Ces méthodes ont été utilisées pour développer le premier modèle de poisson zèbre de métastases de neuroblastome. Et de démontrer que ce modèle peut récapituler fidèlement de nombreuses caractéristiques des métastases observées chez les patients présentant un risque élevé de neuroblastome. Le principal avantage de ce modèle métastatique de poisson-zèbre est l’imagerie in vivo en temps réel de la dissémination tumorale pour mieux comprendre quand, et éventuellement comment les métastases se produisent.
Cette technique n’est pas spécifique au neuroblastome. Il peut être appliqué à des modèles de poisson-zèbre de divers types de cancers tant que les cellules tumorales peuvent être identifiées et suivies, ce qui ouvre un éventail de possibilités. Pour commencer, développer une lignée de poissons transgénique hétérozygote surexprimant à la fois MYCN et LMO1 en croisant les lignées transgéniques MYCN et LMO1.
Un jour après la fécondation, utilisez un microscope à fluorescence stéréoscopique pour trier la progéniture de l’outcross pour l’expression de l’EGFP, qui se présente comme des points positifs de l’EGFP. Après le tri, isolez les embryons criblés dans des boîtes de Pétri séparées et étiquetez les plats comme MYCN positif ou MYCN négatif. Visualisez et triez les embryons des deux groupes pour l’expression de LMO1 trois à quatre jours après la fécondation.
Recherchez des taches de fluorescence rouges dans le ganglion cervical supérieur et les cellules neuronales dopaminergiques non PSNS, en particulier dans la moelle oblongée du cerveau postérieur. Effectuez le dépistage avant que les embryons n’atteignent cinq jours après la fécondation. Ensuite, isolez les poissons triés en quatre groupes de génotypes différents et étiquetez comme MYCN seulement, LMO1 seulement, MYCN et LMO1 à la fois et de type sauvage.
Élevez-les dans des conditions identiques selon les protocoles standard. Visualisez les tumeurs avec un microscope à fluorescence stéréoscopique en retournant doucement les poissons avec une spatule métallique des deux côtés latéraux pour voir la tumeur. Après avoir identifié les poissons porteurs de tumeurs possibles, isolez-les dans un réservoir séparé avec des étiquettes appropriées qui incluent la date de naissance, la date à laquelle la tumeur a été dépistée et le génotype.
Six semaines après la fécondation, répétez les étapes précédentes pour dépister les poissons porteurs de tumeurs et les poissons non porteurs de tumeurs afin de confirmer la présence de tumeurs pour les poissons précédemment dépistés ou d’identifier de nouveaux poissons porteurs de tumeurs. Recherchez la taille soutenue ou augmentée de la masse positive de fluorescence et des poissons porteurs de tumeurs confirmés. Après avoir identifié les poissons porteurs de tumeurs, surveillez-les toutes les deux semaines pour détecter des signes de migration des cellules tumorales, qui se présentent sous la forme de minuscules masses tumorales EGFP ou mCherry positives loin du site primaire de la genèse tumorale.
Isolez ces poissons dans des réservoirs séparés au besoin et étiquetez de manière appropriée pour indiquer les métastases possibles. Après avoir interprété le MYCN hétérozygote chez les poissons LMO1, et lors du tri de leur progéniture, l’expression de l’EGFP MYCN était importante dans les cellules neuronales dopaminergiques non PSNS un jour après la fécondation. En revanche, l’expression de LMO1 était importante dans les cellules PSNS et les cellules neuronales dopaminergiques non PSNS.
Des masses tumorales fluorescentes positives ont été détectées dans les tissus des organes, éloignés du site tumoral primaire dans le poisson transgénique composé avec surexpression de MYCN et de LMO1, mais pas chez les poissons transgéniques avec l’expression de MYCN seul. La coloration H & E des sections chirurgicales montre que la tumeur primaire est née de la région de la glande interrénale, l’équivalent du poisson zèbre de la glande surrénale humaine qui est le site le plus commun de la maladie primaire chez le patient atteint de neuroblastome. Des masses tumorales éloignées de la glande internatale ont été détectées dans plusieurs régions, y compris la partie distale du rein, l’orbite, les branchies, la rate et la paroi interne de la chambre auriculaire du cœur.
La lignée de neuroblastes PSNS des cellules tumorales au niveau de la tumeur primaire et de tous les sites métastatiques a été confirmée. Des quantités significativement amplifiées et une épaisseur accrue de fibres de collagène colorées par PSR ont été trouvées dans les tumeurs MYCN LMO1 par rapport aux tumeurs exprimant MYCN seul. Après avoir utilisé cette procédure, le dépistage de médicaments et le test de nouvelles thérapies anticancéreuses peuvent être appliqués, ce qui peut potentiellement conduire au développement d’agents alternatifs pour prévenir et traiter les cancers métastatiques.
