L’interférence ARN est l’un des principaux outils utilisés pour la génétique inverse chez les moustiques et l’administration orale nous permet d’induire et de maintenir le silençage génique chez les moustiques adultes sans avoir besoin de micro-injection. L’administration orale d’ARN double brin aux moustiques adultes est une méthode d’interférence ARN peu coûteuse et polyvalente qui réduit considérablement le travail, le temps et les efforts pour étudier la fonction des gènes. Cette méthode pourrait être utilisée pour étudier non seulement d’autres gènes cibles chez Anopheles gambiae, mais aussi chez d’autres anophèles d’intérêt tels que Anopheles albinamus.
Pour commencer, cultivez une culture à partir d’une seule colonie bactérienne de la souche HT115(DE3) d’Escherichia coli contenant l’ARN double brin exprimant le plasmide dans cinq millilitres de lb contenant de l’ampicilline et de la tétracycline sur un agitateur de plate-forme pendant 12 heures à 37 degrés Celsius et 180 RPM. Après 12 heures, prendre 0,5 millilitre de la culture bactérienne cultivée pendant la nuit et faire une dilution sur 1000 dans 2X milieux de tryptine de levure contenant de l’ampicilline et de la tétracycline. Pour induire la production d’ARN double brin, ajoutez IPDG à la concentration finale de 40 micromolaires.
Ensuite, incubez la culture pendant deux heures dans des conditions d’agitation comme démontré. À la fin de l’incubation, lorsque la densité optique de la culture atteint 0,4 à 600 nanomètres, pastillez les cellules bactériennes par centrification à 4 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, puis lavez les cellules dans un volume de PBS. Après avoir fait tourner les cellules une fois de plus, remettez les cellules en PBS et incubez à 70 degrés Celsius pendant une heure.
Après avoir tué les bactéries par la chaleur, faites des aliquotes de 400 microlitres de volume et stockez-les à 20 degrés Celsius jusqu’à une utilisation ultérieure. Mélanger une aliquote de 400 microlitres de bactéries tuées par la chaleur de dégel exprimant de l’ARN double brin avec 1,6 millilitre de solution de sucre à 12% contenant 0,2% de méthylparabène. Faites tremper une petite boule de coton dans cette solution et placez-la dans une cage contenant des moustiques de cinq jours et assurez-vous que les moustiques se nourrissent de cette solution.
Changez la boule de coton imbibée dans une solution de sucre à ARN double brin tous les deux jours pendant huit jours consécutifs, en veillant à ce que la cage soit maintenue dans des conditions constantes. Pour anesthésier les moustiques avec le froid, placez le récipient sur la glace jusqu’à ce que les moustiques cessent de bouger, puis placez les moustiques sur une surface froide pour isoler les femelles pour les dissection. Après avoir pulvérisé de l’éthanol sur les moustiques, placez-les sur une surface en verre avec du PBS.
Avec une paire de pinces, fixez la tête du moustique et tirez le thorax très lentement, ce qui permet aux glandes salivaires d’être libérées dans le PBS. Une fois que les glandes salivaires sont disséquées de 10 moustiques, tirez les glandes pour l’extraction de l’ARN. Une fois l’extraction de l’ARN terminée, suspendez la pastille d’ARN dans 30 microlitres d’eau libre d’ARN.
Mesurez l’absorbance et calculez la concentration d’ARN comme décrit dans le manuscrit textuel. À l’aide d’un kit de transcription inverse commercial, synthétisez l’ADNc à partir d’un microgramme d’ARN. Diluer l’ADNc 10 fois et mettre en place les réactions RTPCR en trois exemplaires pour les gènes cibles et d’entretien ménager conformément aux recommandations du fabricant.
Amplifiez le CDNA avec des conditions PCR standard en temps réel. Pour évaluer la capacité à se nourrir dans le sang, placez des groupes de 15 moustiques femelles traités avec de l’ARN double brin cible et contrôlé dans de petites cages et affamez-les pendant quatre heures. Fournissez du sang défibrillé bon marché aux moustiques à l’aide d’un bain-marie circulant réglé à 37 degrés Celsius, de mangeoires à moustiques en verre et d’une membrane de remplissage.
Observez, comptez et enregistrez le nombre de tentatives d’enquête pour obtenir avec succès un repas de sang des cinq premières femelles pour devenir complètement engorgées dans chaque groupe. Après avoir isolé les tissus frais et le PBS a déjà démontré, fixez-le dans de l’acétone glacée pendant 90 secondes. Ensuite, rincez le tissu plusieurs fois dans le PBS et incubez avec des anticorps primaires pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec un anti-sérum dilué dans du PBS.
À la fin de l’incubation, lavez le tissu plusieurs fois avec du PBS. Ajouter les anticorps secondaires fluorescents dilués dans le PBS et incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant deux heures. Ajouter toute tache de comptoir 30 minutes avant la fin de l’incubation de deux heures.
Après deux heures, lavez le tissu trois fois avec du PBS, puis montez les tissus dans du glycérol à 100% sur une lame de microscope standard avec un couvercle d’un millimètre d’épaisseur et stockez à 20 degrés Celsius jusqu’à l’imagerie. Les données sur l’expression des microrays ont montré l’expression de tous les gènes ciblés choisis dans les glandes salivaires adultes et les niveaux d’AAPP et de sauge étaient particulièrement élevés. L’ARN double brin a efficacement réduit l’abondance des transcriptions de la tête de fourche dans la glande salivaire.
Les moustiques nourris à l’ARN double brin de la tête de fourche présentaient cinq fois plus de tentatives d’alimentation que le groupe témoin ou les moustiques nourris à l’ARN double brin de sexe double FEG pour être complètement engorgés de sang. Les niveaux de coloration à la sauge et à La CrebA ont été nettement réduits dans tous les lobes des glandes salivaires à la suite d’une interférence ARN de la tête de fourche par rapport à l’interférence ARN du contrôle des fourmis. Lors de l’examen des protéines de composants salivaires très abondantes, les niveaux d’AAPP ont été réduits dans les trois lobes des glandes salivaires à la suite d’une interférence ARN de la tête de fourche par rapport au traitement d’interférence ARN de contrôle.
D’autre part, aucun changement dans les niveaux de mucine n’a été observé. Ces données suggèrent que la tête de fourche contribue différemment à l’expression de différents gènes de protéines salivaires. Une réduction de la fluorescence rab11 a été observée dans les lobes latéraux distaux après un traitement d’interférence ARN de la tête de fourche, cependant, une augmentation du signal Rab11 dans les lobes latéraux médial et proximal s’est également produite.
Aucune différence perceptible n’a été observée dans le signal rouge du Nil après interférence ARN de la tête de fourche par rapport au traitement d’interférence ARN témoin. certaines réactions de la machine secrétaire d’une manière complexe qui diffère entre les lobes des glandes salivaires. Cette technique pourrait permettre aux chercheurs de faire taire les gènes dont l’expression peut être réduite par une seule injection d’ARN double brin et d’explorer l’administration orale d’ARN double brin pour utiliser l’ARNi comme méthode potentielle de lutte antivectorielle.
