイルにすべて.fcsファイルを書き出す。 </li></ol> 1.7）データ解析<ol><li> FCM解析ソフトウェアを開きます。新しい実験ファイルに.fcsファイルをすべてインポートします。 </li><li>ビーズのみのチューブを開きます。 SSC-プロット対FSC-Aには、0.2μm程度と1.0μmの間で大きさのすべてのビーズをゲートを描く。これは、EVゲートである。すべてのサンプルに追加するドラッグします。 </li><li>陰性対照として、溶解したサンプルを使用して、使用する各蛍光チャネルにおけるバックグラウンド蛍光の端にゲートを描く。各対応する非溶解サンプルのEVゲートへの蛍光ゲートをドラッグします。 注：この時点で、それはまた、デュアル蛍光双方向パラメータプロットを検討することは有用である。ロケットの形で二重陽性象限凝集または他の小胞模倣事象からアーチファクトを示すことができる、マーカーは無関係の細胞型上に存在することが知られている場合は特に、（ 図8参照）。 </li><li>各蛍光マーカーの場合は、非溶解サンプル内のイベント数から溶解サンプル中のイベントの数を引く。必要に応じて、％正の値を取得するために非溶解されたEVゲート内EVの総数でこの数を割る。 </li></ol> 2.方法B：ビーズ法 EVの血液サンプル/単離の2.1）処理<ol><li>方法A（1.1節）に記載の血液処理方法を参照してください。 </li></ol> 2.2）分析のためのサンプルを調製<ol><li>必要に応じて、エキソソームと微小胞にPPPまたは超遠心のEVを分画。 0.22μmの遠心フィルターにPPPまたは超遠心EVの250μlを添加して、750 xで固定されたロータの遠心機とスピンに移転RTで2分間グラム。 注：液体がフィルターのトップスに残っていないことを確認してください。遠心分離した後、フィルターを上に残っている目に見える流体層と「ドライ」であることが表示されます。そうしながら、特定のサンプルが効果的にフィルターを介して移動する流体のためにわずかに長い遠心分離時間が必要な場合があります。 </li><li> 2ミリリットルでコーティングされていない6μmのポリスチレンビーズ（ 例えば 、負のABCビーズ）RPMI培地で2回、再懸濁を洗ってください。各FACSチューブに6000ビーズを追加します。ネガティブコントロール管に、ビーズに一人でRPMI培地400μlのを追加します。他のすべてのチューブに、PPPまたは超遠心のEV（またはその留分）を200μlとRPMI培地200μlを加える。 </li><li>メディア400μlに全てのチューブの最終容量を調整し、シェーカー上、4℃で一晩インキュベートする。 </li><li>翌朝は、メディアの2ミリリットルでビーズを洗浄する。上清を吸引除去する。 </li><li> 4＆で3時間培地（400μl）を、5％ウシ血清アルブミン（BSA）でブロックし＃176; Cシェーカー上。 </li><li>メディアの2ミリリットルでビーズを洗ってください。 100μlの培地で吸引し、ペレットを再懸濁し。 </li></ol> 2.3）染色EVのサンプル<ol><li>すべての抗体をフィルタリングします。方法Aで使用したのと同じ抗体のパネルを使用し、又は所望の場合に限り、それらの蛍光色素が互いに互換性があるように、抗体の異なる組み合わせを作成する。 </li><li> 0.22μmの遠心フィルターチューブに単一のパネルで使用されるすべての抗体を組み合わせる。 2分間、または抗体の混合物のすべてがフィルターを通過してない抗体液がフィルタの表面に残っていないまで、固定角シングルスピード遠心分離機を用いて遠心機。 </li><li>すべてのチューブに濾過抗体カクテルの適切なボリュームを追加し、4℃で30分間インキュベートする。 </li><li>フローサイトメーター上でメディア400μlのメディア、再懸濁の2ミリリットルでビーズを洗浄し、すぐに実行（または同じ日以内）。 </li></ol> 2.4）セットアップとサンプル読書サイトメーター<ol><li> FCMソフトウェアを開きます。 （製造者の指示に従って）機器のセットアップビーズを使用して毎日の機器較正およびセットアップを実行し、セットアップを実験の前に。 </li><li> EVサンプルは、複数の抗体で染色されており、複数の蛍光色素を一度に測定する場合、次のように、補正値を算出する。 <ol><li>予め標識するための補償ビーズの2滴のチューブ（各蛍光標識抗体のための1チューブ）を追加し、抗体の推奨される量を追加します。染色していない補償制御として使用する別のチューブに負の補償ビーズの2滴を追加します。 PBS400μlのPBSに再懸濁で洗浄し、30分間4℃でインキュベートする。 </li><li> FCMソフトウェアを使用して、各補償チューブを実行し、5年間の対数スケールで約10 4における各ピークを配置する蛍光の電圧を調整する。蛍光ピークが他のすべてのチャネルに比べて、独自の蛍光チャネルで（最も明るい）最高であることを確認し、必要に応じて再び蛍光パラメータの電圧を調整します。各個別に染色されたCOMPチューブを実行し、チューブあたり少なくとも5000のイベントをキャプチャします。 </li><li>すべてのサンプルに補正値を適用するには、タブ「実験、 &quot;その後&quot;の報酬、「その後」の計算補正」を選択します。 </li></ol></li><li>規模を記録し、それぞれのサイトメーター（FSC = 200およびSSC = 200）で許可されている最低のしきい値を選択するためのFSCとSSC電圧パラメータを変更します。 </li><li>実行したサンプル、一重ビーズ集団に対するゲートと、このゲートで2000のイベントを取得する。エクスポート.fcsファイル。 </li><li>ファイルを.fcs分析するFCM解析ソフトウェアを使用してください。一重ビーズ上のゲート。各蛍光色素のための幾何平均蛍光強度（MFI）を計算し、ネガティブコントロールのMFIと比較。 </li></ol>

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J. C., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+vs.+swarm+detection+of+microparticles+and+exosomes+by+flow+cytometry.">Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry.</a> Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 10 (5), 919-930 (2012).</li><li>Gy&#246;rgy, B., Szab&#243;, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Flow+Cytometric+Assessment+Reveals+Distinct+Microvesicle+(Cell-Derived+Microparticle)+Signatures+in+Joint+Diseases.">Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases.</a> PLoS ONE. 7 (11), e49726 (2012).</li><li>Gy&#246;rgy, B., M&#243;dos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+isolation+of+cell-derived+microparticles+are+compromised+by+protein+complexes+resulting+from+shared+biophysical+parameters.">Detection and isolation of cell-derived microparticles are compromised by protein complexes resulting from shared biophysical parameters.</a> Blood. 117 (4), e39-e48 (2011).</li><li>Gy&#246;rgy, B., Pasztoi, M., Buzas, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response:+systematic+use+of+Triton+lysis+as+a+control+for+microvesicle+labeling.">Response: systematic use of Triton lysis as a control for microvesicle labeling.</a> Blood. 119 (9), 2175-2176 (2012).</li><li>Trummer, A., De Rop, C., Tiede, A., Ganser, A., Eisert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotype+controls+in+phenotyping+and+quantification+of+microparticles:+a+major+source+of+error+and+how+to+evade+it.">Isotype controls in phenotyping and quantification of microparticles: a major source of error and how to evade it.</a> Thrombosis Research. 122 (5), 691-700 (2008).</li><li>Shet, A. S., Aras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sickle+blood+contains+tissue+factor-positive+microparticles+derived+from+endothelial+cells+and+monocytes.">Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes.</a> Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).</li><li>Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D. F., Joseph, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+majority+of+circulating+platelet-derived+microparticles+fail+to+bind+annexin+V,+lack+phospholipid-dependent+procoagulant+activity+and+demonstrate+greater+expression+of+glycoprotein+Ib.">The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib.</a> Thrombosis and Haemostasis. 103 (5), 1044-1052 (2010).</li><li>Nolte-&#8217;t Hoen, E. N. M., van der Vlist, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+flow+cytometric+analysis+of+nanosized+cell-derived+membrane+vesicles.">Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, And Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).</li><li>Van der Vlist, E. J., Nolte-&#8217;t Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li><li>Orozco, A. F., Lewis, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+circulating+microparticles+in+plasma.">Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma.</a> Cytometry Part A. 77 A. 77A (6), 502-514 (2010).</li></ol>

著者らは、開示することは利害関係のない。

EVの単離、処置および分析のための2つの異なるプロトコルは、個々の検出またはビーズベースのアプローチのいずれかを使用して、提示された。使用する最も適切な方法を選択することは必ずしも容易ではなく、興味のある個々の亜集団と同様にテストされているサンプルを理解する必要があります。最も適切な方法を選択する際にさらに、取得のために使用されるサイトメーターの感度を...

細胞外小胞（電気自動車）は、高度に細胞間コミュニケーションに関与し、生物学的プロセスの多様な範囲を規制する助けている体液で見つかった小さな、膜由来小胞である。フローサイトメトリー（FCM）を使用して、電気自動車の分析は、その小さなサイズと、目的のマーカーに陽性の別個の集団の不足のために悪名高く困難であった。かなり過去10年間に改善し、EV分析のための方法は、まだ進行中の作業である。残念ながら、そこにはフリーサイズのプロトコルではなく、使用するのが最も適切な方法を決定する際にいくつかの側面を考慮しなければなりません。ここで提示個々の検出またはビーズベースのアプローチのいずれかを使用して電気自動車を分析するためにEVやつのプロトコルを処理するための幾つかの異なる技術である。ここに記載される方法は、一般に市販の調製物に見られる抗体の凝集体を排除する信号対雑音比を増加させる、および合理的なfのでゲートを設定して支援するバックグラウンド蛍光の検出を最小にashion。第二のプロトコルをキャプチャ小さいEVやエキソソームを検出するために、ビーズベースのアプローチを使用しながら、第一のプロトコルは、臨床サンプルの高容量を分析するために特によく適している個々の検出方法を使用する。 また、微粒子としても知られている電気自動車は、細胞間コミュニケーションに関与し、生物学的プロセス1の多様な調節を助けている体液中に見出される小さな膜由来の小胞である。 4 -様々な表面マーカーおよび/ ​​または生物学的物質の直接転写の発現を介して、電気自動車は、細胞間コミュニケーションに2を活性化または抑制の役割のいずれかを再生するためにレシピエント細胞の機能を変化させることができる。他の腫瘍metastaを促進するから、広範な条件に寄与することが示されているが、臨床的に、血小板由来電気自動車は、強力な抗凝固活性5を有することが知られている病気7からの保護にSIS 6。電気自動車は、発電8のサイズやメカニズムに応じて、そのようなエキソソームと微小胞（MVの）などの細胞由来の小胞の小さいカテゴリーに分類することができる。細胞由来の小胞の集団の命名法は、MVSは1,000百大きいながらしかし、エキソソームは、一般的に、形質膜とエンドソームの融合に由来し、小さな、40から100ナノメートルの粒子として記載されている、現在進行中の議論8,9の話題であり続け原形質膜10の脱落によって形成さ以下の粒子。ここで、一般的な用語「電気自動車」とは、細胞によって放出される細胞外の生物小胞の全てのタイプを指すために使用される。 全血からのEVの単離は、多段階の手順であり、多くの異なる処理変数は、保存温度および期間11,12を含む、EVの内容に影響することが示されている、抗凝固剤/防腐剤13を使用し遠心法14を用いた。これらの変数の標準化の必要性は、適切な血液処理とEV分離手順のための血栓止血科学と標準化委員会（ISTH SSC）に関する国際学会勧告15,16につながっている、まだ、最適なプロトコル上の研究者の間でコンセンサスは存在しない12を使用する。最も厳密に制御前分析変数は、正確で再現性のあるデータのために重要であることが同意する。 電気自動車を分析するために、研究者らは、透過型電子顕微鏡17、走査型電子顕微鏡18,19、原子間力顕微鏡、20,21およびウェスタンブロッティング22,23を動的光散乱を含む様々な方法を利用している。 FCMは、多くの研究9,24のための選択の方法であるが-高いスループット能力に起因26、FCMを用いた電気自動車の分析がされている32 -そのサイズと離散正の集団27の欠如に難しいことで知ら。細胞の分析に比べて、必要となる粒子当たりの抗原の少ない数に起因して放出された1）以下蛍光電気自動車結果のサイズが小さく、後染色洗浄2）限られた可能性は、バックグラウンド蛍光を減少させる。研究者の間で共通の課題は、免疫グロブリン凝集体27,28および抗体29の自己凝集から生じる信号を含む。さらに、長い処理時間と現在のプロトコル33,34の多くで使用される長い洗濯/単離方法は、高スループットのアプリケーションに理想的で、それらが少なくなって、少数のサンプルを分析するために、マルチ日の時間のコミットメントを必要とする。一部の研究者は、正確にBACを評価するため、蛍光マイナス1（FMO）と抗体アイソタイプ役に立たないとして伝統的に使用されるFCMネガティブコントロールのレンダリング、完全に洗浄ステップを見送るkground蛍光30。 抗体凝集体および他の非小胞、非結合抗体を除去するのに難しさ、および識別可能な正の集団の不足から生じる信号：我々のプロトコルは、EVの適切なFCM分析を妨げることができる3つの一般的な問題に対処する。ここで説明される技術は、一般に市販の調製物に見られる抗体凝集体を排除する信号対雑音比を増加させると、バックグラウンド蛍光の検出を最小限にする合理的な方法でゲートを設定することで支援する。二つの異なる検出方法がここに提示されている：第二のプロトコルをキャプチャ小さいEVやエキソソームを検出するために、ビーズベースのアプローチを使用しながら、第一のプロトコルは、臨床サンプルの高容量を分析するために特によく適している個々の検出方法を使用する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >LSR II benchtop flow cytometer</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td ></td>
			<td >3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633nm red)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FACS Diva software&#160;</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td ></td>
			<td >PC version 6.0</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FlowJo software&#160;</td>
			<td >Treestar US</td>
			<td ></td>
			<td >Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sphero Rainbow fluorescent particles</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >556298</td>
			<td >used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultra Rainbow fluorescent particles&#160;</td>
			<td >Spherotech</td>
			<td >URFP-10-5</td>
			<td >used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Megmix-Plus SSC beads</td>
			<td >Biocytex</td>
			<td >7803</td>
			<td >used to adjust FSC and SSC&#160; voltages to maintain&#160; consistency&#160; between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AbC Anti-Mouse Bead Kit</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >A-10344</td>
			<td >used for compensation controls &#38; negative AbC beads used for beads-based method</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9)</td>
			<td >Santa Cruz&#160;</td>
			<td >sc-281108</td>
			<td >used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD TruCOUNT Tubes</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >340334</td>
			<td >used whenver absolute EV concentrations are needed</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultrafree-MC, GV 0.22 &#181;m Centrifugal Filter Units</td>
			<td >Millipore&#160;</td>
			<td >UFC30GVNB</td>
			<td >used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >364606</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Facs tubes 12x75 polystrene</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >352058</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50mL Reservoirs individually wrapped&#160;</td>
			<td >Phenix</td>
			<td >RR-50-1s</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Green-Pak pipet tips - 10&#181;L</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >GP-L10S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Green-Pak pipet tips -200&#181;L&#160;</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >GP-L250S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Green -Pak pipet tips - 1000&#181;L&#160;</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >GP-L1000S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stable Stack L300 tips presterilized</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >SS-L300S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet-Lite&#160;XLS 8 Channel LTS&#160;Adjustable&#160;Spacer&#160;</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >LA8-300XLS</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96 well tissue culture plates</td>
			<td >E&#38;K Scientific</td>
			<td >EK-20180</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640 Media (without Hepes)</td>
			<td >UCSF Cell Culture Facility</td>
			<td >CCFAE001</td>
			<td >media used for bead-based detection method</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2&#181;m filtered</td>
			<td >UCSF Cell Culture Facility</td>
			<td >CCFAL003</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear</td>
			<td >BECKMAN COULTER INC</td>
			<td >344058</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PANEL I</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD3 PerCP-Cy5.5</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >344808</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD14 APC-Cy7</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >301820</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD16 V450</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >560474</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD28 FITC</td>
			<td >biolegend</td>
			<td >302906</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD152 APC</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >555855</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD19 A700</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >302226</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PANEL II</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD41a PerCP-Cy5.5</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >340930</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD62L APC</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >304810</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD108 PE&#160;</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >552830</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD235a FITC</td>
			<td >biolegend</td>
			<td >349104</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PANEL III</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD11b PE-Cy7</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >301322</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD62p APC</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >304910</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD66b PE&#160;</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >305106</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD15 FITC</td>
			<td >exalpha</td>
			<td >X1496M</td>
			<td >5 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD9 PE</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >555372</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD63 APC</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >353008</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >APC-Cy7 Ms IgG2a, &#954;</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >400230</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry

細胞外小胞（電気自動車）は、高度に細胞間コミュニケーションに関与し、生物学的プロセスの多様な範囲を規制する助けている体液で見つかった小さな、膜由来小胞である。フローサイトメトリー（FCM）を使用して、電気自動車の分析は、その小さなサイズと、目的のマーカーに陽性の別個の集団の不足のために悪名高く困難であった。かなり過去10年間に改善し、EV分析のための方法は、まだ進行中の作業である。残念ながら、そこにはフリーサイズのプロトコルではなく、使用するのが最も適切な方法を決定する際にいくつかの側面を考慮しなければなりません。ここで提示個々の検出またはビーズベースのアプローチのいずれかを使用して電気自動車を分析するためにEVやつのプロトコルを処理するための幾つかの異なる技術である。ここに記載される方法は、一般に市販の調製物に見られる抗体の凝集体を排除する信号対雑音比を増加させる、および合理的なfのでゲートを設定して支援するバックグラウンド蛍光の検出を最小にashion。第二のプロトコルをキャプチャ小さいEVやエキソソームを検出するために、ビーズベースのアプローチを使用しながら、第一のプロトコルは、臨床サンプルの高容量を分析するために特によく適している個々の検出方法を使用する。

<html> 図1は 、ビーズベースの方法または個々の検出方法のいずれかを使用してEVの分離および検出のための全体的な処理方式の概要を説明します。 FCMを使用したEVの個々の検出は、より大きな電気自動車の分析に適していますが、ほとんどのサイトメーターは、個別にエキソソームと小さい粒子を検出することができない。ビーズベースのアプローチは、一般的に、表1</stro...

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Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

多くの異なる方法は、フローサイトメトリー（FCM）を使用して、細胞外小胞（電気自動車）の測定のために存在する。使用する最も適切な方法を決定する際にいくつかの側面を考慮すべきである。電気自動車を測定するための2つのプロトコルは、個々の検出またはビーズベースのアプローチのいずれかを使用して、提示されている。

フローサイトメトリーを用いて細胞外小胞の分析のための技術

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

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Research

JoVE Journal

Biology

23.0K ビュー.  Blood Systems Research Institute. 多くの異なる方法は、フローサイトメトリー（FCM）を使用して、細胞外小胞（電気自動車）の測定のために存在する。使用する最も適切な方法を決定する際にいくつかの側面を考慮すべきである。電気自動車を測定するための2つのプロトコルは、個々の検出またはビーズベースのアプローチのいずれかを使用して、提示されている。 

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Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

マウス減数分裂細胞のフローサイトメトリーの精製

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

生物学

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

細胞トラッキング染料を使用して細胞分裂監視のための最適化された染色と増殖モデリング方法

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

This protocol describes the use of bromodeoxyuridine (BrdU) uptake to permit the temporal tracking of cells that were in S phase at a specific point in time. Addition of DNA dyes and antibody labeling facilitates detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

同期を必要とせずに、フローサイトメトリーを用いた細胞周期の進行の時間追跡

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

スペクトラルフローサイトメトリーにより固形組織から単離された細胞懸濁液の分析

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for phenotypic analyses of extracellular vesicles (EV) including exosomes (Exo) in the peripheral blood and other body fluids. The small size of EV mandates the use of dedicated instruments having a detection threshold around 50-100 nm. Alternatively, EV can be bound to latex microbeads that can be detected by FC. Microbeads, conjugated with antibodies that recognize EV-associated markers/Cluster of Differentiation CD63, CD9, and CD81 can be used for EV capture. Exo isolated from CM can be analyzed with or without pre-enrichment by ultracentrifugation. This approach is suitable for EV analyses using conventional FC instruments. Our results demonstrate a linear correlation between Mean Fluorescence Intensity (MFI) values and EV concentration. Disrupting EV through sonication dramatically decreased MFI, indicating that the method does not detect membrane debris. We report an accurate and reliable method for the analysis of EV surface antigens, which can be easily implemented in any laboratory.

The protocol describes a reproducible method designed for use with cell culture supernatants to detect surface epitopes on small extracellular vesicles (EV). It utilizes specific EV immunoprecipitation using beads coupled with antibodies that recognize surface antigen CD9, CD63, and CD81. The method is optimized for downstream flow cytometry analysis.

フローサイトメトリー法による細胞小胞細胞調節されたメディアからの解析します。

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

細胞外小胞体のカエノールハブディティス・エレガンスの精製と分析

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving area of research. There are many different methods for EV isolation, each with distinct advantages and disadvantages that affect the downstream yield and purity of EVs. Thus, characterizing the EV prep isolated from a given source by a chosen method is important for interpretation of downstream results and comparison of results across laboratories. Various methods exist for determining the size and quantity of EVs, which can be altered by disease states or in response to external conditions. Nanoparticle tracking analysis (NTA) is one of the prominent technologies used for high-throughput analysis of individual EVs. Here, we present a detailed protocol for quantification and size determination of EVs isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma using a breakthrough technology for NTA representing major advances in the field. The results demonstrate that this method can deliver reproducible and valid total particle concentration and size distribution data for EVs isolated from different sources using different methods, as confirmed by transmission electron microscopy. The adaptation of this instrument for NTA will address the need for standardization in NTA methods to increase rigor and reproducibility in EV research.

We demonstrate how to use a novel nanoparticle tracking analysis instrument to estimate the size distribution and total particle concentration of extracellular vesicles isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma.

細胞外小胞の定量とサイズ決定のためのナノ粒子追跡解析

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and first-generation particle analysis to comprehensive multi-parameter measurements such as nano-flow cytometry (nFCM). nFCM is a form of flow cytometry that utilizes instrumentation specifically designed for nano-particle analysis, allowing for thousands of EVs to be characterized per minute both with and without the use of staining techniques. High resolution side scatter (SS) detection allows for size and concentration to be determined for all biological particles larger than 45 nm, while simultaneous fluorescence (FL) detection identifies the presence of labeled markers and targets of interest. Labeled subpopulations can then be described in quantitative units of particles/mL or as a percentage of the total particles identified by side scatter.
Here, EVs derived from conditioned cell culture media (CCM) are labeled with both a lipid dye, to identify particles with a membrane, and antibodies specific for CD9, CD63, and CD81 as common EV markers. Measurements of comparison material, a concentration standard and a size standard of silica nanospheres, as well as labeled sample material are analyzed in a 1-minute analysis. The software is then used to measure the concentration and size distribution profile of all particles, independent of labeling, before determining the particles that are positive for each of the labels.
Simultaneous SS and FL detection can be utilized flexibly with many different EV sources and labeling targets, both external and internal, describing EV samples in a comprehensive and quantitative manner.

The latest generation of EV characterization tools are capable of single EV analysis across multiple parameters simultaneously. Nano-flow cytometry measures all biological particles larger than 45 nm without labeling and identifies specific characteristics of subpopulations by a variety of fluorescent labeling techniques.

ナノフローサイトメトリーによる単一細胞外小胞膜貫通タンパク質の特性評価

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important players in the maintenance of organismal homeostasis and the progression of a wide spectrum of diseases. While the current research focuses on the characterization of endogenous exosomes with the endosomal origin, microvesicles blebbing from the plasma membrane have gained increasing attention in health and sickness, which are featured by an abundance of surface molecules recapitulating the membrane signature of parent cells. Here, a reproducible procedure is presented based on differential centrifugation for extracting and characterizing EVs from the plasma and solid tissues, such as the bone. The protocol further describes subsequent profiling of surface antigens and protein cargos of EVs, which are thus traceable for their derivations and identified with components related to potential function. This method will be useful for correlative, functional, and mechanistic analysis of EVs in biological, physiological, and pathological studies.

The present protocol describes a method to extract extracellular vesicles from the peripheral blood and solid tissues with subsequent profiling of surface antigens and protein cargos.

血漿および固体組織からのトレーサブルおよび機能化された細胞外小胞の単離と分析

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

イメージングフローサイトメトリーを用いた微生物オートアグリゲーションの定量解析

Imaging Flow Cytometry to Study Microbial Autoaggregation

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The Lactobacillaceae family consists of Gram-positive bacteria with confirmed probiotic properties. This study utilizes Lactobacillaceae species as a model to demonstrate the effectiveness of single-cell high throughput analysis in studying cellular aggregation. The focus is on analyzing the response of these beneficial species to simple carbohydrates from the diet.
The study showcases how Imaging Flow Cytometry (IFC) can overcome the fundamental differences in the assembly of probiotic bacteria in the presence and absence of carbohydrates. IFC combines the power and speed of conventional flow cytometry with the spatial resolution of microscopy, enabling high-rate complex morphometric measurements in a phenotypically defined manner across a library of beneficial bacterial strains and conditions. This protocol provides insights into the autoaggregation of Lactobacillaceae species and sheds light on their response to dietary carbohydrates, contributing to understanding the mechanisms behind the beneficial effects of these probiotic bacteria.

著者スポットライト:イメージングフローサイトメトリーを使用した微生物オートアグリゲーションの研究の進展

This protocol describes a quantitative approach to measure microbial autoaggregation using imaging flow cytometry.

微生物の自己凝集を研究するためのイメージングフローサイトメトリー

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The ...