Je remercie Anthony Taylor pour la formation initiale dans l&#39;enregistrement intracellulaire in vivo et A Maxwell Brown et David de l&#39;aide pour le développement initial de la technique de coloration intracellulaire. Je remercie M. Argent de l&#39;aide pour la macro collocalization. Beaucoup de chercheurs avec lesquels j&#39;ai collaboré aperçu fourni dans le développement de cette technique dont R. Donga, M. Moritani, P. Luo, R. Ambalavanar. Cette technique a été développée avec un soutien considérable de subventions des NIH DE10132, DE15386 et RR017971.

1. Préparation des animaux <ol><li> Anesthetize rat avec du pentobarbital de sodium (50mg/kg IP) et les placer sur un coussin chauffant. Rasez la peau recouvrant le crâne avec une tondeuse postérieure animal. Vérifiez l&#39;animal pour s&#39;assurer que le niveau chirurgical du niveau de l&#39;anesthésie a été obtenue par des tests de l&#39;absence d&#39;un réflexe de retrait et de la vocalisation lorsque les doigts sont pincés ainsi que l&#39;absence d&#39;un réflexe palpébral. Vérifier le niveau d&#39;anesthésie toutes les 15 minutes et maintenir un niveau chirurgicale de anesthetisa par des injections de pentobarbital de sodium 15mg/kg toutes les 45 minutes. </li><li> Utiliser une technique aseptique et faire une incision dans la région inguinale juste distale au pli formé par l&#39;abdomen et la cuisse intérieure et insérer une canule (1 mm de diamètre, Clay Adams) dans la veine fémorale et l&#39;artère fémorale. Faire une incision médiane dans la région sous-mandibulaire, les muscles sous-hyoïdiens reflètent. Faire une petite incision dans la trachée et insérer une canule (2 mm de diamètre) pour permettre la ventilation. Tye une suture autour de l&#39;trachael cannual pour le fixer en place.Monitor la pression artérielle systémique systolique et diastolique par la canule artérielle. En plus de surveiller le retrait et réflexe palpébral maintenant surveiller la pression artérielle pour évaluer le niveau de l&#39;anesthésie. Administrer une anesthésie supplémentaires si nécessaire par la canule veineuse. </li><li> Placez le rat dans un cadre stéréotaxique et d&#39;effectuer une craniotomie pour exposer le cervelet. Fixer la canule trachéale à un ventilateur de rongeurs. Aérer l&#39;animal avec un volume de 2 cm 3 à un taux de 100/min avec de l&#39;air humidifié. Une pression expiratoire positive de 1 cm H 2 O devraient être maintenus pour éviter l&#39;effondrement du poumon. Toutes les 15 minutes hyperinflate les poumons pour éviter une atélectasie. Puis couvrir la surface du cerveau avec de l&#39;huile minérale chauffée (30 ° C). Soyez prudent pour éviter les grands sinus veineux situé directement sous la jonction entre les os pariétal et interpariétales. </li><li> Appliquez de la colle cyanoacrylate à une tige couplé à un vibrateur électromagnétique et attacher la tige dans le diastème de la mâchoire. Déplacer les signaux de commande en utilisant la mandibule vers le vibreur soit d&#39;une sortie A / D de l&#39;ordinateur ou d&#39;un générateur de signal. </li><li> Placez une électrode siliver-chlorure d&#39;argent mise à la terre sous la peau adjacente à la craniotomie. </li></ol> 2. Préparation de l&#39;électrode <ol><li> Fabriquer des microélectrodes en verre de quartz ou aluminosilicate aide d&#39;un extracteur de microélectrodes horizontale. </li><li> Remplissez la microélectrode avec biotinamide 5-10% dissous dans 0,25 M de KCl et 0,5 M de tampon Tris-HCl (pH 7,6) ou tetramethlyrhodamine 2% dans une solution saline (pH 6). Vérifiez l&#39;impédance d&#39;électrode avec un testeur de l&#39;électrode. Pour enregistrer à partir des axones de grand diamètre fabriquer des électrodes avec une impédance de 60 Ω-80M, pour les petites et les axones des interneurones fabriquer des électrodes avec une impédance de 80-150MΩ. </li><li> Placez la microélectrode dans le stade de la tête de l&#39;électromètre. Visualisez l&#39;électrode à travers un petit télescope (20X avec un réticule de joint) qui est fixé en position derrière la tête de l&#39;animal. En utilisant le télescope est importante car elle permet d&#39;être électrodes positionnées stéréotaxique avec une grande précision. </li></ol> 3. D&#39;enregistrement électrophysiologiques et coloration intracellulaire <ol><li> Faites une petite ouverture dans la pie-mère et surcompenser les commentaires de capacitance de sorte que lorsque l&#39;électrode touche le cerveau un signal de retour est produite. Ceci permet une localisation précise de la surface du cerveau. </li><li> Produire répétées déplacement mandibulaire et faire progresser l&#39;électrode dans le cerveau avec un moteur pas à pas. </li><li> Reconnaître impalements neuronale par une chute brutale du potentiel de DC et identifier intrasomatic impalements neuronale par l&#39;activité synaptique en cours. La vibration de l&#39;électrode avec la surcompensation de la capacité ou de taraudage produisent rarement une pénétration cellulaire de succès. En raison de la haute impédance des électrodes, des réponses neuronales sont rarement observés avant la pénétration. </li><li> Une fois que vous empaler un neurone et la pénétration est considérée comme stable, caractériser la réponse des neurones utilisant la rampe, les détenir et mouvement de la mâchoire sinusoïdale. 5 Carte du champ récepteur des neurones en sondant la peau autour de la tête et intra cavité buccale avec une sonde non-conducteur comme un bâton de bois. Si cela est pertinent à l&#39;étude, d&#39;examiner la réponse du neurone à d&#39;autres stimuli fonctionnellement pertinents tels que la contraction musculaire et des stimuli nocifs. Primaire 6 afférente nociceptive récepteurs neuronaux réagir à des stimuli nociceptifs. Anesthesetics général tels que le sodium pentobarbital ne pas bloquer la conduction axonale dans les neurones afférents primaires mais plutôt baisser la transmission synaptique. Ainsi conduction axonale dans l&#39;axone des neurones afférents primaires est préservée. </li><li> Injecter courant continu (CC, 1-4NA) pour une durée d&#39;injection totale de 15 70nA minutes. Surveiller la pénétration électrode pendant l&#39;injection de courant et cesser si le potentiel de membrane devient plus positif que -30 mV.</li></ol> 4. Le traitement des tissus <ol><li> Euthanasier l&#39;animal par une surdose de pentobarbital (140mg/kg IV) et perfuser avec un vasculaires rinçage (NaCl 0,9% à 38 ° C contenant 500 unités d&#39;héparine et de 2% 1ml xylocaïne suivi par du paraformaldéhyde à 4% en tampon phosphate 0,1 M (pH 7,4) . </li><li> Enlever le cerveau et la section, il à 50-100 microns en utilisant un vibratome soit dans le frontal, sagittal ou horizontal. Secions sont collectés flottement libre dans 25 ° C PBS. </li><li> Processus du cerveau pour la DAB par incubation dans du sérum de chèvre normal de 1-2% et 1% de Triton X-100 dans PBS 0,01 M suivie d&#39;une incubation de l&#39;avidine biotine (1:50 Elite Vectastain). Réagir à l&#39;aide des sections de nickel-DAB avec H 2 O 2. Pour traiter pour le Texas Red, incuber dans des sections complexe avidine-biotine (1:50) dans le PBS pendant une nuit à 4 ° C puis incuber à 4% au Texas Red DCS avidine dans PBST à 4 ° C pendant la nuit. Contre-sections avec une lampe fluorescente Nissl tache (NeuroTrace) 20min à 23 ° C. </li><li> Si neurone a été injecté avec de la rhodamine, de visualiser les neurones injectés directement avec un microscope à fluorescence (Ex 545nm). </li></ol> 5. Combinant méthode avec marquage rétrograde, immunocytochimie, imagerie confocale, analyse quantitative colocalisation Le succès de combiner cette technique avec d&#39;autres méthodes dépend largement de marquage intracellulaire bon. <ol><li> La méthode visualisés ici peut facilement être combiné avec l&#39;étiquetage neuronaux rétrogrades. 7-10 Pour ce faire, anesthésier l&#39;animal et en utilisant une technique aseptique, injecter un traceur neuronal comme la peroxydase de raifort (20% peroxydase de raifort. Sigma VI, Sigma) et 1% de germe de blé aggultinated peroxydase de raifort (Sigma) dans les régions cibles périphériques tels que le muscle masséter. Ce traceur neuronal sera repris dans les axones périphériques et transportés via le transport axonal de la soma du motoneurone. Pour le muscle masséter, 15μl de traceur est injecté dans le muscle en utilisant une solution stérile 10 microseringue microlitre. Les animaux sont ensuite placés sur un coussin chauffant et surveillés jusqu&#39;à ce récupéré de l&#39;anesthésie et ensuite placés dans leurs cages pour la récupération. Après 24h, anesthésier les animaux et physiologiquement caractériser les neurones et intracellulairement les tacher. Puis perfuser l&#39;animal tel que décrit ci-dessus et des coupes de tissus processus pour la présence de HRP utilisant tétraméthylbenzidine (TMB) comme chromogène et le tungstate de sodium comme stabilisateur et intensifiée avec le cobalt. Placer dans des sections de sodium à 1% tungstate dissous dans 0,1 M PBS (pH 6,5) et TMB 0,0007% dissous dans l&#39;éthanol absolu et de l&#39;acétone à 15 ° C pendant 20 min. Puis des coupes de tissus réagissent en ajoutant 1,0 ml de 0,3% H 2 O 2 par 100 ml de solution d&#39;incubation pendant 60 min. Rincez le tissu dans 0,1 M de PBS (pH 6,5) et les placer dans diaminobenzidine 0,05% (pH 7,4), le cobalt 0,02% et 0,01% de H 2 O 2 dans 0,1 M PBS (pH 7,4) pendant 10 min. à 37 ° C. Traiter les tissus pour la visualisation des neurones injectés avec biotinamide tel que décrit et visualiser les relations entre les neurones sensoriels étiquetés et une variété de motoneurones. </li><li> La technique montrée ici peut également facilement être combiné avec immnocytochemistry. 6 À titre d&#39;exemple, immunocytochimique processus du cerveau pour la synaptophysine pour localiser avec précision des synapses dans les neurones marqués (Fig. 3). Pour ce faire, incuber des coupes de cerveau de souris anti-synaptophysine anticorps (1:10.000) pour 2 jours à 4 ° C et ensuite incuber dans FITC anti-souris (1:400) pour 1h à 23 ° C. </li><li> Neurones marqués avec des marqueurs fluorescents ou transformés pour l&#39;imagerie de fluorescence sont idéales pour l&#39;imagerie confocale. La figure 3 est un exemple d&#39;une section optique obtenue avec la microscopie confocale à travers un bouton axone. (Fig. 3). Générer des animations de neurones marqués par l&#39;acquisition de plusieurs sections optiques à travers le neurone marqué (fig. 4). </li><li> Neurones marqués par cette méthode peut être utilisée pour l&#39;analyse quantitative colocalisation. Pour ce faire, utiliser une macro logiciels disponibles publiquement en conjonction avec les NIH image (qui se trouve au http://phy.ucsf.edu/ ° idl / colocalization.htm). Localiser synaptophysine dans les terminaisons axonales simple en combinant marquage intracellulaire avec immunocytochimie synaptophysine 6. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Un aperçu des résultats représentatifs qui peuvent être obtenus en utilisant cette méthode sont illustrés dans la Figure 1. Ce tronc cérébral seul neurone a été enregistrée au cours électrophysiologiquement mouvement de la mandibule et, comme on peut clairement être vu, la réponse de ce neurone (figure 1 en bas à gauche, la lumière bleue) a été modulée durant le mouvement. Ce neurone a été injecté avec biotinamide après caractérisation électrophysiologique et ensuite traitées pour être visualisées. Le neurone reconstruite (Figure 1 milieu, vert) peut être réelTed à un repère anatomique, dans ce cas, le noyau moteur du trijumeau désigné (cadre rouge). Basé sur la réponse neuronale pendant le mouvement et la reconstruction de ce neurone peut être identifié comme un neurone fuseau musculaire secondaires afférentes. La figure 2 illustre un exemple représentatif de la réponse physiologique d&#39;un neurone lors d&#39;un déplacement mâchoire. La réponse du neurone est représenté comme fréquence de tir instantané. Notez que la réponse neuronale imite étroitement déplacement mandibulaire indiquant que ce neurone particulier fournit la rétroaction sensorielle liée à la position mandibulaire. La figure 3 est une image à fort grossissement d&#39;un axone intracellulaire teinté combiné avec coloration pour la synaptophysine et une Nissl tache. Notez la colocalisation de la synaptophysine (jaune) au sein de l&#39;axone bouton. Figure 4 est une animation d&#39;un seul neurone physiologiquement caractérisé et intracellulaire étiquetés. <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Aperçu de la méthode. En haut à gauche: déplacement mandibulaire. Moyen d&#39;enregistrement intracellulaire (vert) à partir seul neurone (jaune). La morphologie de ce neurone a été reconstruite après l&#39;enregistrement intracellulaire et de l&#39;injection. Contour rouge indique l&#39;emplacement du noyau moteur du trijumeau. En bas à gauche: la réponse physiologique de ce neurone lors de mouvement de la mâchoire. <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Représentant réponse physiologique d&#39;un neurone sensoriel seul muscle in vivo enregistrées pendant le mouvement de la mandibule. Notez la similitude de la réponse neuronale avec déplacement mâchoire. <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Terminal arborisation axonale avec boutons synaptiques (gonflements rouge) d&#39;un neurone intracellulaire teinté sensorielles qui ont répondu au cours du muscle sondage. Après le traitement pour la synaptophysine immunocytochimiques montre la localisation de la synaptophysine dans le bouton axonal (jaune). Le vert est une Nissl colorant fluorescent. Figure 4. Animation du fuseau musculaire neurone axone afférents primaires dont l&#39;état physiologique de réponse a été enregistrée in vivo au cours des mouvements mandibulaires, l&#39;axone a ensuite été teinté intracellulaire et traitées pour la visualisation. <a href="/files/ftp_upload/2650/collateral4.avi">Télécharger une vidéo haute résolution de la figure 4 ici</a> <a href="/files/ftp_upload/2650/medres.mov">Télécharger une vidéo à résolution moyenne de la figure 4 ici</a>

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	<li>Cuellar, C. A., Tapia, J. A., Juarez, V., Quevedo, J., Linares, P., Marinez, L., Manjarrez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+sinusoidal+electrical+waves+along+the+spinal+cord+during+a+fictive+motor+task.">Propagation of sinusoidal electrical waves along the spinal cord during a fictive motor task.</a> J. Neurosci. 29, 798-810 (2010).</li><li>Frigon, A., Gossard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+specialized+rhythm-generating+mechanisms+in+the+adult+mammalian+spinal+cord.">Evidence for specialized rhythm-generating mechanisms in the adult mammalian spinal cord.</a> J. Neurosci. 30, 7061-7071 (2010).</li><li>Wang, W., Chan, S. S., Heldman, D. A., Moran, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+cortical+representation+of+hand+translation+and+rotation+during+reaching.">Motor cortical representation of hand translation and rotation during reaching.</a> J. Neurosci. 30, 958-962 (2010).</li><li>Ma, C., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+investigating+cortical+control+of+stand+and+squat+in+conscious+behavioral+monkeys.">A method for investigating cortical control of stand and squat in conscious behavioral monkeys.</a> J. Neurosci. Meth. 192, 1-6 (2010).</li><li>Dessem, D., Donga, R., Luo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary-+and+secondary-like+jaw-muscle+spindle+afferents+have+characteristic+topographic+distributions.">Primary- and secondary-like jaw-muscle spindle afferents have characteristic topographic distributions.</a> J. Neurophysiol. 77, 2925-2944 (1997).</li><li>Dessem, D., Moritaini, A., Ambalavanar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptive+craniofacial+muscle+primary+afferent+neurons+synapse+in+both+the+rostral+and+caudal+brain+stem.">Nociceptive craniofacial muscle primary afferent neurons synapse in both the rostral and caudal brain stem.</a> J. Neurophysiol. 98, 214-223 (2007).</li><li>Luo, P., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inputs+from+identified+jaw-muscle+spindle+afferents+to+trigeminothalamic+neurons+in+the+rat:+a+double-labeling+study+using+retrograde+HRP+and+intracellular.">Inputs from identified jaw-muscle spindle afferents to trigeminothalamic neurons in the rat: a double-labeling study using retrograde HRP and intracellular.</a> J. Comp. Neurol. 353, 50-66 (1995).</li><li>Dessem, D., Luo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jaw-muscle+spindle+afferent+feedback+to+the+cervical+spinal+cord+in+the+rat.">Jaw-muscle spindle afferent feedback to the cervical spinal cord in the rat.</a> J. Comp. Neurol. 128, 451-459 (1999).</li><li>Luo, P., Wong, R., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projection+of+jaw-muscle+spindle+afferents+to+the+caudal+brainstem+in+rats+demonstrated+using+intracellular+biotinamide.">Projection of jaw-muscle spindle afferents to the caudal brainstem in rats demonstrated using intracellular biotinamide.</a> J. Comp. Neurol. 358, 63-78 (1995).</li><li>Luo, P., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+anatomy+of+physiologically+identified+jaw-muscle+spindle+afferent+terminations+onto+retrogradely+labeled+jaw-elevator+motoneurons+in+the+rat.">Ultrastructural anatomy of physiologically identified jaw-muscle spindle afferent terminations onto retrogradely labeled jaw-elevator motoneurons in the rat.</a> J. Comp. Neurol. 406, 384-401 (1999).</li><li>Hassani, O. K., Henny, P., Lee, M. G., Jones, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+neurons+intermingled+with+orexin+and+MCH+neurons+in+the+lateral+hypothalamus+discharge+maximally+during+sleep.">GABAergic neurons intermingled with orexin and MCH neurons in the lateral hypothalamus discharge maximally during sleep.</a> Eur. J. Neurosci. 32, 448-457 (2010).</li><li>Inokawa, H., Yamada, H., Matsumoto, N., Muranishi, M., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juxtacellular+labeling+of+tonically+active+neurons+and+phasically+active+neurons+in+the+rat+striatum.">Juxtacellular labeling of tonically active neurons and phasically active neurons in the rat striatum.</a> Neuroscience. 168, 395-404 (2010).</li></ol>

Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les règles et orientations et la réglementation énoncées dans le Guide pour les soins et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire (NIH Publication No. 86-23, révisée en 1985) et l&#39;Université du Maryland et de protection des animaux Utiliser Comité.

La méthode illustrée ici est une technique puissante qui fournit des informations importantes sur la fonction des neurones individuels et la manière dont la réponse des neurones individuels contribue à des circuits neuronaux. 9 Cette connaissance est fondamentale pour comprendre la fonction sensori-motrices. La plus grande force de cette technique est qu&#39;elle permet la détermination d&#39;un grand nombre de paramètres sur un neurone dont la physiologie, la morphologie et de la morphologie synaptiqu...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom de réactif ou de l&#39;équipement </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> vibrateur électromagnétique </td><td> Ling Dynamic Systems </td><td> V101 </td><td></td></tr><tr><td> générateur de signaux </td><td> Systèmes Commentaires </td><td> PFG605 </td><td> capable de produire le signal de sortie trapézoïdale </td></tr><tr><td> électrode de verre </td><td> Sutter Instruments </td><td> AF100-68-10 </td><td> avec des filaments </td></tr><tr><td> Extracteur d&#39;électrode </td><td> Sutter Instruments </td><td> Modèle P-2000 ou P-80 </td><td></td></tr><tr><td> biotinamide </td><td> Vector Laboratories </td><td> SP-1120 </td><td> conservés à 4 ° C </td></tr><tr><td> Texas Red avidine DCS </td><td> Vector Laboratories </td><td> A-2016 </td><td></td></tr><tr><td> tetramethlyrhodamine </td><td> Molecular Probes </td><td> D-3308 </td><td> 3000 poids moléculaire, la lysine fixable </td></tr><tr><td> de souris anti-synaptophysine d&#39;anticorps </td><td> Chemicon </td><td> MAB5258 </td><td></td></tr><tr><td> colorant fluorescent Nissl </td><td> Neurotrace, Molecular Probes </td><td> N-21480 </td><td></td></tr><tr><td> Testeur d&#39;électrode </td><td> Winston Electronics </td><td> BL-1000-B </td><td> pour mesurer l&#39;impédance d&#39;électrode </td></tr><tr><td> électromètre </td><td> Axon Instruments </td><td> Axoprobe 1A, 2B Axoclamp </td><td></td></tr></tbody></table>

physiological, morphological and neurochemical characterization of neurons modulated by movement

Le rôle des neurones individuels et leur fonction dans les circuits neuronaux est fondamentale pour comprendre les mécanismes neuronaux de fonctions sensorielles et motrices. La plupart des enquêtes sur des mécanismes sensori compter ni sur l&#39;examen des neurones tout en un animal est de 1,2 statiques ou enregistrer l&#39;activité neuronale extracellulaire lors d&#39;un déplacement. 3,4 Bien que ces études ont fourni le contexte fondamental de la fonction sensorimotrice, soit ils n&#39;évaluent pas l&#39;information fonctionnelle qui se produit pendant un mouvement ou qui sont limités dans leur capacité à caractériser complètement le phénotype anatomie, la physiologie et neurochimique du neurone. Une technique est montré ici, qui permet une caractérisation complète de neurones individuels pendant une vivo dans le mouvement. Cette technique peut être utilisée non seulement pour étudier les neurones afférents primaires, mais aussi pour caractériser les motoneurones et les interneurones sensori-motrices. Initialement, la réponse d&#39;un seul neurone est enregistrée en utilisant des méthodes électrophysiologiques au cours des différents mouvements de la mandibule suivie par la détermination du champ réceptif pour le neurone. Un traceur neuronal intracellulaire est alors injecté dans le neurone et le cerveau sont traitées de telle sorte que le neurone peut être visualisée en microscopie optique, électronique ou confocale (Fig. 1). La morphologie détaillée des neurones est alors caractérisé reconstitué de manière que la morphologie neuronale peut être corrélé avec la réponse physiologique du neurone (fig. 2,3). Dans cette communication, les principaux détails importants et des conseils pour la mise en œuvre réussie de cette technique sont fournis. De précieuses informations complémentaires peuvent être déterminées pour le neurone à l&#39;étude, en combinant cette méthode avec d&#39;autres techniques. Rétrograde étiquetage neuronales peuvent être utilisées pour déterminer les neurones avec lesquels les synapses des neurones marqués; permettant ainsi la détermination détaillée des circuits neuronaux. Immunocytochimie peut être combinée avec cette méthode pour examiner les neurotransmetteurs dans le neurone marqué et pour déterminer les phénotypes chimiques des neurones avec lesquels les synapses des neurones marqués. Le neurone marqué peut également être traitées pour la microscopie électronique pour déterminer les caractéristiques ultrastructurales et microcircuits du neurone étiquetés. Globalement, cette technique est une méthode puissante pour bien caractériser les neurones au cours du mouvement in vivo permettant ainsi des renseignements importants sur le rôle des neurones dans la fonction sensori-motrices.

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Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

Une technique est décrite pour quantifier la réponse physiologique au in vivo des neurones de mammifères pendant le mouvement et de corréler la physiologie du neurone avec une morphologie neuronale, le phénotype neurochimique et microcircuits synaptique.

Physiologiques, caractérisation morphologique et neurochimiques des neurones modulée par le Mouvement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

physiological-morphological-neurochemical-characterization-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K vues.  University of Maryland. Une technique est décrite pour quantifier la réponse physiologique au in vivo des neurones de mammifères pendant le mouvement et de corréler la physiologie du neurone avec une morphologie neuronale, le phénotype neurochimique et microcircuits synaptique.

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Eye Movement Monitoring of Memory

Explicit (often verbal) reports are typically used to investigate memory (e.g. "Tell me what you remember about the person you saw at the bank yesterday."), however such reports can often be unreliable or sensitive to response bias 1, and may be unobtainable in some participant populations. Furthermore, explicit reports only reveal when information has reached consciousness and cannot comment on when memories were accessed during processing, regardless of whether the information is subsequently accessed in a conscious manner. Eye movement monitoring (eye tracking) provides a tool by which memory can be probed without asking participants to comment on the contents of their memories, and access of such memories can be revealed on-line 2,3. Video-based eye trackers (either head-mounted or remote) use a system of cameras and infrared markers to examine the pupil and corneal reflection in each eye as the participant views a display monitor. For head-mounted eye trackers, infrared markers are also used to determine head position to allow for head movement and more precise localization of eye position. Here, we demonstrate the use of a head-mounted eye tracking system to investigate memory performance in neurologically-intact and neurologically-impaired adults. Eye movement monitoring procedures begin with the placement of the eye tracker on the participant, and setup of the head and eye cameras. Calibration and validation procedures are conducted to ensure accuracy of eye position recording. Real-time recordings of X,Y-coordinate positions on the display monitor are then converted and used to describe periods of time in which the eye is static (i.e. fixations) versus in motion (i.e., saccades). Fixations and saccades are time-locked with respect to the onset/offset of a visual display or another external event (e.g. button press). Experimental manipulations are constructed to examine how and when patterns of fixations and saccades are altered through different types of prior experience. The influence of memory is revealed in the extent to which scanning patterns to new images differ from scanning patterns to images that have been previously studied 2, 4-5. Memory can also be interrogated for its specificity; for instance, eye movement patterns that differ between an identical and an altered version of a previously studied image reveal the storage of the altered detail in memory 2-3, 6-8. These indices of memory can be compared across participant populations, thereby providing a powerful tool by which to examine the organization of memory in healthy individuals, and the specific changes that occur to memory with neurological insult or decline 2-3, 8-10.

Eye movement monitoring (or eye tracking) reveals where in space the eyes linger, when and for how long. Here, we demonstrate how eye tracking can be used to investigate the integrity of memory in multiple participant populations, without requiring verbal, or otherwise explicit, reports.

Surveillance de la mémoire Eye Movement

Explicit (often verbal) reports are typically used to investigate memory (e.g. "Tell me what you remember about the person you saw at the bank ...

Recherche

Neurosciences

Coherence between Brain Cortical Function and Neurocognitive Performance during Changed Gravity Conditions

Previous studies of cognitive, mental and/or motor processes during short-, medium- and long-term weightlessness have only been descriptive in nature, and focused on psychological aspects. Until now, objective observation of neurophysiological parameters has not been carried out - undoubtedly because the technical and methodological means have not been available -, investigations into the neurophysiological effects of weightlessness are in their infancy (Schneider et al. 2008).
While imaging techniques such as positron emission tomography (PET) and magnetic resonance imaging (MRI) would be hardly applicable in space, the non-invasive near-infrared spectroscopy (NIRS) technique represents a method of mapping hemodynamic processes in the brain in real time that is both relatively inexpensive and that can be employed even under extreme conditions. The combination with electroencephalography (EEG) opens up the possibility of following the electrocortical processes under changing gravity conditions with a finer temporal resolution as well as with deeper localization, for instance with electrotomography (LORETA).
Previous studies showed an increase of beta frequency activity under normal gravity conditions and a decrease under weightlessness conditions during a parabolic flight (Schneider et al. 2008a+b). Tilt studies revealed different changes in brain function, which let suggest, that changes in parabolic flight might reflect emotional processes rather than hemodynamic changes. However, it is still unclear whether these are effects of changed gravity or hemodynamic changes within the brain. Combining EEG/LORETA and NIRS should for the first time make it possible to map the effect of weightlessness and reduced gravity on both hemodynamic and electrophysiological processes in the brain. Initially, this is to be done as part of a feasibility study during a parabolic flight. Afterwards, it is also planned to use both techniques during medium- and long-term space flight.
It can be assumed that the long-term redistribution of the blood volume and the associated increase in the supply of oxygen to the brain will lead to changes in the central nervous system that are also responsible for anaemic processes, and which can in turn reduce performance (De Santo et al. 2005), which means that they could be crucial for the success and safety of a mission (Genik et al. 2005, Ellis 2000).
Depending on these results, it will be necessary to develop and employ extensive countermeasures. Initial results for the MARS500 study suggest that, in addition to their significance in the context of the cardiovascular and locomotor systems, sport and physical activity can play a part in improving neurocognitive parameters. Before this can be fully established, however, it seems necessary to learn more about the influence of changing gravity conditions on neurophysiological processes and associated neurocognitive impairment.

The effect of weightlessness and hypergravity on both hemodynamic and electrophysiological processes in the brain is going to be followed during parabolic flight by EEG and NIRS techniques. 
A feasibility study of a more complex experiment, which is planned to carry out during medium- and long-term space flight.

Cohérence entre la fonction cérébrale corticale et la performance neurocognitifs dans des conditions de gravité Changé

Previous studies of cognitive, mental and/or motor processes during short-, medium- and long-term weightlessness have only been descriptive in nature, and ...

Rapid Determination of the Thermal Nociceptive Threshold in Diabetic Rats

Painful diabetic neuropathy (PDN) is characterized by hyperalgesia i.e., increased sensitivity to noxious stimulus, and allodynia i.e., hypersensitivity to normally innocuous stimuli1. Hyperalgesia and allodynia have been studied in many different rodent models of diabetes mellitus2. However, as stated by B&ouml;lcskei et al, determination of "pain" in animal models is challenging due to its subjective nature3. Moreover, the traditional methods used to determine behavioral responses to noxious thermal stimuli usually lack reproducibility and pharmacological sensitivity3. For instance, by using the hot-plate method of Ankier4, flinch, withdrawal and/or licking of either hind- and/or fore-paws is quantified as reflex latencies at constant high thermal stimuli (52-55 &deg;C). However, animals that are hyperalgesic to thermal stimulus do not reproducibly show differences in reflex latencies using those supra-threshold temperatures3,5. As the recently described method of B&ouml;lcskei et al.6, the procedures described here allows for the rapid, sensitive and reproducible determination of thermal nociceptive thresholds (TNTs) in mice and rats. The method uses slowly increasing thermal stimulus applied mostly to the skin of mouse/rat plantar surface. The method is particularly sensitive to study anti-nociception during hyperalgesic states such as PDN. The procedures described bellow are based on the ones published in detail by Alm&aacute;si et al 5 and B&ouml;lcskei et al 3. The procedures described here have been approved the Laboratory Animal Care and Use Committee (LACUC), Wright State University.

Here, we describe a rapid reliable and simple procedure to determine the lowest temperature at which rats or mice show nocifensive behavior, i.e. the thermal nociceptive threshold (TNT). This method applies a slowly increasing thermal stimulus allowing precise and reproducible estimation of TNTs with minimum, if any, stress to the animals.

Détermination rapide du seuil thermique nociceptive chez les rats diabétiques

Painful diabetic neuropathy (PDN) is characterized by hyperalgesia i.e., increased sensitivity to noxious stimulus, and allodynia i.e., hypersensitivity ...

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex behaviors such as food choice, predator, conspecific and mate recognition and other socially relevant cues. Olfactory receptor neurons (ORNs) are located in the dorsal part of the nasal cavity embedded in the olfactory epithelium. These bipolar neurons send an axon to the olfactory bulb (see Fig. 1, Reisert &amp; Zhao1, originally published in the Journal of General Physiology) and extend a single dendrite to the epithelial border from where cilia radiate into the mucus that covers the olfactory epithelium. The cilia contain the signal transduction machinery that ultimately leads to excitatory current influx through the ciliary transduction channels, a cyclic nucleotide-gated (CNG) channel and a Ca2+-activated Cl- channel (Fig. 1). The ensuing depolarization triggers action potential generation at the cell body2-4.
In this video we describe the use of the "suction pipette technique" to record odorant-induced responses from ORNs. This method was originally developed to record from rod photoreceptors5 and a variant of this method can be found at jove.com modified to record from mouse cone photoreceptors6. The suction pipette technique was later adapted to also record from ORNs7,8. Briefly, following dissociation of the olfactory epithelium and cell isolation, the entire cell body of an ORN is sucked into the tip of a recording pipette. The dendrite and the cilia remain exposed to the bath solution and thus accessible to solution changes to enable e.g. odorant or pharmacological blocker application. In this configuration, no access to the intracellular environment is gained (no whole-cell voltage clamp) and the intracellular voltage remains free to vary. This allows the simultaneous recording of the slow receptor current that originates at the cilia and fast action potentials fired by the cell body9. The difference in kinetics between these two signals allows them to be separated using different filter settings. This technique can be used on any wild type or knockout mouse or to record selectively from ORNs that also express GFP to label specific subsets of ORNs, e.g. expressing a given odorant receptor or ion channel.

Olfactory receptor neurons (ORNs) convert odor signals first into a receptor current that in turn triggers action potentials that are conveyed to second order neurons in the olfactory bulb. Here we describe the suction pipette technique to record simultaneously the odorant-induced receptor current and action potentials from mouse ORNs.

Odorant induites réponses enregistrées à partir de neurones récepteurs olfactifs en utilisant la technique de la pipette d&#39;aspiration

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid, palmitate, to cysteine residues of substrate proteins through a labile thioester bond [reviewed in1]. Palmitoylation of a substrate protein increases its hydrophobicity, and typically facilitates its trafficking toward cellular membranes. Recent studies have shown palmitoylation to be one of the most common lipid modifications in neurons1, 2, suggesting that palmitate turnover is an important mechanism by which these cells regulate the targeting and trafficking of proteins. The identification and detection of palmitoylated substrates can therefore better our understanding of protein trafficking in neurons.
Detection of protein palmitoylation in the past has been technically hindered due to the lack of a consensus sequence among substrate proteins, and the reliance on metabolic labeling of palmitoyl-proteins with 3H-palmitate, a time-consuming biochemical assay with low sensitivity. Development of the Acyl-Biotin Exchange (ABE) assay enables more rapid and high sensitivity detection of palmitoylated proteins2-4, and is optimal for measuring the dynamic turnover of palmitate on neuronal proteins. The ABE assay is comprised of three biochemical steps (Figure 1): 1) irreversible blockade of unmodified cysteine thiol groups using N-ethylmaliemide (NEM), 2) specific cleavage and unmasking of the palmitoylated cysteine's thiol group by hydroxylamine (HAM), and 3) selective labeling of the palmitoylated cysteine using a thiol-reactive biotinylation reagent, biotin-BMCC. Purification of the thiol-biotinylated proteins following the ABE steps has differed, depending on the overall goal of the experiment.
Here, we describe a method to purify a palmitoylated protein of interest in primary hippocampal neurons by an initial immunoprecipitation (IP) step using an antibody directed against the protein, followed by the ABE assay and western blotting to directly measure palmitoylation levels of that protein, which is termed the IP-ABE assay. Low-density cultures of embryonic rat hippocampal neurons have been widely used to study the localization, function, and trafficking of neuronal proteins, making them ideally suited for studying neuronal protein palmitoylation using the IP-ABE assay. The IP-ABE assay mainly requires standard IP and western blotting reagents, and is only limited by the availability of antibodies against the target substrate. This assay can easily be adapted for the purification and detection of transfected palmitoylated proteins in heterologous cell cultures, primary neuronal cultures derived from various brain tissues of both mouse and rat, and even primary brain tissue itself.

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

The reversible addition of palmitate to proteins is an important regulator of intracellular protein trafficking. This is of particular interest in neurons where many synaptic proteins are palmitoylated. We utilize a simple biochemical method to detect palmitoylated proteins in cultured neurons, which can be adapted for multiple cell types and tissues.

Détection de la palmitoylation des protéines dans les neurones de l&#39;hippocampe en culture par immunoprécipitation et Acyl-biotine Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

In this article the tools, techniques, and instruments appropriate for quantitative measurements of intracellular elemental content using the technique known as electron probe microanalysis (EPMA) are described. Intramitochondrial calcium is a particular focus because of the critical role that mitochondrial calcium overload plays in neurodegenerative diseases. The method is based on the analysis of X-rays generated in an electron microscope (EM) by interaction of an electron beam with the specimen. In order to maintain the native distribution of diffusible elements in electron microscopy specimens, EPMA requires &#34;cryofixation&#34; of tissue followed by the preparation of ultrathin cryosections. Rapid freezing of cultured cells or organotypic slice cultures is carried out by plunge freezing in liquid ethane or by slam freezing against a cold metal block, respectively. Cryosections nominally 80 nm thick are cut dry with a diamond knife at ca. -160 &#176;C, mounted on carbon/pioloform-coated copper grids, and cryotransferred into a cryo-EM using a specialized cryospecimen holder. After visual survey and location mapping at &#8804;-160 &#176;C and low electron dose, frozen-hydrated cryosections are freeze-dried at -100 &#176;C for ~30 min. Organelle-level images of dried cryosections are recorded, also at low dose, by means of a slow-scan CCD camera and subcellular regions of interest selected for analysis. X-rays emitted from ROIs by a stationary, focused, high-intensity electron probe are collected by an energy-dispersive X-ray (EDX) spectrometer, processed by associated electronics, and presented as an X-ray spectrum, that is, a plot of X-ray intensity vs. energy. Additional software facilitates: 1) identification of elemental components by their &#34;characteristic&#34; peak energies and fingerprint; and 2) quantitative analysis by extraction of peak areas/background. This paper concludes with two examples that illustrate typical EPMA applications, one in which mitochondrial calcium analysis provided critical insight into mechanisms of excitotoxic injury and another that revealed the basis of ischemia resistance.

This paper describes the application of cryoanalytical electron microscopy to the quantitative measurement of total calcium content and distribution at subcellular resolution in physiologically defined biological specimens.

Mesure du calcium total dans les neurones par sonde électronique X-ray microanalyse

In this article the tools, techniques, and instruments appropriate for quantitative measurements of intracellular elemental content using the technique ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis and enable new strategies for in vitro modeling or repairing the diseased brain. Identifying brain-resident non-neuronal cell types amenable to direct conversion into iNs might allow for launching such an approach in situ, i.e. within the damaged brain tissue. Here we describe a protocol developed in the attempt of identifying cells derived from the adult human brain that fulfill this premise. This protocol involves: (1) the culturing of human cells from the cerebral cortex obtained from adult human brain biopsies; (2) the in vitro expansion (approximately requiring 2-4 weeks) and characterization of the culture by immunocytochemistry and flow cytometry; (3) the enrichment by fluorescence-activated cell sorting (FACS) using anti-PDGF receptor-&#946; and anti-CD146 antibodies; (4) the retrovirus-mediated transduction with the neurogenic transcription factors sox2 and ascl1; (5) and finally the characterization of the resultant pericyte-derived induced neurons (PdiNs) by immunocytochemistry (14 days to 8 weeks following retroviral transduction). At this stage, iNs can be probed for their electrical properties by patch-clamp recording. This protocol provides a highly reproducible procedure for the in vitro lineage conversion of brain-resident pericytes into functional human iNs.

Targeting brain-resident cells for direct lineage-reprogramming offers new perspectives for brain repair. Here we describe a protocol of how to prepare cultures enriched for brain-resident pericytes from the adult human cerebral cortex and convert these into induced neurons by retrovirus-mediated expression of the transcription factors Sox2 and Ascl1.

Lineage reprogrammation de cellules pericyte dérivés du cerveau humain adulte en neurones induits

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Électrophysiologiques et Caractérisation morphologique des neurones Les circuits dans aiguë tranches cerveau en utilisant jumelés patch-clamp enregistrements

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.

Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.

Évaluation fonctionnelle et morphologique de membrane innervation par phrénique motoneurones

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers

Electrophysiological recordings of cells using the patch clamp technique have allowed for the identification of different neuronal types based on firing patterns. The inclusion of biocytin/neurobiotin in the recording electrode permits post-hoc recovery of morphological details, which are necessary to determine the dendritic arborization and the regions targeted by the axons of the recorded neurons. However, given the presence of morphologically similar neurons with distinct neurochemical identities and functions, immunohistochemical staining for cell-type-specific proteins is essential to definitively identify neurons. To maintain network connectivity, brain sections for physiological recordings are prepared at a thickness of 300 &#181;m or greater. However, this thickness often hinders immunohistological postprocessing due to issues with antibody penetration, necessitating the resectioning of the tissue. Resectioning of slices is a challenging art, often resulting in the loss of tissue and morphology of the cells from which electrophysiological data was obtained, rendering the data unusable. Since recovery of morphology would limit data loss and guide in the selection of neuronal markers, we have adopted a strategy of recovering cell morphology first, followed by secondary immunostaining. We introduce a practical approach to biocytin filling during physiological recordings and subsequent serial immunostaining for the recovery of morphology, followed by the restaining of sections to determine the neurochemical identity. We report that sections that were filled with biocytin, fixed with paraformaldehyde (PFA), stained, and coverslipped can be removed and restained with a second primary antibody days later. This restaining involves the removal of the coverslip, the washing of sections in a buffer solution, and the incubation of primary and secondary antibodies to reveal the neurochemical identity. The method is advantageous for eliminating data loss due to an inability to recover morphology and for narrowing down the neurochemical markers to be tested based on morphology.

This protocol presents a method for the morphological recovery of neurons patched during electrophysiological recordings using biocytin filling and subsequent immunohistochemical postprocessing. We show that thick biocytin-filled sections that were stained and coverslipped can be restained with a second primary antibody days&#160;or months later.

Immunocoloration des articles biocytine remplis et transformés pour neurochimiques Marqueurs

Electrophysiological recordings of cells using the patch clamp technique have allowed for the identification of different neuronal types based on firing ...