Les auteurs tiennent à remercier Victoria Carpenter pour ses commentaires critiques de ce protocole.

Partie I - inactivation génique médiée par ARNi dans les moustiques adultes, Aedes aegypti. Pour un aperçu expérience voir la figure 1. 1. Synthèse ARNdb <ol><li> Synthétiser ARNdb spécifiques contre les gènes de ARNdb d&#39;intérêt et de contrôle. Remarque: Nous recommandons amorces développement pour les fragments PCR de l&#39;ordre de 300 à 500 paires de bases situées à l&#39;extrémité 3 &#39;de la 2 ADNc spécifique et avec la séquence d&#39;amorce T7 attaché à l&#39;extrémité 5&#39; (5&#39;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3 &#39;). Unicité des fragments doivent être confirmés par l&#39;analyse BLASTN 3. </li><li> Utilisez le Ambion Megascript T7 Kit Haut Rendement de transcription (Ambion, la table des réactifs) qui utilise la T7 RNA polymérase pour la réaction de transcription de synthétiser ARNdb. Remarque: réactifs et des kits similaires sont disponibles nulle part ailleurs. </li><li> Pour purifier ARNdb, précipiter avec du chlorure de lithium suivant les instructions fournies avec le kit Megascript. </li><li> Après purificatd&#39;ions, dissoudre le culot ARNdb dans l&#39;eau stérile. Afin d&#39;assurer une viscosité adéquate pour la microinjection, la concentration ARNdb ne doit pas dépasser 2 g / ul. </li></ol> 2. Préparation à l&#39;injection <ol><li> Un simple micro injecteur peut être construit en utilisant des tubes, des ciseaux, une aiguille en métal, une seringue de 1 ml, 1 ml et un embout de pipette en plastique (voir figure 2). Le tube doit être coupé à environ 40 cm de longueur. Alternativement, un système automatisé micro injecteur peut être utilisé comme Drummond Nanojet II 4. <ol><li> Couper l&#39;extrémité de la seringue (moyeu de l&#39;aiguille) à 2 ml graduation et de supprimer la tête de piston en caoutchouc du plongeur. </li><li> Percer un trou à l&#39;aide d&#39;une aiguille métallique dans la tête piston en caoutchouc et le lieu de la tête en caoutchouc piston dans le moyeu de l&#39;aiguille. </li><li> Placez le moyeu de l&#39;aiguille à une extrémité du tube et placer un embout 1 ml en plastique de la pipette dans l&#39;autre extrémité, qui sera utilisé comme pièce d&#39;embouchure (alternativement, un 10 ml syringe peut être utilisé pour produire la pression de l&#39;air nécessaire pour l&#39;injection). </li></ol></li><li> Placer une aiguille capillaire en verre dans le trou dans le piston en caoutchouc tête et briser la pointe de l&#39;aiguille hors de sorte que la largeur est suffisamment grand pour le liquide à s&#39;écouler à travers. Remarque: La taille optimale de la pointe de l&#39;aiguille doit être déterminé de manière empirique - si la largeur de l&#39;aiguille est trop grosse cela se traduira par un traumatisme et un taux élevé de mortalité des moustiques, si la largeur de l&#39;aiguille est trop petite, il sera impossible de pénétrer l&#39;exosquelette des moustiques. </li><li> Submerger l&#39;aiguille d&#39;injection dans l&#39;échantillon préparé ARNdb et aspirer l&#39;échantillon liquide dans l&#39;aiguille d&#39;injection en aspirant le liquide avec la pièce de bouche (ou une seringue). Remarque: Cette étape est identique pour tous les réactifs liquides qui sont injectés dans les moustiques, y compris du tampon PBS, qui est utilisé dans le test in vivo dans le protocole diurèse (voir ci-dessous). </li></ol> 3. Recueillir et Anesthésier moustiques <ol><li> Collecmoustiques t avec un aspirateur à piles dans un flacon de collecte. Placer un bouchon sur le flacon de collecte et de placer le flacon sur une CO 2 tampon propre à anesthésier les moustiques. Remarque: vous pouvez les moustiques peuvent être anesthésiés sur la glace. </li></ol> 4. Injection Mosquito <ol><li> Ouvrez le flacon de collecte et de placer les moustiques directement sur ​​le CO 2 pad et attendre jusqu&#39;à ce que les moustiques sont anesthésiés. </li><li> Jeter tous les hommes. </li><li> Alignez les moustiques sur le côté pour permettre un accès plus facile pour l&#39;injection. </li><li> Prenez les moustiques par les jambes ou les ailes pour éviter les blessures. Vous pouvez également utiliser un pinceau fin ou de la plume de manipuler les moustiques. </li><li> Lorsque vous êtes prêt à injecter le moustique d&#39;abord, doucement soutenir d&#39;un côté du thorax avec des pinces et insérez la pointe de l&#39;aiguille de l&#39;autre côté du thorax (Figure 2). Il est préférable d&#39;injecter dans une partie fine de la cuticule et éviter de pousser l&#39;aiguille ào profondément dans le thorax. </li><li> Une fois que l&#39;aiguille est en place, faire sauter le liquide dans le moustique. La quantité désirée peut être déterminée en contrôlant le ménisque du liquide dans l&#39;aiguille. Le nombre de millimètres nécessaires pour un volume spécifique peut être déterminée en calculant le volume du cylindre de l&#39;aiguille capillaire en verre (πr 2 h). La quantité efficace d&#39;ARNdb qui est généralement utilisé pour l&#39;injection est de 1 mg. </li><li> Une fois que le liquide est injecté dans des moustiques, soigneusement retirer l&#39;aiguille. Si quelques grandes formes de gouttelettes liquides à l&#39;extérieur du thorax, le moustique doit être jeté. Ensuite, répéter ce processus avec le prochain moustique. </li></ol> 5. Récupération Mosquito et le stockage <ol><li> Après l&#39;injection, placez les moustiques dans un conteneur pour le stockage. Par exemple, une cire pinte bordée tasses en carton (tasses à soupe) d&#39;un filet de recouvrement fixé avec le couvercle en carton. Le couvercle comporte une partie découpée pour le maillage couvrant d&#39;être exposés. Une fois tous les moissquitoes sont placés dans le conteneur, placez le récipient dans une chambre à environnement contrôlé pour l&#39;incubation et de fournir les moustiques avec une source de nourriture, tels que des billes de saccharose 20% coton imbibés placés au-dessus du revêtement en maille. Avant d&#39;effectuer le dosage in vivo la diurèse, priver les moustiques ARNdb injecté d&#39;une source d&#39;eau pendant 12 heures pour normaliser l&#39;état d&#39;hydratation de chaque moustique. </li><li> L&#39;efficacité de inactivation génique ARNdb médiation peut être variable. Gene silencing pourrait commencer un jour après l&#39;injection et cela pourrait durer jusqu&#39;à 6 jours après l&#39;injection 4. Le moment optimal pour atteindre inactivation génique maximale doit être déterminée empiriquement pour chaque gène utilisé. En général, nous attendre 3 jours après l&#39;injection ARNdb avant que nous procédions. </li></ol> Partie II - En test in vivo chez l&#39;adulte diurèse moustiques du genre Aedes aegypti Remarque: Ce protocole a été développé par les auteurs etutilisé pour l&#39;ARNi à médiation knockdown de protéines aquaporines dans le moustique de la fièvre jaune Aedes aegypti 1. Pour éviter la variabilité entre les moustiques individuels, les moustiques devraient être analysées dans les groupes. Pour des raisons techniques, nous vous recommandons des groupes de 5 moustiques par traitement - il ya une quantité limitée de temps pour effectuer la mesure du poids d&#39;abord avant de commencer à excréter les moustiques d&#39;urine après l&#39;injection. 6. Recueillir et Anesthésier moustiques <ol><li> Avant la collecte des moustiques, enregistrer le poids d&#39;un flacon de prélèvement vide avec un bouchon en utilisant une balance de précision analytique. Ce flacon sera utilisé pour toutes les mesures ultérieures. </li><li> Collecter 5 moustiques femelles dans le flacon de collecte pesé avec un aspirateur. Placez le capuchon sur le flacon de collecte et laissez-le reposer sur le CO 2 pad pendant plusieurs secondes pour anesthésier les moustiques. </li></ol> 7. Mesure du poids initial <ol><li> Prenez til la mesure du poids initial des 5 moustiques en plaçant le flacon collection contenant les moustiques avec le couvercle sur la balance de précision. </li><li> Calculer le poids du groupe de 5 moustiques en prenant le poids des moustiques et le flacon de collecte avec bouchon et en soustrayant le poids du flacon avec bouchon collection vide. </li><li> Ouvrir le flacon de collecte et de placer les moustiques directement sur ​​le coussin de CO 2 après l&#39;enregistrement des poids des moustiques. Si les moustiques commencent à se réveiller pendant les mesures de poids, mettre le flacon sur le CO 2 pad pendant plusieurs secondes avant de l&#39;ouvrir et en plaçant les moustiques sur le pavé. </li></ol> 8. Préparation à l&#39;injection <ol><li> Mettre en place l&#39;injecteur micro en suivant les instructions données dans le protocole ARNi médiée par des gènes knockdown. </li><li> Placer une aiguille capillaire en verre dans l&#39;injecteur micro et briser la pointe de l&#39;aiguille de sorte que la largeur est assez grand pour LIQuid de s&#39;écouler à travers. </li><li> Immerger l&#39;aiguille dans du tampon PBS et d&#39;en tirer la mémoire tampon dans l&#39;aiguille d&#39;injection, la quantité désirée à utiliser pour ce protocole est de 1,25 l de PBS pour chaque moustique. Remarque: Ce montant imite le montant moyen du plasma sanguin qui est repris par un moustique femelle 5. </li></ol> 9. Injection Mosquito <ol><li> Alignez les moustiques afin de permettre un accès plus facile avec l&#39;injecteur micro. </li><li> Une fois que l&#39;aiguille est en place, sauter tampon PBS dans le moustique. </li><li> Une fois que le liquide est injecté dans le moustique, une gouttelette peut former à l&#39;extérieur du thorax. Cette gouttelette doit être soigneusement enlevé avant l&#39;étape suivante. </li><li> Répétez ce processus d&#39;injection avec le prochain moustique. Avec l&#39;expérience, le taux de survie des moustiques sera près de 100% après l&#39;injection. </li></ol> 10. Les moustiques de pesage <ol><li> Après l&#39;injection, placez doucement les moustiques dans le flacon de collecteet le bouchon. Prendre la mesure du poids d&#39;abord les 5 moustiques en plaçant le flacon collection contenant les moustiques avec le couvercle sur la balance de précision. </li><li> Calculer le poids du groupe de 5 moustiques en prenant le poids des moustiques et le flacon de collecte avec bouchon et soustraire le poids du flacon avec bouchon collection vide. Remarque: les moustiques commencent à excréter l&#39;urine dans les 2 minutes après le retrait du CO 2 pad anesthésie, il est donc important de prendre la mesure du poids avant qu&#39;ils ne commencent à excréter. </li><li> Placez les moustiques dans un petit récipient où ils commencent à excréter l&#39;urine. </li></ol> 11. Mesures deuxième poids et la suite Remarque: Les mesures de poids des moustiques doivent être prises à intervalles de 30 minutes, mais cela peut être ajusté à intervalles plus courts ou plus selon les taux d&#39;excrétion. <ol><li> Après 30 minutes, recueillir le Group 5 moustiques avec un aspirateur dans le flacon même collection, avec bouchon. Prendre la mesure du poids à côté des moustiques en plaçant le flacon collection contenant les moustiques avec le couvercle sur la balance de précision. </li><li> Après la mesure, placez les moustiques dans le conteneur même exploitation pour les 30 prochaines minutes. </li><li> Répétez cette procédure pour un montant de temps désirée. </li></ol> 12. Détermination Taux d&#39;excrétion Mosquito <ol><li> La quantité totale de liquide qui a été injecté dans le groupe de 5 moustiques peut être calculée en soustrayant le poids initial des moustiques du poids immédiatement après l&#39;injection. </li><li> La quantité d&#39;urine qui a été éliminée par le groupe de moustiques à un moment spécifique peut être calculée en soustrayant le poids initial des moustiques de la masse des moustiques au point de temps spécifique. </li><li> Le taux d&#39;excrétion à un moment spécifique peut être calculée par divisionding la quantité d&#39;urine excrétée à ce point de temps de la quantité totale de liquide injecté (Tableau 1). </li></ol> 13. Les résultats représentatifs ARNi médiée par inactivation génique et en test in vivo la diurèse ont été utilisés par le laboratoire Hansen pour étudier les effets de aquaporines dans moustique Aedes aegypti diurèse. Trois aquaporines qui sont exprimées dans les tubules de Malpighi Aedes aegypti ont été renversés avec des effets significatifs sur les taux d&#39;excrétion par rapport à lutter contre les moustiques 1. La figure 4 montre des résultats représentatifs d&#39;une expérience où le dosage a une diurèse été utilisée pour comparer les taux d&#39;excrétion entre Aedes aegypti et Culex quinquefasciatus à des températures différentes. <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Organigramme de l&#39;essai ARNi / diurèse. 5 groupes de 10 moustiques each sont injectés avec ARNdb pour un gène spécifique, et cinq autres groupes de dix moustiques sont injectés avec un contrôle ARNdb. Un autre groupe de moustiques injectés avec 200 uM dans du PBS HgCl 2 est utilisé comme contrôle positif. Ces moustiques sont pesés avant l&#39;injection, et après l&#39;injection dans les trente minutes d&#39;intervalle pendant 3 heures. <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Un dispositif d&#39;injection simple micro pour la inactivation génique médiée par ARNi et test in vivo la diurèse. A. Les aiguilles de verre capillaires utilisés pour l&#39;injection. Le triangle gris représente les incréments millimétriques tirés sur l&#39;aiguille pour indiquer la quantité de liquide injecté dans le moustique. B. 1 seringue ml utilisée pour construire l&#39;injecteur micro. Le triangle blanc représente le moyeu d&#39;aiguille et le triangle noir représente la tête du piston en caoutchouc fixé sur le piston dans la seringue. C. Le tube utilisé pour fixer l&#39;embout buccal pourl&#39;injecteur. D. 1 ml embout jetable de pipette (pointe bleue) qui est utilisé comme porte-parole de l&#39;appareil micro-injection. E. Le dispositif de micro-injection qui intègre des parties AD. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3479/3479fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Optimale au site d&#39;injection moustiques. A. Femme moustique Aedes aegypti injecté avec une aiguille capillaire en verre entre les grandes échelles sur le thorax. La barre noire indique 1 mm pour comparaison de taille. B. Un dessin du thorax moustique femelle et les taches blanches représentent les écailles blanches dans l&#39;exosquelette des moustiques. L&#39;aiguille d&#39;injection doit percer le moustique entre les taches afin de minimiser le taux de mortalité lors de l&#39;injection. <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Effets de la températureture sur Culex quinquefasciatus et Aedes aegypti diurèse. Le test a été réalisé avec la diurèse deux espèces de moustiques, Aedes aegypti et Culex quinquefasciatus, à différentes températures. Le taux d&#39;excrétion au cours de la première heure après l&#39;injection est donnée en pour cent. <table border="1"><tbody><tr><td> Groupe </td><td> TARA (G) </td><td> ne pas injecter (G) </td><td> après l&#39;injection (G) </td><td> 1h après l&#39;injection (G) </td><td> poids moyen (mg) </td><td> quantité injectée (Pl) </td><td> quantité excrétée (Pl) </td><td> % Excrété </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 7,5938 </td><td> 7,6057 </td><td> 7,6104 </td><td> 7,6096 </td><td> 2,38 </td><td> 0,94 </td><td> 0,16 </td><td> 17,0 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 7,8252 </td><td> 7,8349 </td><td> 7,8415 </td><td> 7,8403 </td><td> 1,94 </td><td> 1,32 </td><td> 0,24 </td><td> 18,2 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 7,8896 </td><td> 7,9026 </td><td> 7,9077 </td><td> 7,906 </td><td> 2.6 </td><td> 1,02 </td><td> 0,34 </td><td> 33,3 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Aedes aegypti dans les résultats in vivo de dosage Diurèse. Les données brutes provenant de la diurèse dans le test in vivo réalisées avec les moustiques Aedes aegypti femelles à 4 ° C.

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	<li>Drake, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aquaporin+gene+family+of+the+yellow+fever+mosquito,+Aedes+aegypti.">The Aquaporin gene family of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> PloS one. 5, e15578 (2010).</li><li>Shepard, A. R., Jacobson, N., Clark, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+quantitative+PCR+primer+location+for+short+interfering+RNA+efficacy+determination.">Importance of quantitative PCR primer location for short interfering RNA efficacy determination.</a> Analytical biochemistry. 344, 287-288 (2005).</li><li>Altschul, S. 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Biol. 206 (Pt 21), 3845-3856 (2003).</li><li>Coast, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+recording+of+excretory+water+loss+from+Musca+domestica+using+a+flow-through+humidity+meter:+hormonal+control+of+diuresis.">Continuous recording of excretory water loss from Musca domestica using a flow-through humidity meter: hormonal control of diuresis.</a> Journal of insect physiology. 50, 455-468 (2004).</li><li>Kersch, C. N., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+Aedes+aegypti+(L.)+leucokinin+receptor+is+critical+for+in+vivo+fluid+excretion+post+blood+feeding.">Mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is critical for in vivo fluid excretion post blood feeding.</a> FEBS letters. 585, 3507-3512 (2011).</li><li>Hays, A. R., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+protein+produced+by+the+vitellogenic+fat+body+and+accumulated+in+mosquito+oocytes.">A novel protein produced by the vitellogenic fat body and accumulated in mosquito oocytes.</a> Development Genes and Evolution. 199, 114-121 (1990).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Le protocole utilisé ARNi a été développé dans le laboratoire d&#39;Alexandre Raikhel à l&#39;Université de Californie Riverside 6,7 et est semblable à un protocole publié par Garver et Dimopoulos 4. L&#39;approche expérimentale montré dans ce protocole vidéo peut être utilisée pour étudier les gènes impliqués dans la diurèse des insectes dans un cadre en vivo. Les organes excréteurs des insectes, les tubes de Malpighi, ont attiré l&#39;intérêt des générations de ch...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif ou de l&#39;équipement </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 Kit High Yield </td><td> Ambion, Inc </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon PBS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td> Tubes en plastique </td><td> Fournisseur local </td><td></td><td> PVC </td></tr><tr><td> 1 ml en plastique pointe de pipette </td><td> VWR </td><td> 83007-376 </td><td> Embout bleu </td></tr><tr><td> Seringue de 1 ml </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 309602 </td><td></td></tr><tr><td> Ciseaux </td><td> Fournisseur local </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Aiguille métallique </td><td> Caroline Biologicals </td><td> 654307 </td&gt; <td> Taille 5 </td></tr><tr><td> Fly pad </td><td> Genesee scientifique </td><td> 789060 </td><td></td></tr><tr><td> Alimenté par batterie aspirateur w / collection flacon </td><td> Labs UPMA </td><td> IPMM 2000 </td><td></td></tr><tr><td> Pince pointe fine </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> 14095 </td><td></td></tr><tr><td> Aiguilles capillaires en verre pour </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> 1B200-6 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope à dissection stéréo </td><td> Leica Microsystems </td><td> S6D </td><td></td></tr><tr><td> Balance de précision analytique </td><td> Mettler Toledo </td><td> AB54S </td><td></td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 84097 </td><td></td></tr><tr><td> Un demi-litre ciré tasses en carton doublés </td><td> Fournisseur local </td><td></td><td> Tasses à soupe Fabricant </td></tr><tr><td> Filet à mailles </td><td> Fournisseur local </td><td></td><td> gaze mouche en plastique </td></tr></tbody></table>

rnai-mediated gene knockdown and in vivo diuresis assay in adult female aedes aegypti mosquitoes

Ce protocole vidéo montre une technique efficace pour effet de choc d&#39;un gène particulier dans un insecte et de mener un essai biologique roman pour mesurer le taux d&#39;excrétion. Cette méthode peut être utilisée pour obtenir une meilleure compréhension du processus de la diurèse chez les insectes et est particulièrement utile dans l&#39;étude de la diurèse dans le sang d&#39;alimentation arthropodes qui sont en mesure de prendre d&#39;énormes quantités de liquide dans un repas de sang unique. Cette inactivation génique médiée par ARNi combiné avec un test in vivo diurèse a été développé par le laboratoire Hansen pour étudier les effets de l&#39;ARNi à médiation knockdown de gènes d&#39;aquaporines sur moustique Aedes aegypti diurèse 1. Le protocole est configuré en deux parties: la première démonstration illustre comment construire un dispositif simple moustique injection et comment préparer et injecter ARNdb dans le thorax de moustiques pour inactivation génique médiée par ARNi. La deuxième démonstration illustre comment déterminerles taux d&#39;excrétion chez les moustiques en utilisant un dosage biologique in vivo.

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RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

Dans ce protocole, nous combinons silencing RNAi-médiée avec un gène<em&gt; In vivo</emDosage diurèse&gt; pour étudier l&#39;effet de choc effets de gènes d&#39;intérêt a sur l&#39;excrétion de liquide moustiques.

Inactivation génique médiée par ARNi et<em&gt; In Vivo</emEssai diurèse&gt; Femmes adultes<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Les moustiques

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

rnai-mediated-gene-knockdown-vivo-diuresis-assay-adult-female-aedes

Research

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RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

13.5K vues.  New Mexico State University. Dans ce protocole, nous combinons silencing RNAi-médiée avec un gène In vivo pour étudier l'effet de choc effets de gènes d'intérêt a sur l'excrétion de liquide moustiques.

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Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus.  The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

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L&#39;injection d&#39;ARNdb dans Femme Mosquitos aegypti A.

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Biologie

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microinjection d&#39;embryons aegypti a. Pour obtenir les moustiques transgéniques

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Protocole pour la dengue dans les moustiques (Aedes aegypti) et détermination de phénotype d&#39;infection

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol demonstrates dissection techniques for removal of the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes. 



The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for vector pathogens like Plasmodium falciparum and the dengue virus. This video demonstrates the dissection techniques for removing the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes.

Dissection des glandes salivaires de l&#39;intestin moyen et Ae. aegypti

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression analyses by RNA interference and stable transgenesis remain limited in many species due to the particular anatomy and molecular cellular biology of the organism. For example, outside of the crown group Caenorhabditis that includes Caenorhabditis elegans3, stably transmitted transgenic lines in non-Caenorhabditis species have not been reported in this specious phylum (Nematoda), with the exception of Strongyloides stercoralis4 and Pristionchus pacificus5. To facilitate the expanding role of P. pacificus in the study of development, evolution, and behavior6-7, we describe here the current methods to use microinjection for making transgenic animals and gene knock down by RNAi. Like the gonads of C. elegans and most other nematodes, the gonads of P. pacificus is syncitial and capable of incorporating DNA and RNA into the oocytes when delivered by direct microinjection. Unlike C. elegans however, stable transgene inheritance and somatic expression in P. pacificus requires the addition of self genomic DNA digested with endonucleases complementary to the ends of target transgenes and coinjection markers5. The addition of carrier genomic DNA is similar to the requirement for transgene expression in Strongyloides stercoralis4 and in the germ cells of C. elegans. However, it is not clear if the specific requirement for the animals' own genomic DNA is because P. pacificus soma is very efficient at silencing non-complex multi-copy genes or that extrachromosomal arrays in P. pacificus require genomic sequences for proper kinetochore assembly during mitosis. The ventral migration of the two-armed (didelphic) gonads in hermaphrodites further complicates the ability to inject both gonads in individual worms8. We also demonstrate the use of microinjection to knockdown a dominant mutant (roller,tu92) by injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the gonads to obtain non-rolling F1 progeny. Unlike C. elegans, but like most other nematodes, P. pacificus PS312 is not receptive to systemic RNAi via feeding and soaking and therefore dsRNA must be administered by microinjection into the syncitial gonads. In this current study, we hope to describe the microinjection process needed to transform a Ppa-egl-4 promoter::GFP fusion reporter and knockdown a dominant roller prl-1 (tu92) mutant in a visually informative protocol.

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In model organisms, transgenesis can manipulate gene functions while RNAi can knockdown specific mRNA transcripts 1-2. This protocol aims to illustrate the techniques needed to introduce stably transmitted DNA and transient double stranded RNA into the necromenic nematode Pristionchus pacificus for studies in evolutionary, developmental, and behavioral biology.

ARNi Mediated inactivation génique et la transgénèse par microinjection dans le nématode Necromenic Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolement du ribosome Bound polypeptides naissants<em&gt; In vitro</em&gt; Pour identifier les sites de pause de translation le long d&#39;ARNm

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Utilisation de la séquence d&#39;arrêt SecM comme un outil pour isoler les polypeptides Ribosome Bound

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

In Vivo transfection de siRNA et Gene Knockdown dans la moelle épinière via rapide non invasive lombaire intrathécale injections chez des souris

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect fat body tissue is usually distributed throughout the insect body. However, it is often concentrated in the abdomen and attached to the abdominal body wall.
The mosquito fat body is the sole source of yolk proteins, which are critical for egg production. Therefore, the in vitro culture of mosquito fat body tissues represents an important system for the study of mosquito physiology, metabolism, and, ultimately, egg production. The fat body culture process begins with the preparation of solutions and reagents, including amino acid stock solutions, Aedes physiological saline salt stock solution (APS), calcium stock solution, and fat body culture medium. The process continues with fat body dissection, followed by an experimental treatment. After treatment, a variety of different analyses can be performed, including RNA sequencing (RNA-Seq), qPCR, Western blots, proteomics, and metabolomics.
In our example experiment, we demonstrate the protocol through the excision and culture of fat bodies from the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, a principal vector of arboviruses including dengue, chikungunya, and Zika. RNA from fat bodies cultured under a physiological condition known to upregulate yolk proteins versus the control were subject to RNA-Seq analysis to demonstrate the potential utility of this procedure for investigations of gene expression.

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The fat body is the central metabolic organ in insects. We present a live organ culture system that enables the user to study the responses of isolated fat body tissue to various stimuli.

Système de Culture ou organe de corps gras chez Aedes Aegypti, vecteur de Virus Zika

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, chikungunya and Zika. Wolbachia-infected mosquitoes can be released into the field to either reduce population sizes through incompatible matings or to transform populations with mosquitoes that are refractory to virus transmission. For these strategies to succeed, the mosquitoes released into the field from the laboratory must be competitive with native mosquitoes. However, maintaining mosquitoes in the laboratory can result in inbreeding, genetic drift and laboratory adaptation which can reduce their fitness in the field and may confound the results of experiments. To test the suitability of different Wolbachia infections for deployment in the field, it is necessary to maintain mosquitoes in a controlled laboratory environment across multiple generations. We describe a simple protocol for maintaining Ae. aegypti mosquitoes in the laboratory, which is suitable for both Wolbachia-infected and wild-type mosquitoes. The methods minimize laboratory adaptation and implement outcrossing to increase the relevance of experiments to field mosquitoes. Additionally, colonies are maintained under optimal conditions to maximize their fitness for open field releases.

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia are being released into natural populations to suppress the transmission of arboviruses. We describe methods to rear Ae. aegypti with Wolbachia infections in the laboratory for experiments and field release, taking precautions to minimize laboratory adaptation and selection.

Maintenir les moustiques Aedes aegypti infectés par Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Inactivation génique médiée par ARNi et

Résumé

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Chapitres dans cette vidéo

L'injection d'ARNdb dans Femme Mosquitos aegypti A.

Microinjection d'embryons aegypti a. Pour obtenir les moustiques transgéniques

Protocole pour la dengue dans les moustiques (Aedes aegypti) et détermination de phénotype d'infection

Dissection des glandes salivaires de l'intestin moyen et Ae. aegypti

ARNi Mediated inactivation génique et la transgénèse par microinjection dans le nématode Necromenic Pristionchus pacificus

Isolement du ribosome Bound polypeptides naissants

Utilisation de la séquence d'arrêt SecM comme un outil pour isoler les polypeptides Ribosome Bound

In Vivo transfection de siRNA et Gene Knockdown dans la moelle épinière via rapide non invasive lombaire intrathécale injections chez des souris

Système de Culture ou organe de corps gras chez Aedes Aegypti, vecteur de Virus Zika

Maintenir les moustiques Aedes aegypti infectés par Wolbachia