We thank Dr. Helene Bernstein for providing us with access to her flow cytometer. We also thank CFAR flow cytometry facility for the flow cytometry services. This project was in part supported by CTSC core utilization funding and STERIS corporation/University Hospitals-Division of Infectious diseases grant to PP.

REMARQUE: Les expériences utilisant des souris ont été effectués conformément au comité de protection des animaux institutionnelle (IACUC) des lignes directrices. 1. La reconstitution de l&#39;Rag-1 - / - souris avec des cellules I n vitro de culture Th17 (Trois jours avant l&#39;infection) <ol><li> Pour l&#39;établissement des cellules Th17, culture CD4 + CD44low CD62Lhigh CD25 des lymphocytes T naïfs (3 x 104) en U à fond plaques à 96 puits seuls ou co-culture eux avec 3 x 104 cellules CD4 + CD25 + Foxp3 + Treg en présence d&#39;soluble α-CD3 (1 pg / ml), α-CD28 (2 pg / ml) d&#39;anticorps et de cellules présentatrices d&#39;antigène, dans des conditions Th17 (polarisées à l&#39;aide d&#39;IL-6 (25 ng / ml), TGF β (2 ng / ml) , α-IFN-γ (2 ug / ml) et α -IL-4 (2 ng / ml)) pendant trois à quatre jours. REMARQUE: les cellules T naïves et regs ont été triés à l&#39;aide cellulaire activé par fluorescence (FACS) und procédures d&#39;isolement cellulaire magnétique et cultivées comme décrit précédemment 19-22. </li><li> Le jour 4, après remise en suspension des cellules Th17 utilisant la pipette, les recueillir à partir de cultures, et les centrifuger dans des conditions stériles. <ol><li> Prenez une petite aliquote de ces cellules à examiner leur viabilité et pour le phénotypage. Remettre en suspension dans les 500 pi de milieu RPMI, ajouter l&#39;iodure de propidium (200 ng / ml) et d&#39;évaluer leur viabilité immédiatement par cytométrie en flux. Effectuer phénotypage en cytométrie de flux évaluation de la production d&#39;IL-17A après restimulation (voir rubrique 6.3). </li></ol></li><li> Centrifugeuse de lavage et l&#39;essentiel des cellules dans du PBS stérile à 480 g pendant 6 min à 4 ° C dans toutes les étapes sauf indication contraire. </li><li> Utilisez ces cellules pour le transfert adoptif dans la vieille 6-8 semaines CD45.2 Rag1 - / - souris immunodéficientes. <ol><li> Remettre en suspension les cellules à une densité cellulaire 1 x 10 7 cellules / ml en utilisant froide PBS stérile. </li><li> Injecter 100 ul de cellules par intraperitoneal injection, en utilisant 25 g d&#39;aiguilles de seringues de 1 ml de tuberculine, de telle sorte que une souris reçoit 1 x 10 6 cellules. Certaines souris recevront PBS, les cellules Th17 ou uniquement, et d&#39;autres souris recevront Th17 cellules qui étaient co-cultivées avec des cellules Treg. REMARQUE: Effectuez toutes les étapes de manière aseptique. </li></ol></li></ol> 2. Croissance C. albicans l&#39;infection (un jour avant l&#39;infection) <ol><li> Avant l&#39;inoculation, disperser cinq colonies de la CAF2-1 C. albicans souche de laboratoire dans 100 pi de suspension PBS stérile, et ajouter la suspension au bouillon stérile. </li><li> Inoculer cinq colonies de la C. albicans dans 50 ml de la base azotée de levure (YNB sans acides aminés) / peptone / bouillon dextrose et incuber dans un incubateur agitateur à 30 ° C pendant 15 à 18 heures à 130 rpm. </li><li> Surveiller le bouillon de trouble, car ce est une indication de la croissance du champignon. </li></ol> 3. CandidaRécolte et de la procédure de comptage (Le Jour des maladies infectieuses) <ol><li> Recueillir 10 ml de bouillon Candida dans 15 ml tubes. Pour des volumes plus importants, de recueillir Candida dans 50 ml tubes. </li><li> Centrifuger les blastospores à 1900 xg pendant 5 min à température ambiante dans toutes les étapes sauf indication contraire. Pellet les blastospores par centrifugation, suivie par l&#39;élimination du surnageant. </li><li> Se il ya plus d&#39;un tube, mutualiser les blastospores de Candida à partir de tubes multiples, ajoutant PBS stérile pour les boulettes et les remettre en suspension dans 10 ml de PBS pour le comptage. </li><li> Prenez 20 pi de blastospores dans 1,5 ml microtubes, ajouter 20 pi de la paraformaldéhyde 2X et incuber à température ambiante pendant 15 à 20 min. Comptez les blastospores fixes utilisant l&#39;hémocytomètre sous le microscope. REMARQUE: Paraformaldéhyde est cancérogène. Ouvrez la solution non diluée seulement dans la hotte. </li><li> En attendant, répéter le lavage des blastospores au moins deux fois par centrifugation tourlet dans du PBS, et la granulation blastospores. Gardez les pastilles dans 15 ml tubes à température ambiante, dans la hotte ABSL1, prêt pour l&#39;infection. </li><li> Laissez un peu de PBS stérile à température ambiante pendant remise en suspension des blastospores de l&#39;infection. </li><li> Après comptage, ajouter du PBS stérile à la pastille de blastospores à ajuster les nombres de cellules de levure à deux blastospores de levure x10 8 cellules / ml. Ce est la suspension de blastospores qui sera utilisé pour infecter les souris. REMARQUE: Effectuez toutes les étapes de manière aseptique. </li></ol> 4. Souris Infection (3-5 jours après transfert de cellules) NOTE: La procédure de l&#39;infection de base est effectuée comme décrit précédemment 19,23-25. <ol><li> Peser le Rag-1 - / - souris qui ont reçu PBS ou les cellules trois jours plus tôt. </li><li> Calculer la dose à l&#39;aide d&#39;agents anesthésiques leur poids corporel. Anesthésier les souris par administration de kétamine / xylazine mélange (16,1 mg / ml et 1,6 mg / ml), en utilisant 25 g d&#39;aiguilles sur les seringues de tuberculine de 1 ml, par intraperitoneal injection. <ol><li> Administrer 50 pl par 10 g de poids corporel. (Ce est-0,8 mg de kétamine et 0,08 mg de xylazine / 10 g de poids corporel ou 80 mg de kétamine et de xylazine 8 mg par kg de poids corporel respectivement). Observer la réponse orteil pincée toutes les 15 min après l&#39;anesthésie. NOTE: Ce dosage va induire 60-90 min de l&#39;anesthésie, ce qui est suffisant pour la procédure d&#39;infection. </li><li> Appliquer le lubrifiant pommade ophtalmique dans les yeux des souris pour éviter les cornées de se dessécher. Comme le lubrifiant oculaire peut se dessécher, répétez la lubrification ophtalmique toutes les 45 min. </li></ol></li><li> Injecter 1 ml de solution saline (NaCl 0,9%) sous-cutanée sur le dos à côté de la patte avant, pour aider à la réhydratation de la souris pendant l&#39;anesthésie. </li><li> Obtenir un nouveau, cage propre. Suivre la procédure infection une souris à la fois, en plaçant chaque souris dans la nouvelle cage une fois infecté. Effectuez la / infection simulacre PBS abord, et ensuite procéder aux gro d&#39;infection à Candidaups. </li><li> Ramassez la souris anesthésiée et ouvrez la bouche pour révéler la base de la langue. <ol><li> Placer une balle de coton diamètre de 3 mm saturé avec 50 pl de PBS ou blastospore suspension, sublinguale dans la cavité buccale pendant 90 min. Retournez la souris tous les fronts 15 min et à l&#39;arrière pour éviter une congestion pulmonaire, veiller à ce que les boules de coton ne se déplacent pas. </li></ol></li><li> Mettre en place une minuterie pour chaque souris 90 min pour se assurer de Sham ou Candida inoculation dans la cavité buccale. </li><li> Gardez-les dans une cage sous la lampe de chaleur (4 mètres), et chaque souris sur coussinets de gel de chaleur. </li><li> Assurez-vous que la langue est retirée à l&#39;intérieur et à l&#39;écart des dents, pour éviter dents lacérants la langue. </li><li> A la fin de 90 min, retirer la boule de coton à partir de l&#39;embouchure de la souris. Surveillez toute souris qui peut remettre de l&#39;anesthésie plus tôt que 75 minutes. Dans un tel cas, anesthésier à nouveau avec de la kétamine (40 mg / kg) seul. </li></ol> 5. Poster PROCEDURe surveillance (pendant les 90 min anesthésie) <ol><li> Utilisez coussinets de gel de chaleur au cours de la 90 min anesthésie. <ol><li> Pour maintenir la température du corps et pour prévenir la suffocation, ne permettent pas de récupérer souris sur la literie de la souris épi de maïs régulier. </li></ol></li><li> Après la récupération de l&#39;anesthésie, administrer un 1 ml supplémentaires de NaCl 0,9% stérile voie sous-cutanée à deux endroits sur le dos. </li><li> Gardez jusqu&#39;à cinq PBS (sham) de souris inoculées par cage. Maison seulement 1-2 souris infectées par cage. </li><li> Remplissez la carte de procédure avec les initiales tous les jours après la procédure de noter les changements dans le poids du corps, les habitudes et la santé globale de toilettage. </li></ol> 6. Évaluation de l&#39;inflammation 6.1) La perte de poids <ol><li> Peser la souris tous les jours pendant l&#39;infection, à partir du jour avant l&#39;intervention de l&#39;infection. NOTE: En règle générale, les souris immunodéficientes injectées avec des cellules Th17 et sans regs T succombent à 20-30% De perte de poids due à l&#39;accroissement de la charge fongique 19 et exacerbé l&#39;inflammation. </li></ol> 6.2) histologie notation de la langue <ol><li> Sacrifier les souris par asphyxie au CO2, suivie par dislocation cervicale. </li><li> Ouvrir les mâchoires et disséquer la langue avec des ciseaux et des pinces. Utilisez le forceps émoussé pour tenir la langue, et l&#39;aide des ciseaux tendre la main à l&#39;arrière de la bouche à inciser la fin arrière de la langue. </li><li> Pour hématoxyline immunocytochimique et de l&#39;éosine (H &amp; E) coloration des tissus de la langue, rincer les tissus de la langue avec PBS glacé. Ajouter 5 ml de formol à 10% pendant 2-3 langues et les fixer O / N en tubes de 15 ml. <ol><li> Le lendemain, éliminer le formol et plongez les tissus dans 5 ml d&#39;éthanol à 70% pour éviter l&#39;hyper-fixation. Envoyez-les en service commercial de poursuivre inclusion dans la paraffine, la coupe et la coloration des coupes en paraffine. NOTE: le service d&#39;histologie commerciale est utilisée pour effectuer ces étapes. </li&gt; </ol></li><li> Une fois les diapositives sont de retour à partir du service d&#39;histologie commerciale, la qualité de l&#39;inflammation en observant les sections de tissu sous un microscope optique. <ol><li> Score de 0 à 5, 0 étant pas d&#39;inflammation, inflammation et 5 étant le plus sévère. Note l&#39;inflammation en utilisant le tableau 1. </li></ol></li></ol> 6.3) La production de cytokine par les cellules Th17 REMARQUE: Une production excessive de TNF-α est l&#39;une des lectures pour immunopathologie excessive. Lorsque les souris sont transférées de manière adoptive avec des cellules Th17 seulement, il provoque l&#39;immunopathologie qui est associée à une production excessive de TNF-α dans les cellules Th17. <ol><li> Recueillir une suspension cellulaire unique à partir de la rate, les ganglions cervicaux, axillaires ganglions lymphatiques, et de la langue, en utilisant des méthodes décrites précédemment 19,26. </li><li> Restimuler les cellules avec du phorbol myristate acétate (PMA) (50 ng / ml) et de l&#39;ionomycine (500 ng / ml) pendant 4 heures avec Brefeldine A (10 ug / ml) a été ajouté dans la last 2 h. Laver les cellules avec du PBS et fixer à l&#39;aide d&#39;un kit de fixation / de perméabilisation commerciale selon les instructions du fabricant. </li><li> Effectuer intra coloration de cytokine cellulaire en utilisant l&#39;anticorps anti-TNF-α conjugués à un fluorochrome, anti-IL-17A et d&#39;anticorps ROR-yt 19 comme décrit précédemment. </li><li> En bref, remettre en suspension les cellules dans le tampon de perméabilisation 1X avec le cocktail d&#39;anticorps anti-TNF-α, l&#39;anti-IL-17A et ROR-yt anticorps, chaque anticorps à 2-3 ug / ml de concentration finale. </li><li> Incuber les cellules pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Après l&#39;incubation, laver les cellules avec le tampon de perméabilisation 1X. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pi de PBS avec 0,5% de sérum albumine bovine pour l&#39;analyse de cytométrie en flux. </li></ol>

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	<li>Allam, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-23-producing+CD68(+)+macrophage-like+cells+predominate+within+an+IL-17-polarized+infiltrate+in+chronic+periodontitis+lesions.">IL-23-producing CD68(+) macrophage-like cells predominate within an IL-17-polarized infiltrate in chronic periodontitis lesions.</a> Journal of Clinical Periodontology. 38 (10), 879-886 (2011).</li><li>Loesche, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodontal+disease:+link+to+cardiovascular+disease.">Periodontal disease: link to cardiovascular disease.</a> Compendium Of Continuing Education In Dentistry. 21 (6), 463-466 (2000).</li><li>Sfyroeras, G. S., Roussas, N., Saleptsis, V. G., Argyriou, C., Giannoukas, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+periodontal+disease+and+stroke.">Association between periodontal disease and stroke.</a> Journal Of Vascular Surgery. 55 (4), 1178-1184 (2012).</li><li>Huppler, A. R., Bishu, S., Gaffen, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucocutaneous+candidiasis:+the+IL-17+pathway+and+implications+for+targeted+immunotherapy.">Mucocutaneous candidiasis: the IL-17 pathway and implications for targeted immunotherapy.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 14 (4), 217 (2012).</li><li>Sitheeque, M. A., Samaranayake, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+hyperplastic+candidosis/candidiasis+(candidal+leukoplakia).+Critical+Reviews+In.">Chronic hyperplastic candidosis/candidiasis (candidal leukoplakia). Critical Reviews In.</a> Oral Biology And Medicine : An Official Publication Of The American Association Of Oral Biologists. 14 (4), 253-267 (2003).</li><li>Canabarro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+subgingival+colonization+of+Candida+albicans+and+other+yeasts+with+severity+of+chronic+periodontitis.">Association of subgingival colonization of Candida albicans and other yeasts with severity of chronic periodontitis.</a> Journal Of Periodontal Research. 48 (4), 428-432 (2013).</li><li>Urzua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+diversity+in+the+oral+microbiota+of+subjects+with+periodontitis:+Candida+albicans+and+Candida+dubliniensis+colonize+the+periodontal+pockets.">Yeast diversity in the oral microbiota of subjects with periodontitis: Candida albicans and Candida dubliniensis colonize the periodontal pockets.</a> Medical Mycology. 46 (8), 783-793 (2008).</li><li>Ergun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+status+and+Candida+colonization+in+patients+with+Sjogren's+Syndrome.">Oral status and Candida colonization in patients with Sjogren's Syndrome.</a> Medicina Oral, Patologia Oral Y Cirugia Bucal. 15 (2), e310-e315 (2010).</li><li>Hernandez, Y. L., Daniels, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+candidiasis+in+Sjogren's+syndrome:+prevalence,+clinical+correlations,+and+treatment.">Oral candidiasis in Sjogren's syndrome: prevalence, clinical correlations, and treatment.</a> Oral Surgery, Oral Medicine, And Oral Pathology. 68 (3), 324-329 (1989).</li><li>Gall, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+spp.+in+oral+cancer+and+oral+precancerous+lesions.">Candida spp. in oral cancer and oral precancerous lesions.</a> The New Microbiologica. 36 (3), 283-288 (2013).</li><li>Grady, J. F., Reade, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+as+a+promoter+of+oral+mucosal+neoplasia.">Candida albicans as a promoter of oral mucosal neoplasia.</a> Carcinogenesis. 13 (5), 783-786 (1992).</li><li>Dwivedi, P. P., Mallya, S., Dongari-Bagtzoglou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+immunocompetent+murine+model+for+Candida+albicans-promoted+oral+epithelial+dysplasia.">A novel immunocompetent murine model for Candida albicans-promoted oral epithelial dysplasia.</a> Medical Mycology. 47 (2), 157-167 (2009).</li><li>Cheng, S. C., Joosten, L. A., Kullberg, B. J., Netea, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+Candida+albicans+and+the+mammalian+innate+host+defense.">Interplay between Candida albicans and the mammalian innate host defense.</a> Infection and Immunity. 80 (4), 1304-1313 (2012).</li><li>Marodi, L., Johnston, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+Candida+species+disease+in+infants+and+children:+occurrence,+risk+factors,+management,+and+innate+host+defense+mechanisms.">Invasive Candida species disease in infants and children: occurrence, risk factors, management, and innate host defense mechanisms.</a> Current Opinion In Pediatrics. 19 (6), 693-697 (2007).</li><li>Kumamoto, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+gastrointestinal+Candida+colonization.+Current+Opinion+In.">Inflammation and gastrointestinal Candida colonization. Current Opinion In.</a> Microbiology. 14 (4), 386-391 (2011).</li><li>Kraneveld, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relation+between+oral+Candida+load+and+bacterial+microbiome+profiles+in+Dutch+older+adults.">The relation between oral Candida load and bacterial microbiome profiles in Dutch older adults.</a> PloS One. 7 (8), e42770 (2012).</li><li>Hernandez-Santos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th17+cells+confer+long-term+adaptive+immunity+to+oral+mucosal+Candida+albicans+infections.">Th17 cells confer long-term adaptive immunity to oral mucosal Candida albicans infections.</a> Mucosal Immunology. 6 (5), 900-910 (2013).</li><li>Hasina, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABT-510+is+an+effective+chemopreventive+agent+in+the+mouse+4-nitroquinoline+1-oxide+model+of+oral+carcinogenesis.">ABT-510 is an effective chemopreventive agent in the mouse 4-nitroquinoline 1-oxide model of oral carcinogenesis.</a> Cancer Prevention Research. 2 (4), 385-393 (2009).</li><li>Pandiyan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)CD25(+)Foxp3(+)+regulatory+T+cells+promote+Th17+cells+in+vitro+and+enhance+host+resistance+in+mouse+Candida+albicans+Th17+cell+infection+model.">CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells promote Th17 cells in vitro and enhance host resistance in mouse Candida albicans Th17 cell infection model.</a> Immunity. 34 (3), 422-434 (2011).</li><li>Pandiyan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+IL-15+in+activating+STAT5+and+fine-tuning+IL-17A+production+in+CD4+T+lymphocytes.">The role of IL-15 in activating STAT5 and fine-tuning IL-17A production in CD4 T lymphocytes.</a> J Immunol. 189 (9), 4237-4246 (2012).</li><li>Pandiyan, P., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+CD4+CD25+Foxp3++regulatory+T+cell+survival.">The control of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell survival.</a> Biology Direct. 3 (6), (2008).</li><li>Pandiyan, P., Zheng, L., Ishihara, S., Reed, J., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)CD25(+)Foxp3(+)+regulatory+T+cells+induce+cytokine+deprivation-mediated+apoptosis+of+effector+CD4(+)+T+cells.">CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells induce cytokine deprivation-mediated apoptosis of effector CD4(+) T cells.</a> Nat Immunol. 8 (12), 1353-1362 (2007).</li><li>Conti, H. R., Huppler, A. R., Whibley, N., Gaffen, S. L., Coligan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+candidiasis.">Animal models for candidiasis.</a> Current Protocols In Immunology. 105, 11-19 (2014).</li><li>Conti, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th17+cells+and+IL-17+receptor+signaling+are+essential+for+mucosal+host+defense+against+oral+candidiasis.">Th17 cells and IL-17 receptor signaling are essential for mucosal host defense against oral candidiasis.</a> J Exp Med. 206 (2), 299-311 (2009).</li><li>Kamai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+model+of+oropharyngeal+candidiasis+in+mice.">New model of oropharyngeal candidiasis in mice.</a> Antimicrobial Agents And Chemotherapy. 45 (11), 3195-3197 (2001).</li><li>Pandiyan, P., Bhaskaran, N., Zhang, Y., Weinberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+T+cells+from+mouse+oral+tissues.">Isolation of T cells from mouse oral tissues.</a> Biological Procedures Online. 16 (1), 4 (2014).</li><li>Gladiator, A., Wangler, N., Trautwein-Weidner, K., LeibundGut-Landmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+IL-17-secreting+innate+lymphoid+cells+are+essential+for+host+defense+against+fungal+infection.">Cutting edge: IL-17-secreting innate lymphoid cells are essential for host defense against fungal infection.</a> J Immunol. 190 (2), 521-525 (2013).</li><li>Leppkes, M., Roulis, M., Neurath, M. F., Kollias, G., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleiotropic+functions+of+TNF-alpha+in+the+regulation+of+the+intestinal+epithelial+response+to+inflammation.">Pleiotropic functions of TNF-alpha in the regulation of the intestinal epithelial response to inflammation.</a> International Immunology. 26 (9), 509-515 (2014).</li><li>Bishu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adaptor+CARD9+is+required+for+adaptive+but+not+innate+immunity+to+oral+mucosal+Candida+albicans+infections.">The adaptor CARD9 is required for adaptive but not innate immunity to oral mucosal Candida albicans infections.</a> Infection and Immunity. 82 (3), 1173-1180 (2014).</li><li>Quintin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+role+of+NK+cells+against+Candida+albicans+infection+in+immunocompetent+or+immunocompromised+mice.">Differential role of NK cells against Candida albicans infection in immunocompetent or immunocompromised mice.</a> Eur J Immunol. 44 (8), 2405-2414 (2014).</li><li>Ramirez-Garcia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+and+cancer:+Can+this+yeast+induce+cancer+development+or+progression.">Candida albicans and cancer: Can this yeast induce cancer development or progression.</a> Critical Reviews In Microbiology. , 1-13 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Ce modèle est basé sur l&#39;induction par voie orale C. albicans infection inflammation Th17 dépendante. En raison de l&#39;absence de T regs, l&#39;inflammation cellulaire Th17 induite est effrénée et conduit à l&#39;immunopathologie mal résolu. In vitro dérivés des cellules CD4 naïfs polarisés que les cellules Th17 ont été utilisés pour le transfert adoptif. 40-50% de la culture CD4 + cellules montrent détectable expression de l&#39;IL-17A autour de 3 jours (cellules Th17),...

Oral infections and inflammation have been related to cancer and cardiovascular diseases, and have dramatic impact on overall human health2,3. Opportunistic infections and inflammation caused by C. albicans are associated with primary immunodeficiencies (PID)4,5, inflammatory disorders such as periodontitis 6,7, Sjogren&#8217;s syndrome, and salivary gland disease8,9, as well as oral squamous cell carcinoma 10-12. C. albicans is a dimorphic commensal fungus that colonizes the mouths of 60% of healthy humans asymptomatically, yet it is the most common fungal pathogen causing infections when the host defense is weakened13-15. It causes recurring and chronic infections and inflammation in patients with AIDS and PID, and also in other immunocompromised individuals. As a commensal, its colonization load is associated with the change in the diversity of the overall oral microbiome16. As a pathogen it causes several forms of oropharyngeal candidiasis such as acute pseudomembranous, acute atrophic, chronic atrophic, chronic hypertrophic/hyperplastic, and angular cheilitis. 
Protection against C. albicans is determined not only by host immune resistance, but also by the ability to appropriately control Candida-induced immunopathology. Although commensals such as C. albicans contribute to modulation and exacerbation of other oral inflammatory conditions, the mechanisms by which dysbiosis occur during opportunistic infections are unclear. Besides the known role of adaptive Th17 cells in memory response to C. albicans17, their role in initiation and perpetuation of inflammation pathology during chronic infections remain unclear. Furthermore, oral inflammatory diseases such as Sjogren&#8217;s syndrome and periodontitis are associated with Th17 mediated pathology. Interestingly, these diseases are also strongly associated with frequent OPC. However, the interactions among Th17 cells, oral immunopathology of OPC and other oral inflammatory diseases are unstudied. 
Although mouse models of primary and secondary infection of oral candidiasis are available, a mouse model to study Candida infection associated Th17 inflammation, especially in the context of immunodeficiency is unavailable. This study presents a method for establishing oral Th17 inflammation associated with oral Candida infection in mice. Candida infection in mice is characterized by fungal lesions, inflammation in the tongue, decreased food intake, weight loss and eventually a moribund state. Oral pathology resembles chronic candidal infection lesions, as well as epithelial dysplasia in mouse oral cancer models12,18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1289">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:380px;">CAF-2</td>
			<td style="width:411px;">University of Pittsburgh (Sarah Gaffen)</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:380px;">Candida culture</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">U-bottom 96 well plates&#160;</td>
			<td style="width:411px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">055588</td>
			<td>Used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">a-CD3&#160;</td>
			<td style="width:411px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:119px;">16-0031-85</td>
			<td>Polarization of cells to Th17 conditions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">a-CD28&#160;</td>
			<td style="width:411px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:119px;">16-0281-85</td>
			<td>Polarization of cells to Th17 conditions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">m-IL-6</td>
			<td style="width:411px;">Bio Basic</td>
			<td style="width:119px;">RC232</td>
			<td>Polarization of cells to Th17 conditions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">h-TGF-b&#160;</td>
			<td style="width:411px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:119px;">240-B</td>
			<td>Polarization of cells to Th17 conditions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">a-IFN-g&#160;</td>
			<td style="width:411px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:119px;">16-7311-85</td>
			<td>Polarization of cells to Th17 conditions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">a-IL-4&#160;</td>
			<td style="width:411px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:119px;">16-7041-85</td>
			<td>Polarization of cells to Th17 conditions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">&#945;-IL17A ef660</td>
			<td style="width:411px;">eBiosciences</td>
			<td>50-7177-82</td>
			<td>Used for cell culture - 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">&#945;-TNFa-PE-Cy7</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>25-7423-41</td>
			<td>Used for cell culture - 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">&#945;-RORgt PE&#160;</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>12-6981-82</td>
			<td>Used for cell culture - 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">YNB w/o amino acids)/Peptone/Dextrose broth medium&#160;</td>
			<td style="width:411px;">Bio Basic</td>
			<td style="width:119px;">S507.SIZE</td>
			<td>Mediium for candida growth</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Shaker incubator&#160;</td>
			<td style="width:411px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Innova 4300</td>
			<td>Incubation growth for candida</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">15 ml tubes</td>
			<td style="width:411px;">Bio Basic</td>
			<td style="width:119px;">BT888-SY</td>
			<td>Used for cell culture and candida growth</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">50 ml tubes</td>
			<td style="width:411px;">Bio Basic</td>
			<td style="width:119px;">CT 788-YS</td>
			<td>Used for cell culture and candida growth</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Table top Centrifuge</td>
			<td style="width:411px;">VWR International LLC</td>
			<td style="width:119px;">82017-654</td>
			<td>For pelleting candida -900 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Allegra Centrifuge</td>
			<td style="width:411px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">392302</td>
			<td>Cell culture - 480 g</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">1.5 ml eppendorf tubes</td>
			<td style="width:411px;">Bio Basic</td>
			<td style="width:119px;">BT620-NS</td>
			<td>Preparing final concentration of candida</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">2x paraformaldehyde</td>
			<td style="width:411px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15710</td>
			<td>Fixing candida for count</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:411px;">VWR International LLC</td>
			<td style="width:119px;">15170-172</td>
			<td>Counting cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS - Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:411px;">Bio Basic</td>
			<td style="width:119px;">PD8117</td>
			<td>Preparation of buffers</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Ketamine/xylazine&#160;</td>
			<td style="width:411px;">Case Western Reserve University - Animal Resource Center</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>Obtained from ARC approved protocol for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ophthalmic lubricant ointment&#160;</td>
			<td style="width:411px;">Allergan</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>Eye ointment for animals to prevent dryness</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Saline (0.9% NaCl)</td>
			<td style="width:411px;">G Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">786-561</td>
			<td>Administerd to animals to prevent dehydration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3-mm-diameter cotton wool ball&#160;</td>
			<td style="width:411px;">VWR International LLC</td>
			<td style="width:119px;">BP7603</td>
			<td>3 mm balls for candida infection</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Heat gel pads</td>
			<td style="width:411px;">Case Western Reserve University - Animal Resource Center</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>for maintaining the body temperaturre and fast recovery</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hematoxylin and Eosin staining</td>
			<td style="width:411px;">Histoserv - MD</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>Tissue histology</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">10% formalin&#160;</td>
			<td style="width:411px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">JC1111/MC</td>
			<td>Tissue histology</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">70% ethanol&#160;</td>
			<td style="width:411px;">VWR International LLC</td>
			<td style="width:119px;">97064-490</td>
			<td>Sterilization purpose</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMA - Phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td style="width:411px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P1585-1MG</td>
			<td>Restimulation of cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ionomycin</td>
			<td style="width:411px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">124222 1mg</td>
			<td>Restimulation of cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fixation permeabilization kit</td>
			<td style="width:411px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:119px;">E16913-106</td>
			<td>Fixing cells for Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">Tuberculin syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td align="right">309659</td>
			<td>Mice injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25 G x 3/8 needles</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td align="right">309626</td>
			<td>Mice injection</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">Rag1 -/- mice</td>
			<td style="width:411px;">Jackson laboratories</td>
			<td style="width:119px;">Stock no: 002216</td>
			<td>Recipient mice</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD45.1 congenic mice</td>
			<td style="width:411px;">Jackson laboratories</td>
			<td style="width:119px;">Stock no:002014&#160;</td>
			<td>Donor Th17 cells</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:380px;">CB17-SCID mice</td>
			<td style="width:411px;">Jackson laboratories</td>
			<td style="width:119px;">Stock no: 001303</td>
			<td>Recipient mice</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:380px;">Balb/c mice</td>
			<td style="width:411px;">Jackson laboratories</td>
			<td style="width:119px;">Stock no: 000651</td>
			<td>Donor Th17 cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

th17 inflammation model of oropharyngeal candidiasis in immunodeficient mice

Oropharyngeal Candidiasis (OPC) disease is caused not only due to the lack of host immune resistance, but also the absence of appropriate regulation of infection-induced immunopathology. Although Th17 cells are implicated in antifungal defense, their role in immunopathology is unclear. This study presents a method for establishing oral Th17 immunopathology associated with oral candidal infection in immunodeficient mice. The method is based on reconstituting lymphopenic mice with in vitro cultured Th17 cells, followed by oral infection with Candida albicans (C. albicans). Results show that unrestrained Th17 cells result in inflammation and pathology, and is associated with several measurable read-outs including weight loss, pro-inflammatory cytokine production, tongue histopathology and mortality, showing that this model may be valuable in studying OPC immunopathology. Adoptive transfer of regulatory cells (Tregs) controls and reduces the inflammatory response, showing that this model can be used to test new strategies to counteract oral inflammation. This model may also be applicable in studying oral Th17 immunopathology in general in the context of other oral diseases.

Dans ce modèle, les deux souris infectées par Candida et les souris non infectées dans Rag-1 - / - fond immunodéficientes ont été adoptive transféré avec des cellules Th17 3-5 jours avant l&#39;infection. Un total de 10 à 12 souris ont été utilisés pour les expériences, avec deux souris dans chaque groupe Sham infecté et 4-5 dans chacun des groupes infectés Candida. Cellules naïves ont été obtenues à partir de souris congéniques CD45.1 ou Thy1.1, de sorte que les cellules...

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Th17 Inflammation Model of Oropharyngeal Candidiasis in Immunodeficient Mice

Although Candida infection models are available to study host immune resistance, a model to study T cell mediated immunopathology in the context of Candida infection is absent. Here we describe a method to establish Th17 immunopathology associated with oral Candida infection in immunodeficient mice.

Th17 Inflammation modèle de la candidose oropharyngée chez des souris immunodéficientes

Oropharyngeal Candidiasis (OPC) disease is caused not only due to the lack of host immune resistance, but also the absence of appropriate regulation of ...

th17-inflammation-model-oropharyngeal-candidiasis-immunodeficient

Research

JoVE Journal

Medicine

9.9K vues.  Case Western Reserve University. Although Candida infection models are available to study host immune resistance, a model to study T cell mediated immunopathology in the context of Candida infection is absent. Here we describe a method to establish Th17 immunopathology associated with oral Candida infection in immunodeficient mice. 