We appreciate Dr. Jeong-Soo Lee for sharing the Tg(dbh:EGFP-MYCN) transgenic fish with us in our study. This work was supported by a grant 1K99CA178189-01 from the National Cancer Institute, a fellowship from the Pablove Foundation and the Friends for Life, and young investigator awards from the Alex's Lemonade Stand Foundation and the CureSearch for Children's Cancer Foundation.

NOTE: Toutes les études de poisson zèbre et l&#39;entretien des animaux ont été effectuées en accord avec la Mayo Clinic Institut IACUC approuvé le protocole # A41213. 1. Constructions d&#39;ADN pour la transgenèse <ol><li> Amplifier un 5,2 kb dopamine beta hydroxylase (d βh) région promotrice 8 en utilisant le clone CH211-270H11 BAC (de BACPAC centre de ressources (BPRC)) comme une matrice d&#39;ADN. Utilisation d&#39;un système approprié de PCR pour l&#39;amplification par PCR de matrices d&#39;ADN longues de long et précis et les programmes de cycles suivants pour la PCR: 94 ° C pendant 2 min, 10 cycles de (94 ° C, 15 sec, 50 ° C, 30 sec, 68 ° C, 8 min), suivie de 30 cycles de (94 ° C, 15 sec, 53 ° C, 30 sec, 68 ° C, 8 min), 68 ° C, 4 min (amorce sens 5&#39;-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3 &#39; et amorce anti-sens 5&#39;-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3 &#39;). </li><li> Créez le d βh -pDONRP4-P1R entrée cloNE 8 en utilisant le système de clonage recombinant commercial comme passerelle multisite. Mélanger 1 pl de produit de DßH purifiée PCR (172 ng / pl), 1 pi (150 ng / ul) vecteur donneur pDONRP4-P1R (avec d&#39;autres vecteurs de passerelle sont des dons généreux du Dr Chi-Bin Chien, Univ. De l&#39;Utah) , 4 pi de tampon TE (pH 8,0) avec 2 pi de BP clonase mélange enzymatique, incuber pendant 1 heure à 25 ° C, puis se transforment en un TOP10 Shot E. compétente coli selon le protocole du fabricant. </li><li> Générez le d βh: transgénique EGFP-MYCN construire 8 en utilisant le système de clonage recombinant mentionné dans l&#39;étape 1.2. Mélanger 1 ul de chaque clone d&#39;entrée (150 ng / ul) comprenant un 5,2-kb promoteur de DßH (DßH -pDONR P4-P1R construction), EGFP manque un codon d&#39;arrêt (PME-EGFP construction), et MYCN humaine ADNc (un don généreux du Dr Hogarty à l&#39;Hôpital pour enfants de Pennsylvanie, MYCN-pDONRP2R-P3 construction), 1 pi (150 ng / pl) du vecteur de destination modifié contenant des sites de reconnaissance I-Scel (un don généreux de Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Allemagne), 4 pi de tampon TE ( pH 8,0) avec 2 ul de mélange enzymatique Clonase LR, incuber pendant 1 h à 25 ° C, puis à transformer chimiquement compétente E. coli comme un haut de tir 10 et suivre le protocole du fabricant. </li><li> Assurez-MITF: transgénique MITF construire huit en digérant le vecteur PNP-MITF avec Notl et Sali enzymes de restriction pendant 2 h à température ambiante, et en sous-clonant le libéré 2,65 kb (un don généreux de Dr. D. Raible, Univ of Washington.) Fragment d&#39;ADN qui contient le promoteur de MITF et la séquence codante du gène MITF poisson zèbre dans les sites Notl et Mlul d&#39;un vecteur pBluescript modifié contenant flanquant des sites de reconnaissance I-Scel (un don généreux du Dr. Hui Feng, Boston University), en utilisant la ligase d&#39;ADN T4 selon le protocole du fabricant. NOTE: Pour augmenter l&#39;efficacité de la génération de lignées MYCN dites-vous stables, d βh: EGFP-MYCN et MITF:. Constructions d&#39;ADN MITF sont co-injectés dans l&#39;une des cellules d&#39;embryons de nacre étape Nacre désigne un type de poisson mutant manquant d&#39;un crête neurale dérivés mélanophores 36 au cours du développement. Ainsi, l&#39;apparition de cellules de pigment dans les embryons injectés suggère l&#39;intégration de MITF: MITF construit ADN dans le génome. Il a été démontré que deux ou trois constructions d&#39;ADN peuvent être co-injectés co-intégrées dans le génome de poisson 31. Ainsi, la pigmentation causée par l&#39;expression MITF peut servir de marqueur pour l&#39;intégration de la DßH: transgène EGFP-MYCN et pour faciliter l&#39;identification des MYCN lignée transgénique stable. </li><li> Mélanger le d βh: EGFP-MYCN et MITF: ADN MITFdes constructions à un rapport de 3: 1 dans un volume total de réaction de 15 ul avec 1 ul d&#39;enzyme I-Scel et 0,75 ul de tampon. Assurez-vous que la quantité totale d&#39;ADN dans la réaction ne dépasse pas 750 ng. </li><li> Effectuer la digestion I-Scel à température ambiante pendant 4 h ou O / N. Le deuxième jour, l&#39;I-SceI- ADN digéré sont prêts pour la micro-injection ou peuvent être conservés à -20 ° C pour l&#39;injection dans le futur. Stocker l&#39;enzyme I-Scel à -80 ° C en petites aliquotes à maintenir son efficacité enzymatique. </li><li> Sous-cloner l&#39;ALKF1174L humaine et le gène ALK-type sauvage à partir du vecteur pcDNA3 (un don généreux de M. George au Dana-Farber Cancer Institute) 7 dans les sites EcoRI et Notl d&#39;un vecteur pENTRY1A (un don généreux de Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Allemagne) en utilisant l&#39;ADN ligase T4 selon le protocole du fabricant. </li><li> Générez le d βh: ALKF1174L &lt;/ Em&gt; ou DßH: constructions transgéniques ALKWT utilisant le système recombinant comme mentionné dans le protocole 1.2. Brièvement, combiner trois clones d&#39;entrée, DßH -pDONRP4-P1R, ALKF1174L- pENTRY1A (ou ALKWT -pENTRY1A) et P3e-polyA, dans le vecteur de destination modifié contenant des sites de reconnaissance I-Scel (un don généreux de Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Allemagne), en utilisant LR Clonase enzyme Mix, selon le protocole du fabricant. </li><li> Mélanger le d βh: ALKF1174L (ou DßH: ALKWT) et DßH: mCherry constructions d&#39;ADN à un ratio de 3: 1 et les linéarisent avec I-Scel enzyme comme décrit dans le protocole 01/05 au 01/06. </li></ol> 2. microinjection <ol><li> Utilisation micropipettes en verre d&#39;un diamètre de 1,0 mm pour toutes les injections 37. Casser la pointe des micropipettes de verre avec une lame de rasoir avant l&#39;injection. Calibrer le volume d&#39;injection par injectioning H 2 O dans une goutte d&#39;huile minérale. Mesurer le diamètre des gouttelettes obtenues et régler le micro-injecteur (pression ou la durée d&#39;impulsion de pression) afin d&#39;assurer que le volume d&#39;injection est inférieure à 10% du volume total de la pile de cellules d&#39;embryons une étape. </li><li> Ajouter un 0,5 pi supplémentaires de frais enzyme I-Scel (5 unités / ul) dans 5 pi de solution injectable contenant de l&#39;ADN construit juste avant l&#39;injection pour augmenter l&#39;efficacité de la transgénèse 38. Injecter 50 à 80 pg de constructions d&#39;ADN linéarisées dans le cytoplasme des embryons de stade unicellulaire. Pour assurer le succès de l&#39;injection, mélanger l&#39;échantillon avec 0,25% de phénol rouge pour la visualisation. Si les cellules deviennent rouges après l&#39;injection, il indique la micro-injection est réussie. Afin d&#39;assurer un taux de réussite élevé pour générer des poissons transgéniques, nous injectons généralement jusqu&#39;à 500 embryons. </li><li> Pour générer poissons transgéniques exprimant de manière stable MYCN, coinject linéarisé d βh: EGFP-MYCN et MITF: constructions d&#39;ADN MITF (à un ratio de 3: 1) dans des embryons de la pigmentation mutant nacre poisson zèbre au stade unicellulaire. L&#39;expression de Mitf sert en tant que journaliste pour l&#39;intégration des constructions transgéniques dans le génome du poisson. </li><li> Pour surexpression mosaïque de ALK dans le type sauvage ou MYCN embryons transgéniques, co-injecter le linéarisé d βh: ALK F1174L (ou DßH: ALKWT) avec DßH: mCherry constructions d&#39;ADN (à un ratio de 3: 1) dans l&#39;une des cellules embryons résultant de l&#39;élevage de la F1 hétérozygotes Tg (DßH: EGFP-MYCN) poisson transgénique de type sauvage AB poissons. Ainsi, la moitié des enfants sont transgéniques pour MCYN et la moitié sont de type sauvage. </li></ol> 3. écran pour le poisson transgénique stable ou en mosaïque <ol><li> Pour augmenter l&#39;efficacité de l&#39;identification des lignes de MYCN dites-vous stables, anesthésier embryons de nacre principalement injectés avec tricaïne (0,02%) at jours 3-5 de post-fécondation et l&#39;écran de la pigmentation. Transférer les embryons avec une pigmentation d&#39;une nouvelle boîte de Pétri avec de l&#39;eau d&#39;oeuf frais et de les élever à la maturité sexuelle pour un examen plus poussé pour le poisson fondateur, qui portent le d βh: transgène EGFP-MYCN dans les cellules germinales. </li><li> Pour identifier le fondateur avec transmission germinale de EGFP-MYCN, poissons F0 adulte pigmentée outcross de type sauvage AB poissons et de l&#39;écran pour les embryons de EGFP positif à 1-2 jours après la fécondation pour plus génotypage. Placez une seule F1 embryon de EGFP positif dans un tube PCR et éliminer tout le liquide. Ajouter 50 ul de tampon d&#39;extraction ADNg qui contient 12,5 pi de tampon de lyse 4x, 35 ul H 2 O et 2,5 pl de proteinase K (10 mg / ml) à seul embryon. Incuber le mélange réactionnel pendant 3/2 heure à 55 ° C, suivi par 10 min d&#39;incubation à 98ºC pour inactiver la proteinase K. Pour 50 ml de tampon de lyse 4x, ajouter 500 ul de Tris 1 M (pH 8,4), 2,5 ml de 1M KCl to 47 ml de H 2 O. NOTE: Après F0 MYCN stable poissons transgéniques sont élevés avec le type sauvage AB poissons, tous les descendants sont pigmentée. Ainsi, la pigmentation peut pas servir de marqueur pour l&#39;identification des poissons MYCN- positive. Alors que dans le poisson transgénique MYCN, la protéine de fusion EGFP-MYCN est exprimé dans la SNPS, y compris les neurones sympathiques du ganglion cervical supérieur et séquentielle segmentaire ganglion de la chaîne sympathique et les neurones dopaminergiques non-PSN, telles que le bulbe rachidien et 8 ganglions crâniens. Ainsi, l&#39;expression de EGFP peut servir de marqueur pour l&#39;identification des embryons transgéniques stables MYCN. </li><li> Utilisez 2 pi de gDNA extraites de l&#39;embryon F1 pigmentée comme matrice, les amorces MYCN -test F1: 5&#39;-CTG CTT GAG GAG AAC CTG TG-3 &#39;; MYCN -R3: 5&#39;-AGG CAT CGT TTG AGG ATC AG-3 », et l&#39;esprit de programme suivanth, le GC-RICH système de PCR: 1 cycle de 95 ° C pendant 3 min, 25 cycles de 95 ° C pendant 30 sec, 58 ° C pendant 30 sec, et 72 ° C pendant 3 min. Nous génotype généralement de 14 à 16 embryons pigmentées à partir d&#39;un seul accouplement pour confirmer la présence du transgène MYCN intégré dans les embryons pigmentées, plus de 6 fondateur poissons surexprimant MITF et MYCN ont été identifiés par cette méthode. </li><li> Levez le reste des embryons F1 EGFP-positif. Nageoire et le génotype eux à 2-3 mois de l&#39;âge en utilisant le protocole ci-dessus pour confirmer davantage l&#39;intégration des MYCN transgène dans le poisson. F1 Race MYCN poisson transgénique stable avec de type sauvage AB poissons. Co-injecter le d linéarisé βh: ALK F1174L (ou DßH: ALKWT) avec DßH: mCherry d&#39;ADN dans les cellules des embryons une comme décrit dans le protocole 2.4. </li><li> Trier le MYCN dites-vous embryons dans l&#39;expérience décrite dans le protocole 2.4 utilisant un fluor stéréoscopiqueescence microscope et dépister les embryons principalement injectés à jour 1-3 de post-fécondation pour l&#39;expression de EGFP-MYCN dans le SNPS. Puis, au cours de 2-5 jours de post-fécondation, les embryons avec anesthésier tricaïne (0,02%) et de trier les embryons MYCN- positifs ou négatifs de nouveau sur la base de l&#39;expression de mCherry dans les SNPS fluorescence en utilisant un microscope stéréoscopique. L&#39;expression de mCherry sert de marqueur pour la co-expression de ALK dans les tissus des animaux injectés primaire mosaïque. REMARQUE: ~ 600 progéniture résultant de l&#39;élevage de MYCN poisson transgénique stable avec de type sauvage poissons ont été injectés par groupe avec les constructions d&#39;ADN linéarisées, y compris d βh: ALK F1174L et DßH: mCherry, DßH: ALKWT et DßH: mCherry ou DßH : mCherry seul, respectivement. Mosaïque de mCherry expression peut être observée dans 70-90% des poissons principalement injecté. La moitié de ONE-tiers des poissons injecté survécu par le stade de larves pour montre de la tumeur. </li><li> Relevez tous les mCherry + MYCN + et + mCherry MYCN - embryons selon les protocoles standards du livre poisson zèbre 39 et de surveiller l&#39;apparition de la tumeur à partir de 5 semaines post-fécondation. </li></ol> 4. tumeur Watch à Mosaic poissons transgéniques <ol><li> Surveiller mCherry- positif poissons principalement injecté tous les deux semaines à partir de 5 semaines post-fécondation des preuves de l&#39;apparition de la tumeur. </li><li> Anesthésier poisson avec tricaïne (0,02%) et l&#39;écran de la présence de mCherry - et dites-vous EGFP tumeurs dans les SNPS sous le Nikon SMZ-1500 fluorescence stéréoscopique microscope équipé d&#39;un viseur d&#39;appareil photo numérique DS-U1. </li><li> Pour vérifier si les tumeurs expriment le transgène de ALK, isoler la mCherry- et des masses de EGFP positif pour ALK génotypage PCR. </li><li> En utilisant la PCR, l&#39;ADN génomique à amplifierextrait de tumeurs développées avec les amorces suivantes: ALK P7: 5&#39;-AGG CCA GGT GTC CGG AAT GC-3 &#39;et ALK P18: 5&#39;-TGT CTT CAG GCT GAT GTT GC-3&#39; et la réaction PCR suivant: 1 cycle de 94 ° C pendant 5 min, 30 cycles de (94 ° C pendant 30 sec, 55 ° C pendant 30 sec, et 72 ° C pendant 60 secondes). Ensuite, la séquence du produit PCR avec ALK P7 amorce pour confirmer encore l&#39;existence de mutant ou de type sauvage ALK dans les tumeurs mCherry-positifs. </li></ol>

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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+transgene+expression+in+living+zebrafish+embryos.">Tracing transgene expression in living zebrafish embryos.</a> Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).</li><li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-injection+strategies+to+modify+radiation+sensitivity+and+tumor+initiation+in+transgenic+Zebrafish.">Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish.</a> Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+mutations+of+ALK+kinase+in+neuroblastoma.">Oncogenic mutations of ALK kinase in neuroblastoma.</a> Nature. 455 (7215), 971-974 (2008).</li><li>Pugh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+landscape+of+high-risk+neuroblastoma.">The genetic landscape of high-risk neuroblastoma.</a> Nature genetics. , (2013).</li><li>Berry, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ALK(F1174L)+mutation+potentiates+the+oncogenic+activity+of+MYCN+in+neuroblastoma.">The ALK(F1174L) mutation potentiates the oncogenic activity of MYCN in neuroblastoma.</a> Cancer Cell. 22 (1), 117-130 (2012).</li><li>Heukamp, L. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish.">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transposition+of+the+Tol2+transposable+element+from+a+single-copy+donor+in+zebrafish.">Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (50), 19827-19832 (2008).</li><li>Caneparo, L., Pantazis, P., Dempsey, W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+bridges+in+vertebrate+gastrulation.">Intercellular bridges in vertebrate gastrulation.</a> PLoS One. 6 (5), e20230 (2011).</li><li>Ivics, Z., Izsvak, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+universe+of+transposon+technologies+for+gene+and+cell+engineering.">The expanding universe of transposon technologies for gene and cell engineering.</a> Mob DNA. 1 (1), 25 (2010).</li><li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cell+transplantation+using+adult+rag2+mutant+zebrafish.">Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish.</a> Nat Methods. 11 (8), 821-824 (2014).</li><li>Watson, I. R., Takahashi, K., Futreal, P. A., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+patterns+of+somatic+mutations+in+cancer.">Emerging patterns of somatic mutations in cancer.</a> Nat Rev Genet. 14 (10), 703-718 (2013).</li><li>Sander, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+disruption+in+somatic+zebrafish+cells+using+engineered+TALENs.">Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Dans cette étude représentative, nous avons utilisé co-injection transitoire et co-expression de ALK activé avec le gène rapporteur mCherry dans MYCN dites-vous les poissons transgéniques à montrer que ces gènes coopèrent pour accélérer nettement le début de neuroblastome, conformément à notre constatation précédente composé stable coexprimant de poissons transgéniques deux ALK et MYCN 8 activé. Cette approche transgénique mosaïque possède plu...

Les cancers sont des maladies évolutives marquées par l&#39;accumulation de mutations pathologiques, des suppressions et des gains de chromosomes au cours du temps. Ces anomalies génétiques peuvent influer sur des processus cellulaires multiples allant du cycle cellulaire, la mort cellulaire, le métabolisme énergétique et l&#39;assemblage du cytosquelette d&#39;insister sur les réponses telles que l&#39;hypoxie. Par conséquent, la tumorigenèse reflète les actions collectives de multiples aberrations génétiques à travers un éventail de processus biologiques. Des efforts récents d&#39;intégration génomiques de recherche, y compris l&#39;ensemble du séquençage du génome, le séquençage de l&#39;exome, le séquençage ciblé, le séquençage profond et études d&#39;association pangénomique, ont identifié un nombre croissant d&#39;altérations génétiques dans pratiquement tous les nouveaux types de tumeurs 1-4. Dans de nombreux cas, les lésions génétiques se produisent ensemble d&#39;une manière non aléatoire 8/5, ce qui suggère leur coopération dans la pathogenèse de la maladie. Disséquer les rôles oncogéniques de la vaste gamme de gènes exprimés de façon aberrante résultant felon ces lésions génomiques est nécessaire de concevoir de nouvelles stratégies thérapeutiques et de comprendre les réponses des cellules tumorales à ces agents, mais cela se est avéré être une tâche ardue, nécessitant des systèmes de modèles animaux très robustes pour la conduite de l&#39;analyse génomique fonctionnelle à haut débit dans vivo. Bien que les mammifères, notamment les rongeurs, des modèles favorisées en biologie du cancer, du poisson-zèbre est commencé à attirer une attention considérable. Le téléostéens poisson zèbre (Dario rerio) a été utilisé comme un organisme modèle pour l&#39;étude de développement depuis les années 1960 et a été appliquée à l&#39;étude de la pathogenèse de la tumeur première fois en 1982 9-11. Facilité de maintenance, de petite taille du corps, et une fécondité élevée rendre le poisson zèbre, un modèle robuste pour les grands écrans génétiques à terme pour identifier les mutations qui confèrent des phénotypes anormaux et pathologiques 10. La transparence optique des embryons de poisson zèbre est un autre élément clé de soutien plus large utilisation de ce modèle de cancer,il permet l&#39;imagerie in vivo être menées pour localiser le développement de la tumeur en temps réel 9, une application qui est relativement difficile chez les rongeurs 12. Génomique comparative récente analyse du génome de référence poisson zèbre (Zv9) a révélé 26 206 gènes codant pour des protéines, avec 71% ayant orthologues humains, dont 82% sont corrélés avec des gènes associés à la maladie de la ligne mendélienne héritage à Man base de données (OMIM) 13, 14. Par conséquent, le poisson-zèbre a été utilisé pour modéliser différents types de cancers humains, y compris le neuroblastome 8, des cellules T de la leucémie lymphoblastique aiguë (LAL-T) 15,16, 17,18 mélanome, le sarcome d&#39;Ewing 19, 20,21 rhabdomyosarcome, le carcinome du pancréas 22, carcinome hépatocellulaire et 23 tumeurs malignes 24,25 myéloïde, et a été choisi comme un modèle de cancer pour la xénotransplantation étudie 11,26. Un transgénique stableapproche chez le poisson zèbre est couramment utilisé pour étudier l&#39;effet de gain de fonction des gènes dans le développement normal ou maladie pathogenèse 27,28. Pour développer un tel modèle (figure 1A), on injecte un produit d&#39;assemblage d&#39;ADN contenant le gène d&#39;intérêt dirigé par un promoteur spécifique d&#39;un tissu dans une des cellules d&#39;embryons de type sauvage. Trois à quatre mois après l&#39;injection, lorsque les embryons injectés atteignent la maturité sexuelle, ils sont par croisement avec des poissons sauvages pour dépister ceux qui décrivent l&#39;intégration de la construction d&#39;ADN dans leur lignée germinale, qui les licences que les poissons fondateur. De nombreux facteurs, tels que le nombre de copies et le site d&#39;intégration du transgène, affectent l&#39;expression du transgène dans des lignées transgéniques stables. Ainsi, afin de développer un modèle de tumeur transgénique, plusieurs lignées transgéniques stables surexprimant un seul oncogène doivent être générés premier et projeté de la ligne exprimant le transgène à un niveau qui pourrait conduire à l&#39;induction de tumeurs. Cependant, si la surexpression d&#39;un candidat oncogene est toxique pour les cellules germinales, il est difficile de générer une lignée transgénique stable directement en surexprimant le transgène 29. Par conséquent, cette approche peut prendre beaucoup de temps, avec un risque élevé d&#39;échec pour générer un modèle de cancer approprié. Ici, nous montrons une stratégie de rechange sur la base de la transgenèse mosaïque transitoire (figure 1B) qui fournit des avantages uniques par rapport transgénèse classique stable pour l&#39;étude génomique fonctionnelle in vivo. Dans cette approche, un ou plusieurs constructions transgéniques sont injectés dans le stade d&#39;une cellule d&#39;transgéniques ou de type sauvage embryons. Les constructions d&#39;ADN injectés contenant des transgènes sont alors mosaically et aléatoirement intégrés dans le poisson injecté primaire, résultant en génotypes mixtes au sein des populations de cellules multiples dans chaque poisson 30. De plus, la co-injection d&#39;ADN dans des embryons multiples construit une des cellules conduit à la co-intégration dans la même cellule dans des sites aléatoires, ce qui permet à une traCE les cellules avec une expression de transgènes et d&#39;explorer les interactions des gènes différents au cours pathogenèse de la maladie chez les animaux mosaïque 31. Comme preuve de principe, nous transitoirement surexprimé ALK par mutation activée (F1174L) avec le gène rapporteur mCherry dans le système nerveux sympathique périphérique (SNPS) sous le contrôle du hydroxylase dopamine bêta (d βh) de promoteur en poissons sauvages et poissons transgéniques surexprimant MYCN. ALK, qui code pour un récepteur tyrosine kinase, est le gène le plus fréquemment muté dans le neuroblastome à haut risque 5-7,32,33. ALK (F1174L), comme l&#39;un des mutations activatrices somatiques les plus fréquentes et les plus puissants, est sur-représentée dans MYCN- amplifié patients de neuroblastome à haut risque et en synergie avec MYCN surexpression d&#39;accélérer neuroblastome tumorigenèse chez les souris transgéniques stables et des modèles de poisson zèbre transgénique 8,34,35. Par mosaïquela surexpression transitoire de ALK (F1174L) avec mCherry dans le poisson transgénique MYCN, on a récapitulé l&#39;accélération de l&#39;apparition de la tumeur observée dans le poisson transgénique stable surexprimant la fois ALK (F1174L) et MYCN, ce qui suggère que la stratégie de transgénèse mosaïque peut être utilisé pour rapidement et efficacement évaluer les contributions respectives de plusieurs oncogènes dans l&#39;initiation de la tumeur in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="663">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:171px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Expand Long Template PCR System&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Roche Applied Science, IN</td>
			<td style="width:119px;">11681834001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pCR-TOPO vector&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:119px;">451641</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:171px;">New England Biolabs, MA</td>
			<td style="width:119px;">M0202M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gateway LR Clonase II enzyme 
			Mix</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen, CA</td>
			<td>11791-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gateway&#174; BP Clonase&#174; II enzyme mix</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen, CA</td>
			<td>11789-020</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">GC-RICH PCR System&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Roche Applied Science, IN</td>
			<td>12 140 306 001</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Meganuclease I-SceI&#160;</td>
			<td style="width:171px;">New England Biolabs, MA</td>
			<td>R0694S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Nikon, NY</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon digital sight DS-U1 camera</td>
			<td style="width:171px;">Nikon, NY</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic &#8220;drivers&#8221; among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

Afin de déterminer si la surexpression de F1174L ALK par mutation activée ou de type sauvage ALK pourrait collaborer avec MYCN dans le neuroblastome induction, nous avons surexprimé soit ALK humaine activée ou de type sauvage ALK humaine sous le contrôle du promoteur d de βh dans le SNPS des poissons transgéniques surexprimant MYCN. Chacune des constructions suivantes, DßH - ALKF1174L ou DßH - ALKWT, ont été co-...

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Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis | Developmental Biology | Video

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Mosaïque poisson zèbre transgénèse pour l&#39;analyse génomique fonctionnelle des gènes candidats de coopération dans la tumeur pathogenèse

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

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11.0K vues.  Mayo Clinic College of Medicine, Center for Individualized Medicine. The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

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Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the cardiac transcriptome from being masked by the global embryonic transcriptome, it is necessary to collect sufficient numbers of hearts for further analyses. Furthermore, as zebrafish cardiac development proceeds rapidly, heart collection and RNA extraction methods need to be quick in order to ensure homogeneity of the samples. Here, we present a rapid manual dissection protocol for collecting functional/beating hearts from zebrafish embryos. This is an essential prerequisite for subsequent cardiac-specific RNA extraction to determine cardiac-specific gene expression levels by transcriptome analyses, such as quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The method is based on differential adhesive properties of the zebrafish embryonic heart compared with other tissues; this allows for the rapid physical separation of cardiac from extracardiac tissue by a combination of fluidic shear force disruption, stepwise filtration and manual collection of transgenic fluorescently labeled hearts.

To analyse cardiac gene expression profiles during zebrafish heart development, total RNA has to be extracted from isolated hearts. Here, we present a protocol for collecting functional/beating hearts by rapid manual dissection from zebrafish embryos to obtain cardiac-specific mRNA.

À grande échelle de poisson zèbre embryonnaire Coeur Dissection d&#39;analyse transcriptionnelle

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

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Biologie du développement

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analyse des Muscle intégrité poisson zèbre larves squelettique avec colorant bleu Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Technique à la cible microinjection du Developing<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and behavioral phenotypes. The remarkably diverse phenotypes that have evolved as marine populations adapt to countless freshwater environments, combined with the ability to cross marine and freshwater forms, provide a rare vertebrate system in which genetics can be used to map genomic regions controlling evolved traits. Excellent genomic resources are now available, facilitating molecular genetic dissection of evolved changes. While mapping experiments generate lists of interesting candidate genes, functional genetic manipulations are required to test the roles of these genes. Gene regulation can be studied with transgenic reporter plasmids and BACs integrated into the genome using the Tol2 transposase system. Functions of specific candidate genes and cis-regulatory elements can be assessed by inducing targeted mutations with TALEN and CRISPR/Cas9 genome editing reagents. All methods require introducing nucleic acids into fertilized one-cell stickleback embryos, a task made challenging by the thick chorion of stickleback embryos and the relatively small and thin blastomere. Here, a detailed protocol for microinjection of nucleic acids into stickleback embryos is described for transgenic and genome editing applications to study gene expression and function, as well as techniques to assess the success of transgenesis and recover stable lines.

Transgenic manipulations and genome editing are critical for functionally testing the roles of genes and cis-regulatory elements. Here a detailed microinjection protocol for the generation of genomic modifications (including Tol2-mediated fluorescent reporter transgene constructs, TALENs, and CRISPRs) is presented for the emergent model fish, the threespine stickleback.

Microinjection pour transgénèse et Génome Édition dans Épinoche à trois épinoches

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into the developing oocyte. Because these events rely on maternal products which typically act very soon after fertilization-that preexist inside the egg, standard approaches for expression and functional reduction involving the injection of reagents into the fertilized egg are typically ineffective. Instead, such manipulations must be performed during oogenesis, prior to or during the accumulation of maternal products. This article describes in detail a protocol for the in vitro maturation of immature zebrafish oocytes and their subsequent in vitro fertilization, yielding viable embryos that survive to adulthood. This method allows the functional manipulation of maternal products during oogenesis, such as the expression of products for phenotypic rescue and tagged construct visualization, as well as the reduction of gene function through reverse-genetics agents.

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

An optimized protocol for the in vitro maturation of zebrafish oocytes used for the manipulation of maternal gene products is presented here.

Manipulation fonctionnelle du gène maternel Produits utilisant<em&gt; In vitro</em&gt; Ovocyte Maturation en Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy. The sub-diffraction limit resolution capabilities of super-resolution light microscopes allow improving the accuracy of the correlated data. Briefly, 110 nanometer thick cryo-sections are transferred to a silicon wafer and, after immunofluorescence staining, are imaged by super-resolution light microscopy. Subsequently, the sections are preserved in methylcellulose and platinum shadowed prior to imaging in a scanning electron microscope (SEM). The images from these two microscopy modalities are easily merged using tissue landmarks with open source software. Here we describe the adapted method for the larval zebrafish retina. However, this method is also applicable to other types of tissues and organisms. We demonstrate that the complementary information obtained by this correlation is able to resolve the expression of mitochondrial proteins in relation with the membranes and cristae of mitochondria as well as to other compartments of the cell.

This protocol describes the necessary steps to obtain subcellular protein localization results on zebrafish retina by correlating super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy images.

Super-résolution corrélative et microscopie électronique pour résoudre la localisation des protéines dans la rétine de poisson-zèbre

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method requires a more technically demanding operation and involves complicated procedures, especially when used in larvae due to their small size, relatively thin and fragile cuticle, and high mortality, which limit its application. In contrast, viral vectors for gene delivery have been developed to surmount extracellular and intracellular barriers. These systems have the advantages of easy manipulation, high gene transduction efficiency, long-term maintenance of gene expression, and the ability to produce persistent effects in vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) are mosquito-specific, small single-stranded DNA viruses that can effectively deliver foreign nucleic acids into mosquito cells; however, the replacement or insertion of foreign genes to create recombinant viruses typically causes a loss of packaging and/or replication abilities, which is a barrier to the development of these viruses as delivery vectors.
Herein, we report using an artificial intronic small-RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. Detailed procedures for the construction, packaging and quantitative analysis of the rAaeDV vectors, and for larval infection are described.
This study demonstrates, for the first time, the feasibility of developing a non-defective recombinant MDV micro RNA (miRNA) expression system, and thus providing a powerful tool for the functional analysis of genes in mosquito and establishing a basis for the application of viral paratransgenesis for controlling mosquito-borne diseases. We demonstrated that Aedes albopictus 1st instar larvae could be easily and effectively infected by introducing the virus into the water body of the larvae breeding site and that the developed rAaeDVs could be used to overexpress or knock down the expression of a specific target gene in larvae, providing a tool for the functional analysis of mosquito genes.

We report using an artificial intronic small RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. A detailed procedure for the construction, packaging, and quantitative analysis of the rAaeDV vectors as well as for larval infection is described.

Utilisation d’un moustique Recombinant Densovirus comme un vecteur de livraison de gène pour l’analyse fonctionnelle des gènes chez les larves de moustiques

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in developmental biology for decades. Traditionally, most gene expression studies relied on visual evaluation of the ISH signal, a method that is prone to bias, particularly in cases where sample identities are known a priori. We have previously reported on a method to circumvent this bias and provide a more accurate quantification of ISH signals. Here, we present a simple guide to apply this method to quantify the expression levels of genes of interest in ISH-stained embryos and correlate that with their corresponding genotypes. The method is particularly useful to quantify spatially restricted gene expression signals in samples of mixed genotypes and it provides an unbiased and accurate alternative to the traditional visual scoring methods.

Gene editing technologies have enabled researchers to generate zebrafish mutants to investigate gene function with relative ease. Here, we provide a guide to perform parallel embryo genotyping and quantification of in situ hybridization signals in zebrafish. This unbiased approach provides greater accuracy in phenotypical analyses based on in situ hybridization.

Génotypage et quantification de l'hybridation in situ Taining in Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

Microdissection de capture laser du cartilage embryonnaire de souris et de l'os pour l'analyse d'expression génique

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine mammary gland is composed of two distinct epithelial cell compartments, serving different functions: the outer, contractile myoepithelial compartment and the inner, secretory luminal compartment. Here, we describe a method by which the cells comprising these compartments are isolated and then combined to investigate their individual lineage contributions to mammary gland morphogenesis and differentiation. The method is simple and efficient and does not require sophisticated separation technologies such as fluorescence activated cell sorting. Instead, we harvest and enzymatically digest the tissue, seed the epithelium on adherent tissue culture dishes, and then use differential trypsinization to separate myoepithelial from luminal cells with ~90% purity. The cells are then plated in an extracellular matrix where they organize into bilayered, three-dimensional (3D) organoids that can be differentiated to produce milk after 10 days in culture. To test the effects of genetic mutations, cells can be harvested from wild type or genetically engineered mouse models, or they can be genetically manipulated prior to 3D culture. This technique can be used to generate mosaic organoids that allow investigation of gene function specifically in the luminal or myoepithelial compartment.

The mammary gland is a bilayered structure, comprising outer myoepithelial and inner luminal epithelial cells. Presented is a protocol to prepare organoids using differential trypsinization. This efficient method allows researchers to separately manipulate these two cell types to explore questions concerning their roles in mammary gland form and function.

Génération d’organoïdes mammaires mosaïques par trypsinisation différentielle

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...