Partie 1: marquage fluorescent de l&#39;ADNc Le colorant Cy3 utilisés dans l&#39;expérience microarray est sensible à la photo-dégradation. La procédure devrait avoir lieu en un minimum de lumière. Le protocole de marquage a été adapté à partir du système d&#39;étiquetage CGH array BioPrime génomique manuelle 1. <ol><li> Les réactifs pour la réaction de marquage sont stockés à -20 ° C. De la CGH-array génomique BioPrime système d&#39;étiquetage de dégel 2.5X Tampon amorce aléatoire, mélanger dCTP 10X, et une eau sans nucléase. Aussi le dégel le colorant Cy3-dCTP. Après décongélation, centrifuger brièvement tous les réactifs avant utilisation. </li><li> Une réaction de marquage séparé devra être rempli pour chaque échantillon d&#39;ADNc pour être analysés. Dans un 0,6 ml à paroi épaisse du tube ajouter 500 ng d&#39;ADNc, 40 pl de tampon 2.5X amorce aléatoire et sans nucléase l&#39;eau pour atteindre un volume total de 86 ul. </li><li> Mélangez bien et centrifuger brièvement. Incuber de réaction pendant 5 minutes à 100 ° C sur un thermocycleur. </li><li> Immédiatement réaction de transfert dans une boue bain de glace pendant 10 minutes. </li><li> Pour chaque tube, puis ajouter 10 ul mélange de dCTP 10X, 2 pl 1 mM Cy3-dCTP et 2 polymérase ADN ul Exo Klenow. La polymérase Klenow Exo l&#39;ADN doit être laissé dans le congélateur jusqu&#39;à ce que nécessaire et doit toujours être gardé sur la glace. </li><li> Mélangez bien et la réaction centrifuger brièvement. </li><li> Incuber réaction à 37 ° C pendant 16 heures dans un thermocycleur. </li></ol> Partie 2: Précipitation des ADNc marqué <ol><li> Avant de continuer dans le tour du protocole sur le système d&#39;hybridation NimbleGen et permettent au système de s&#39;équilibrer à 42 ° C. </li><li> Pour chaque réaction, placer une colonne Microcon dans un tube de 1,5 ml. Ajouter 300 ul 0,1 X SSC à chaque colonne suivies par le contenu de la réaction de marquage (100 pi). </li><li> Centrifuger le tube contenant la colonne à 16 100 xg pendant 10 minutes à 4 ° C. </li><li> Jeter le débit à travers, ce qui peut être légèrement de couleur rose, et ajouter un autre 300 pi 0,1 X SSC à la colonne. </li><li> Répétez centrifugation à 16100 xg pendant 10 minutes à 4 ° C. </li><li> Jeter le débit à travers et d&#39;ajouter un supplément de 300 pl 0,1 X SSC à la colonne. </li><li> Centrifuger à 16100 xg pendant 12 minutes à 4 ° C. </li><li> Jeter les traverser. Le débit à travers devrait être clair après ce dernier lavage et vous devriez être en mesure de voir l&#39;ADNc roses marqués sur la colonne. </li><li> Appliquer 100 ul eau sans nucléase à la colonne. Retirer la colonne du tube de 1,5 ml et inverser la colonne dans un nouveau tube de 1,5 ml. </li><li> Centrifuger à 2300 xg pendant 2 minutes à 4 ° C. L&#39;ADNc marqué doit être réhydraté dans l&#39;eau qui s&#39;accumule au fond du tube. </li><li> Utilisez un NanoDrop ND-1000 spectrophotomètre conformément aux instructions du fabricant pour calculer la concentration d&#39;ADN et d&#39;évaluer l&#39;incorporation de colorants en calculant le ratio de la base pour la teinture, où le nucléotide à la Cy3 ratio est égal à l&#39;A 260 / A 550 multiplié par 23,15. La base de ratio de teinture doit être entre 50 et 80. </li><li> Si ADNc s&#39;ils sont étiquetés suffisamment, aliquot 6 ug d&#39;ADNc marqué dans un nouveau tube de 1,5 ml. </li><li> Mélanger un volume de 3 M 0,1 X NaOAc, pH 5,2 et 1x volume d&#39;isopropanol. Laisser le mélange à incuber dans l&#39;obscurité pendant 30 minutes à température ambiante. </li><li> Suivant centrifuger les échantillons à 16100 xg pendant 20 minutes à température ambiante. </li><li> Soigneusement jeter le surnageant sans perturber le culot d&#39;ADN, qui devraient être de couleur rose. </li><li> Effectuer un lavage d&#39;éthanol par addition de 500 ul EtOH 70% et mélanger par inversion douce. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 16 100 xg pendant 5 minutes à température ambiante. </li><li> Retirer le surnageant, inverser le tube, et de permettre le culot sécher pendant 5 minutes. À cette étape, le culot peut être stocké à -20 ° C si désiré ou le protocole peut être poursuivi à l&#39;étape d&#39;hybridation. </li></ol> Partie 3: Hybridation La procédure de l&#39;hybridation est adapté du Guide de l&#39;utilisateur Roche NimbleGen Arrays pour 2 Analyse expression génique. <ol><li> Dissoudre le culot dans 5 pi d&#39;eau sans nucléase. </li><li> Une fois la pastille est dissoute ajouter des composants croisements énumérés au Tableau 1. Composants d&#39;hybridation sont dans le Kit de Roche NimbleGen hybridation. Après tous les composants sont ajoutés au volume total devrait maintenant total de 18 ul. Mélangez bien et faites tourner la brève tube pour recueillir le contenu vers le bas. </li><li> L&#39;étape suivante consiste à dénaturer l&#39;ADNc marqué en le plaçant sur un bloc chauffant à 95 ° C pendant 5 minutes. </li><li> Transférer immédiatement le tube à la système d&#39;hybridation NimbleGen tandis que les tableaux sont préparés dans les étapes suivantes. </li><li> Microarrays devraient toujours être manipulés avec soin et stockés conformément aux instructions du fabricant. Roche NimbleGen recommande de stocker les tableaux d&#39;expression dans le noir avec déshydratant à température ambiante. </li><li> Chargez le tableau dans l&#39;outil d&#39;alignement de précision Mixer (PMAT) fourni dans les accessoires de NimbleGen le traitement de tableau. </li> &lt;li&gt; Charger une table de mixage sur le X1 PMAT et retirer la bande adhésive avec une pince. Fermez la PMAT sécurisée. Appliquer une pression vers le mélangeur à travers le trou dans la PMAT et ouvrir lentement pour que le tableau et mélangeur se désengager de la PMAT. </li><li> Fermement appliquer une pression avec le brayer autour de l&#39;extérieur de la console afin d&#39;assurer l&#39;étanchéité au tableau est complet et d&#39;enlever toutes les bulles. Placez le complexe matrice-mélangeur sur le système d&#39;hybridation à se réchauffer. </li><li> Avec une pipette de déplacement, ajouter lentement 15 pi de l&#39;échantillon marqué dans l&#39;orifice de remplissage. C&#39;est le trou situé dans le centre de la table de mixage. Appliquer une pression lente et régulière à la pipette afin que l&#39;échantillon se répand uniformément à travers le mélangeur sans bulles d&#39;air. Essuyer tout excès d&#39;échantillon par les trous de port et d&#39;étanchéité des hublots avec des bandes adhésives. </li><li> Fermez le loquet et commencer à mélanger de la solution d&#39;hybridation en utilisant le programme B sur le système d&#39;hybridation NimbleGen. Autoriser puces d&#39;hybridation pour les 16-20 heures. </li></ol> Partie 4: Post-hybridation lave et de balayage des biopuces La procédure de lavage et de balayage est adapté du Guide de l&#39;Roche NimbleGen tableaux de l&#39;utilisateur pour l&#39;analyse de l&#39;expression des gènes 2. <ol><li> Une fois que l&#39;hybridation est presque terminé de préparer les tampons de lavage comme indiqué au tableau 2. Préchauffer IA tampon de lavage à 42 ° C dans un bain d&#39;eau. </li><li> Allumez le scanner GenePix array 4000B et le scanner permettent de se réchauffer pendant environ 15 minutes avant utilisation. </li><li> Verser l&#39;IA préchauffé tampon de lavage dans un plat. </li><li> Retirez le complexe array-mélangeur à partir du système d&#39;hybridation et de NimbleGen glisser dans le gabarit (fourni dans les accessoires de NimbleGen le traitement de tableau). Assemblée submerger dans préchauffé IA tampon de lavage et retirez soigneusement mélangeur en retirant de la diapositive. </li><li> Retirer tableau à partir de gabarit et agiter pendant 15 secondes dans le tampon de lavage IA. </li><li> Transférez rapidement tableau dans un rack glisser dans la température du tampon IB salle de lavage. Agiter le rack glisser vigoureusement pendant 2 minutes. </li><li> Transfert du rack glisser dans du Wash Buffer II et agiter pendant 1 minute. </li><li> Transfert du rack glisser dans le tampon de lavage III et agiter pendant 15 secondes. </li><li> Transférer le tableau dans la diapositive de séchage par centrifugation et de spin 2 minutes pour enlever toute humidité. Procéder à la numérisation. </li><li> Il est recommandé de scanner le réseau immédiatement, car le colorant est sensible à la fois la lumière et l&#39;ozone. </li><li> Chargez le tableau, code à barres vers le bas, dans le scanner GenePix 4000B array. </li><li> Ouvrez le logiciel GenePix Pro et de procéder à la numérisation de la matrice. Les tableaux Roche NimbleGen l&#39;expression des gènes d&#39;utiliser une stratégie d&#39;une couleur d&#39;hybridation. En conséquence une seule longueur d&#39;onde est nécessaire pour la numérisation. Numérisation du signal de fluorescence Cy3 utilisant le laser à 532 nm. Ouvrez la boîte de dialogue de matériel et de mise en valeur de consigne PMT du laser à 532 nm pour une valeur de 500. </li><li> Dans la boîte de dialogue du matériel réglage, régler la puissance à 100%, la taille des pixels à 5 microns, les lignes à moyenne à 1, la position et de se concentrer à 0 microns. </li><li> Effectuez une numérisation de prévisualisation et de mettre la zone de numérisation. </li><li> Effectue un balayage. </li><li> Une fois la numérisation est terminée vérifiez l&#39;histogramme de l&#39;image. Idéalement 1e-5 compte normalisée devrait être à 65000 signifie que la limite de la saturation ~ 1-2% des fonctionnalités sont saturés. Si les comptages normalisés sont moins 1e-5, augmenter le gain du PMT et de réanalyser la diapositive. Si les comptages normalisés sont supérieurs à 1e-5, diminuer le gain du PMT et de réanalyser la diapositive. </li><li> Une fois la numérisation est terminée enregistrer l&#39;image. Il est recommandé de choisir une convention d&#39;appellation standard pour les images pour en faciliter le renvoi. L&#39;image peut désormais être chargé dans le programme d&#39;analyse des données de préférence pour la normalisation des données et le calcul des valeurs d&#39;intensité. </li></ol> Les résultats représentatifs Vous pouvez tout d&#39;abord commencer à évaluer l&#39;efficacité de la réaction de fluorescence Cy3 étiquetage de l&#39;ADNc lorsque l&#39;on commence l&#39;lavages avec 0,1 X SSC. Lors de chaque lavage subséquent du flux grâce devrait devenir moins roses de couleur avec le dernier flux grâce clair. En outre, le Cy3 étiqueté produit d&#39;ADNc doit être visible sur la colonne au cours de ces étapes de lavage. Si le débit à travers est rose vif dans la couleur ou il n&#39;ya pas de produit de rose sur la colonne, c&#39;est une bonne indication que la réaction de marquage n&#39;a pas procédé correctement. La réaction de marquage peuvent être évalués quantitativement en utilisant le ND-1000 NanoDrop spectrophotomètre pour déterminer la concentration de l&#39;ADN marqué et de la base au rapport de colorant (figure 1). La réaction de marquage des rendements régulièrement au moins 10 ug d&#39;ADN marqué dans notre laboratoire. L&#39;incorporation de colorants peuvent être calculées en utilisant une simple base / colorant où le ratio de nucléotide Cy3 ratio est égal à l&#39;A 260 / A 550 multiplié par 23,15. Des valeurs allant de 50 à 80 indiquent suffisamment l&#39;incorporation du colorant dans la réaction de marquage. Si la réaction de marquage donne une faible concentration de l&#39;ADN ou l&#39;incorporation de colorants pauvres, l&#39;hybridation de l&#39;échantillon sur le microroarray n&#39;est pas recommandée et réaction de marquage doit être répété. Évaluation de la qualité de l&#39;hybridation peut être réalisée en évaluant l&#39;histogramme d&#39;image et l&#39;image numérisée du microréseau (figure 2). Hybridations acceptable aura 1-2% des fonctionnalités saturés (ie, ce qui donne 1e-5 compte normalisé à la limite de saturation 65000) avec la valeur du PMT mis près de 500. Si la valeur du PMT doit être ajusté de façon drastique à partir de 500 pour atteindre 1e-5 compte normalisé à la limite de saturation 65000, cela indique généralement une hybridation pauvres de l&#39;ADNc marqué au microarray. La qualité des données sera constituée si ces données se poursuit par une analyse ultérieure. La qualité de l&#39;hybridation peut également être évaluée qualitativement en regardant les images du tableau numérisée (figure 3). Le kit de Roche NimbleGen hybridation contient un mélange d&#39;oligo alignement de Cy3 et Cy5-oligonucléotides marqués 48mer qui s&#39;hybrident à des fonctions d&#39;alignement sur les tableaux. Évaluation qualitative de l&#39;intensité de l&#39;alignement des oligos d&#39;autres caractéristiques sur le tableau permet un contrôle de qualité sur l&#39;efficacité de l&#39;hybridation de l&#39;ADNc marqué par fluorescence sur le tableau. Suite à une analyse plus poussée, un nuage de points de vos données analysées peuvent être utilisées pour déterminer les niveaux relatifs d&#39;expression des gènes et d&#39;identifier les gènes qui sont différentiellement exprimés entre les échantillons (figure 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1471/1471figure1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure1thumb.jpg" alt="Vignette de la figure 1" /></a> Figure 1. Un spectre NanoDrop à partir d&#39;ADNc de rendement étiquetés avec Cy3. ADNc marqué et l&#39;incorporation de colorants peuvent être évaluées en utilisant un ND-1000 NanoDrop spectrophotomètre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1471/1471figure2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure2thumb.jpg" alt="Vignette de la figure 1" /></a> Figure 2. Un histogramme des puces GenePix numérisation. Qualité de l&#39;hybridation peut être évaluée en évaluant l&#39;histogramme de l&#39;image. Hybridations acceptable aura 1-2% des fonctionnalités saturé de 1e-5 compte normalisé à la limite de saturation 65000 avec la valeur du PMT mis près de 500. <img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure3.jpg" border="0" alt="Figure 3" /> Figure 3. Une image scannée biopuces. Hybridation de qualité peut être évaluée par visualisation de l&#39;image numérisée du microréseau. L&#39;image doit être examiné pour la présence de poussière ou d&#39;autres facteurs interférant interdisant la visualisation de chaque fonctionnalité et ainsi, empêcher le calcul précis de l&#39;intensité de fluorescence de la fonction. L&#39;intensité de la oligos alignement peut être comparé aux autres caractéristiques de la matrice pour évaluer l&#39;efficacité d&#39;hybridation. <img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure4.jpg" border="0" alt="Figure 4" /> Figure 4. Un diagramme de dispersion d&#39;une expérience microarray analysés. Le but de cette procédure est d&#39;identifier les gènes qui sont exprimés différentiellement dans vos échantillons. Données de biopuces peuvent encore être analysées et visualisées dans un nuage de points de visualiser les gènes qui sont différentiellement exprimés. Tableau 1. Composants du kit Roche NimbleGen hybridation à ajouter pour 2 étape d&#39;hybridation. <table border="1"><tbody><tr><td> Composante </td><td> Volume </td></tr><tr><td> Exemples (dissous dans l&#39;eau) </td><td> 5 pl </td></tr><tr><td> Tampon d&#39;hybridation 2X </td><td> 9 ul </td></tr><tr><td> Un Hyb </td><td> 3,6 ul </td></tr><tr><td> Oligo Alignement </td><td> 0,4 pi </td></tr><tr><td> Le volume total </td><td> 18 ul </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Laver tampons pour être prêt pour le lavage des tableaux suivants hybridation. <table border="1"><tbody><tr><td> Composante </td><td> Tampon de lavage IA * </td><td> Tampon de lavage IB </td><td> Wash Buffer II </td><td> Tampon de lavage III </td></tr><tr><td> Eau </td><td> 225 ml </td><td> 225 ml </td><td> 225 ml </td><td> 225 ml </td></tr><tr><td> Tampon de lavage 10X I, II ou III </td><td> 25 ml </td><td> 25 ml </td><td> 25 ml </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td> 1 M de DTT </td><td> 25 ul </td><td> 25 ul </td><td> 25 ul </td><td> 25 ul </td></tr><tr><td> Le volume total </td><td> 250 ml </td><td> 250 ml </td><td> 250 ml </td><td> 250 ml </td></tr></tbody></table> * Pré-chaude à 42 ° C

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> BioPrime Array CGH Genomic Labeling System Manual. , (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Roche NimbleGen Arrays User's Guide for Gene Expression Analysis. , (2008).</li></ol>

Protocoles microarray Beaucoup, y compris celui détaillé ici, l&#39;utilisation de colorants fluorescents comme un moyen de mesurer et de quantifier l&#39;hybridation. Le colorant fluorescent Cy3 est sensible à la dégradation de la photo et l&#39;ozone. Il est recommandé que la procédure soit menée dans un minimum d&#39;éclairage. En outre, les petites particules de poussière peuvent interférer avec l&#39;hybridation et la numérisation. Une attention particulière devrait être accordée à s&#39;assurer que ...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Array Microcentrifuge Dryer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ISC Bioexpress</td>
<td>C-1303-T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BioPrime Array CGH Genomic Labeling System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18095-011</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cyanine 3-dCTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer</td>
<td>NEL576</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GenePix 4000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>GENEPIX 4000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcon YM-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>42411</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NimbleGen Array Processing Accessories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223539001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NimbleGen Hybridization Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223474001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NimbleGen Hybridization System 4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223652001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NimbleGen Wash Buffer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223504001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>X1 Mixers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223725001</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

global gene expression analysis using a zebrafish oligonucleotide microarray platform

Gene la technologie des microréseaux permet la mesure quantitative et le profilage d&#39;expression génique des niveaux de transcription sur une base du génome entier. Gene la technologie des puces est utilisée dans de nombreuses disciplines biologiques dans une variété d&#39;applications incluant l&#39;analyse d&#39;expression génique globale par rapport au stade de développement, à un état de maladie, et dans les réponses toxiques. Ici, nous incluons une démonstration de l&#39;analyse de l&#39;expression des gènes en utilisant une échelle mondiale complète zebrafish spécifiques plateforme biopuces oligonucléotides. La plate-forme de poisson zèbre microréseaux d&#39;expression contient 385 000 sondes, 60 paires de base de longueur, interrogeant 37 157 cibles avec jusqu&#39;à 12 sondes par cible. Pour cette plateforme, toutes les informations d&#39;ADNc et génomiques disponibles pour le poisson zèbre ont été recueillies auprès de divers y compris les bases de données génomiques Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC ( http://genome.ucsc.edu), et ZFIN (http://www.zfin.org). En conséquence, cette gamme offre une couverture complète d&#39;expression du transcriptome zèbre actuel. Les microréseaux d&#39;expression poisson zèbre a été imprimé par Roche NimbleGen (Madison, WI). Cette démonstration technique comprend le marquage fluorescent d&#39;un produit d&#39;ADNc, l&#39;hybridation de l&#39;ADNc produit étiqueté à la plateforme biopuces, et la numérisation de tableau pour l&#39;acquisition du signal en utilisant la stratégie d&#39;une couleur d&#39;analyse.

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Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Microarrays Gene sont des outils puissants en matière de profilage d&#39;expression génique au niveau du génome entier. Cette technologie a des applications dans une variété de disciplines biologiques, y compris la biologie du développement et de la toxicologie. Dans cette vidéo, nous détaillons un protocole d&#39;analyse d&#39;expression génique globale à l&#39;aide d&#39;une plateforme complète d&#39;oligonucléotides biopuces pour le poisson zèbre.

Mondial Analyse expression génique utilisant une plateforme biopuces oligonucléotidiques Zebrafish

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

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Research

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11.6K vues.  Purdue University. Microarrays Gene sont des outils puissants en matière de profilage d'expression génique au niveau du génome entier. Cette technologie a des applications dans une variété de disciplines biologiques, y compris la biologie du développement et de la toxicologie. Dans cette vidéo, nous détaillons un protocole d'analyse d'expression génique globale à l'aide d'une plateforme complète d'oligonucléotides biopuces pour le poisson zèbre.

Vidéo: Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Analyse bactérienne expression génique par puces à ADN

Recherche

Biologie

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La préparation des cultures primaires de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse murine pour l&#39;électroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

Isolement d&#39;ARN à partir de synthèse d&#39;ADNc embryonnaires Zebrafish et pour analyser l&#39;expression génique

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilisation du système d&#39;électroporation Gene Pulser MXcell à transfecter des cellules primaires à haut rendement

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Aide d&#39;un compteur de cellules automatisé pour simplifier les études d&#39;expression génique: Knockdown siRNA de l&#39;IL-4 dans l&#39;expression des gènes dépendant cellules Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Analyse de l&#39;expression génique dans l&#39;agrile du frêne ( Agrilus planipennis) En utilisant quantitative en temps réel-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Les articles inclus en paraffine et congelés de Drosophile</emMuscles adultes>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Détermination des profils d&#39;expression génétique dans les C. elegans Utilisation microréseaux et PCR en temps réel

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

La reconstitution in vitro de l&#39;actif T. La télomérase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional mutagenesis using fluorescent reporters to tag expression of mutated genes. Several laboratories have constructed and tested enhancer- and gene-trap vectors in zebrafish, using fluorescent proteins, Gal4- and lexA- based transcriptional activators as reporters 1-7. These vectors had two potential drawbacks: suboptimal stringency (e.g. lack of ability to differentiate between enhancer- and gene-trap events) and low mutagenicity (e.g. integrations into genes rarely produced null alleles). Gene Breaking Transposon (GBTs) were developed to address these drawbacks 8-10. We have modified one of the first GBT vectors, GBT-R15, for use with Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter and added UAS:eGFP as the secondary reporter for direct detection of gene trap events. Application of Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter provides two main advantages. First, it increases sensitivity for genes expressed at low expression levels. Second, it enables researchers to use gene trap lines as Gal4 drivers to direct expression of other transgenes in very specific tissues. This is especially pertinent for genes with non-essential or redundant functions, where gene trap integration may not result in overt phenotypes. The disadvantage of using Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter is that genes coding for proteins with N-terminal signal sequences are not amenable to trapping, as the resulting Gal4-VP16 fusion proteins are unlikely to be able to enter the nucleus and activate transcription. Importantly, the use of Gal4-VP16 does not pre-select for nuclear proteins: we recovered gene trap mutations in genes encoding proteins which function in the nucleus, the cytoplasm and the plasma membrane.

This protocol describes the method of gene trap insertional mutagenesis using Gal4-VP16 as the primary reporter and GFP/RFP as secondary reporters in zebrafish. Approximately one in ten high-expressing F0 fish yield gene trap progeny co-expressing GFP and RFP. The screening procedure can be readily scaled to adapt to the size of the laboratory performing the insertional mutagenesis screen.

Gene piégeage utilisant Gal4 chez le poisson zèbre

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...