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NOTE: Toutes les procédures impliquant l&#39;utilisation d&#39;animaux sont réalisées conformément à la législation locale. Notre travail est approuvé par le Comité de santé du district Animal Welfare Sydney locale. Les procédures autorisées sont décrites dans la documentation de licence de projet et suivent des lignes directrices qui assurent le bien-être de l&#39;animal en tout temps. Veiller au respect de la législation sur l&#39;expérimentation animale du pays où le travail est effectué. 1. Protocole de préparation EM Fixative <ol><li> Pour 100 ml de fixateur, préparer paraformaldéhyde en ajoutant 2 g de poudre de paraformaldéhyde à 25 ml d&#39;eau distillée dans une fiole conique, la chaleur à 65 ° C, en remuant constamment avec un agitateur magnétique. NOTE: Glutaraldéhyde, le paraformaldéhyde et le tampon de cacodylate de sodium sont toutes les substances dangereuses et doivent toujours être manipulés dans hotte. </li><li> Chauffer à 65 ° C pendant 2 min puis laisser refroidir. Si nécessaire, ajouter la solution d&#39;hydroxyde de sodium dropwise en remuant pour effacer solution complètement. NOTE: l&#39;hydroxyde de sodium est dangereux, manipuler avec précaution. </li><li> Ajouter 10 ml de grade EM stocks glutaraldéhyde, 50 ml de tampon de cacodylate de sodium 0,2 M et 2 g de saccharose et remuer avec agitateur magnétique. Ajouter 2 ml de 1,0 M CaCl 2. </li><li> Ajuster à pH 7,4 avant de procéder à la solution jusqu&#39;à 100 ml avec de l&#39;eau distillée. Le fixateur final contient 2,5% de glutaraldéhyde, 2% de paraformaldehyde, 2 mmol CaCl 2, 2% de saccharose dans du tampon 0,1 M de cacodylate. Assurez-vous que l&#39;osmolalité totale est de 440 mOsmol / L. Utiliser dans les 24 heures de préparation. </li></ol> 2. Fixation de perfusion hépatique <ol><li> Tampon de perfusion chaud et fixatif à 35-37 ºC. La température correcte du tampon de exsanguination et fixateur aide à assurer l&#39;intégrité des tissus. </li><li> Anesthésier l&#39;animal avec une seule injection intraperitoneale de 50 mg / kg de kétamine et 5 mg / kg de xylazine. </li><li> Une fois que l&#39;animal est en coursanesthésie profonde, évaluée par le retrait des membres postérieurs et pincement de la queue, une incision est faite avec Y contondants terminé ciseaux dans l&#39;abdomen de l&#39;animal pour exposer le foie et la veine porte. NOTE: Assurez-vous que le matériel est propre pour éviter la contamination des échantillons avec des micro-organismes et les débris générale qui seront facilement visibles sur SEM. </li><li> Attachez deux sutures très lâches autour de la veine porte une proximale pour le foie, l&#39;autre plus distale pour le foie. </li><li> Cathétériser la veine porte avec une canule IV de taille appropriée (18 G pour les rats, 22 G pour les souris) sutures .Tighten pour garantir canule. </li><li> Commencer la perfusion avec une solution saline tamponnée au phosphate chauffé à 37 ° C, et sous une pression de 10 cm de H 2 0. Entre 5 et 20 ml de PBS sont habituellement exigés pour être exsangue le foie. REMARQUE: Ne pas permettre à des bulles d&#39;air d&#39;entrer dans le foie par les tubes reliés à la canule car ils induisent des artéfacts secondaires pour embolisation et de la pression; Dommages aux hépatocytes, sinusoids et fenestrations LSEC produit si la pression de perfusion est trop élevé. </li><li> Sectionner la veine cave abdominale et thoracique pour permettre au tampon pour sortir librement du foie. Ceci empêche des dommages haute-pression à LSECs. </li><li> Une fois que le foie est libre de sang, remplacer PBS avec EM fixateur et perfuser pendant environ 5 minutes, jusqu&#39;à ce que le foie est durci et très pâle. </li><li> Cesser la perfusion et de couper le foie fixe dans 1 - 2 mm 3 blocs à l&#39;aide d&#39;un scalpel. </li><li> Tissus post-correctif dans EM fixatif pour les 24 - 72 h à 4 ºC. NOTE: En général, underfixation provoque plus que des objets overfixation. </li><li> Changer fixateur après la période post-correctif à sodium 0,1 M tampon cacodylate pour le stockage à 4 ºC. NOTE: Les échantillons stockés de cette manière seront conservés pour une période de temps significative (jusqu&#39;à 12 mois), fixation secondaire mais en temps opportun et de l&#39;examen est recommandé pour de meilleurs résultats. </li></ol> 3. Aiguille Perfusion REMARQUE: fixation d&#39;aiguille est une variante de fixation qui implique la perfusion de fixateur injection directement dans le tissu de biopsie du foie. L&#39;objectif est de fixateur pour être rincée à travers les vaisseaux sanguins afin de les exposer toutes être exsangue et du bloc de tissu de fixateur. Des précautions doivent être prises pour maintenir la pression d&#39;injection faible pour éviter les blessures de pression 18,19. <ol><li> Retirer un petit morceau de foie de l&#39;animal ou de l&#39;objet et rincer dans une solution saline pour éliminer le sang et les débris. </li><li> Dessiner la solution saline normale dans la seringue munie d&#39;une aiguille de petit calibre (typiquement une seringue d&#39;insuline). </li><li> Injecter la solution saline très lentement dans le foie jusqu&#39;à ce que le sang est évacuée du tissu. Des injections multiples peuvent être nécessaires. </li><li> Dessinez le fixateur EM dans une autre seringue munie d&#39;une aiguille de petit calibre (typiquement une seringue d&#39;insuline). </li><li> Injecter le fixateur très lentement dans le foie jusqu&#39;à ce qu&#39;il devienne dur et de couleur beige. Injection multiples peut être nécessaire. </li><li> Couper le foie fixe dans 1 - 2 mm 3 blocs en utilisant un scalpel. Incuber dans EM fixatif pour les 24 - 72 h à 4 ° C. Laver 3 fois dans du tampon cacodylate de sodium 0,1 M avant le début de la fixation secondaire. </li></ol> 4. Préparation de la microscopie électronique à balayage <ol><li> Laver échantillon 3 fois dans du tampon cacodylate de sodium 0,1 M. Pour fixer les lipides, après fixer l&#39;échantillon dans 2% de tétroxyde d&#39;osmium dans un tampon cacodylate de sodium 0,1 M pendant 2 heures. NOTE: Complete lavage est très important que croix glutaraldéhyde et tétroxyde d&#39;osmium réagissent et génèrent des artefacts sur SEM. </li><li> Rincer les échantillons à des concentrations croissantes d&#39;éthanol, à commencer la déshydratation. Rincer d&#39;abord dans de l&#39;éthanol à 50% pendant 5 minutes; puis 3 fois pendant 5 min avec 70% d&#39;éthanol; rinçage trois fois pendant 5 min avec 90% d&#39;éthanol; rincer deux fois pendant 5 min dans 100% d&#39;éthanol; et enfin rincer deux fois pendant 10 minutes dans 100% d&#39;éthanol (tamis moléculaire). </li><li> Retirez tout l&#39;éthanol à partir des échantillons<html> et le remplacer par de l&#39;hexaméthyldisilazane (HMDS) en hotte et laisser reposer 10 min. Retirer HMDS à partir des échantillons de tissu et laisser évaporer. NOTE: HMDS est fortement hygroscopique froid donc permettre d&#39;atteindre RT avant de l&#39;utiliser pour l&#39;étape finale de déshydratation. </li><li> Eventuellement, monter immédiatement les échantillons ou les placer dans un dessiccateur jusqu&#39;au moment de monter pour la SEM. </li></ol> 5. Montage NOTE: montage correct de l&#39;échantillon sera de maximiser le nombre de sinusoïdes clairement délimitées disponibles pour l&#39;analyse sous SEM. <ol><li> Étiqueter la base des moignons métalliques SEM et appliquer du ruban double face conductrice carbone haut de la moignons. </li><li> Visualiser les échantillons en utilisant un microscope à dissection pour déterminer la surface avec les meilleurs pour les sinusoïdes SEM ultérieure. Placer cette surface vers le haut sur la surface du ruban de carbone du moignon. </li><li> spécimens de tenir fermement le talon, les échantillons sont maintenant prêts pour revêtement par pulvérisation. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 6. Revêtement NOTE: Le revêtement des spécimen avec une fine pellicule de métal conducteur (or ou de platine) dans un Pulvérisateur cathodique motifs de l&#39;échantillon et le protège des dommages causés par le faisceau d&#39;électrons. Si le revêtement est trop épais structures d&#39;intérêt peuvent être obscurcies. <ol><li> La place talons dans la chambre à vide de pulvérisation coucheuse automatique amende, le mode à la rotation et de revêtement par pulvérisation automatique fixés pour 45 sec. Utilisation revêtement de platine pour des détails plus fins, mais l&#39;or est également approprié. </li><li> Appliquez une fine couche de peinture de carbone sur les surfaces extérieures des échantillons de foie montés, en prenant soin de ne pas revêtir les surfaces sinusoïdales. </li><li> Une fois que les échantillons sont revêtus avec du platine et de la peinture de carbone a séché ce qu&#39;ils soient prêts pour l&#39;observation sur le SEM. Les échantillons peuvent être stockés dans un dessiccateur. </li></ol> 7. Utilisation du microscope électronique à balayage <ol><li> Placer les échantillons dans un microscope électronique à balayage et retrouver le microscope à vide. &lt;/ Li&gt; <li> En utilisant des procédures d&#39;exploitation de microscope standard pour la visualisation des spécimens en commençant à un faible grossissement, en augmentant progressivement grossissement. </li><li> Vérifiez que le microscope est ajusté de façon appropriée pour travailler la distance, la taille du spot et l&#39;astigmatisme. </li><li> Vérifier l&#39;intégrité de fixation. Si le LSEC est surtout exempt de lacunes et contient fenestrations de mesure de 30 à 250 nm de diamètre ce indiquerait généralement que la préparation des échantillons a été couronnée de succès. </li><li> Si les sinusoïdes sont pleines de lacunes ou dépourvu de fenestrations la préparation de l&#39;échantillon n&#39;a pas été couronnée de succès ou il ya pathologie importante. Dans ce cas, couper l&#39;échantillon avec une lame de rasoir très fine, et les surfaces de coupe retraitées comme et analysés pour sinusoïdes fixes succès. </li><li> À environ 15.000-20.000 grossissement sélectionner surfaces LSEC plats qui sont exempts de débris avec une bonne fixation et où les fenestrations sont clairement visibles (typiquement contenant au moins 10 fenestrations). </li><li> Enregistrer des images d&#39;au moins 10 sinusoïdes par le foie, à partir de différentes zones des blocs, en utilisant au moins deux blocs par le foie. Échantillonnage 10 micrographies à 15.000 - 20.000 grossissement par animal est généralement suffisante pour la quantification des fenestrations soit représentatif de l&#39;ensemble du foie. </li></ol> 8. Analyse REMARQUE: Le logiciel ImageJ qui peut être téléchargé gratuitement à partir du NIH est utilisé pour quantifier le diamètre de la fenestration et la fréquence ( <a href="http://imagej.nih.gov/ij">www.imagej.nih.gov/ij</a> ). <ol><li> Ouvrir une image J et définir l&#39;échelle en utilisant la barre d&#39;échelle intégrée dans l&#39;image (Capture d&#39;écran 1). </li><li> Utilisation de l&#39;outil de polygone dans ImageJ, trace autour de l&#39;ensemble de la surface plane de la LSEC y compris les zones fenêtrées et défenestré. Ne vous contentez pas de retracer les plaques de tamis comme cela faussement gonfler porosité. Éliminer les gros morceaux de débris qui se trouvent sur la surface des cellules qui peuvent être obscurifenestrations Ng. </li><li> Pour mesurer le diamètre de la fenestration, tracer une ligne à travers le plus grand diamètre de chaque fenestration en sélectionnant l&#39;outil de ligne, et appuyez sur &quot;m&quot; pour mesurer la ligne, et &quot;d&quot; (tirer) pour dessiner la ligne de façon permanente sur l&#39;image. Cette ligne est définie comme le diamètre de la fenestration. La longueur de la ligne sera désormais disponible dans la zone de résultats de ImageJ (Capture d&#39;écran 2). </li><li> Mesurer toutes les lacunes qui sont plus grands trous dans le cytoplasme LSEC plus de 250 nm, ainsi que des fenestrations. Les lacunes sont souvent objets reflétant une mauvaise perfusion ou la fixation, cependant lacunes peuvent également survenir à la suite de la maladie et la toxicité. Les données pour les lacunes sera exclu du calcul des paramètres de fenêtrage plus tard dans l&#39;analyse. </li><li> La zone des lacunes qui ne sont pas circulaire devrait être calculée en traçant autour des lacunes et calculer leur surface sur ImageJ. </li><li> Collez les données de la boîte de résultats dans ImageJ dans un tableur Excel pour furtheanalyse de r. </li></ol> 9. Calculs <ol><li> Fenestration diamètre moyen = moyenne de tous les diamètres de fenêtrage (non compris les lacunes, dont les lacunes sont ≥ 250 nm). </li><li> Zone de fenêtrage = πr 2 où r, le rayon, est calculée à partir de l&#39;individu fenestrations diamètre (r = d / 2), à l&#39;exclusion des lacunes. </li><li> Porosité (%) = (Σ (πr 2) / superficie totale analysée - Σ (zone de lacunes =)) (pm 2)) x 100. </li><li> Fenestration fréquence = nombre total de fenestrations / (superficie totale analysée-Σ (domaine de lacunes) (pm 2). </li></ol> 10. Présentation des données Fenestration NOTE: Chaque fois que possible, des publications, y compris la quantification des données de fenêtrage doivent inclure les informations suivantes <ol><li> Fenestration diamètre, avec une déclaration confirmant ce diamètres limites où utilisé pour définir fenestrations (typiquemententre 50 à 250 nm), la fréquence Fenestration (nombre / um 2) et la porosité (%). </li><li> Une déclaration confirmant que des lacunes ont été inclus dans l&#39;analyse, la distribution de fréquence graphique de diamètre de la fenestration et le nombre de foies, des blocs, des images et des fenestrations devrait être inclus dans l&#39;analyse. </li></ol>

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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenic-stimulated+liver+sinusoidal+capillarization+in+mice+requires+NADPH+oxidase&#8211;generated+superoxide.">Arsenic-stimulated liver sinusoidal capillarization in mice requires NADPH oxidase&#8211;generated superoxide.</a> J Clin Invest. 118 (12), 3980-3989 (2008).</li><li>Barber&#225;-Guillem, E., Arrue, J. M., Ballesteros, J., Vidal-Vanaclocha, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+in+endothelial+cells+of+developing+rat+liver+in+the+transition+from+fetal+to+postnatal+life.">Structural changes in endothelial cells of developing rat liver in the transition from fetal to postnatal life.</a> JJ Ultrastruct Mol Struct Res. 97 (1-3), 197-206 (1986).</li><li>Jamieson, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caloric+restriction+reduces+age-related+pseudocapillarization+of+the+hepatic+sinusoid.">Caloric restriction reduces age-related pseudocapillarization of the hepatic sinusoid.</a> Exp Gerontol. 42 (4), 374-378 (2007).</li><li>Cogger, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperlipidemia+and+surfactants:+the+liver+sieve+is+a+link.">Hyperlipidemia and surfactants: the liver sieve is a link.</a> Atherosclerosis. 189 (2), 273-281 (2006).</li><li>Cogger, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+oxidative+stress+on+the+liver+sieve.">The effects of oxidative stress on the liver sieve.</a> J Hepatol. 41 (3), 370-376 (2004).</li><li>Cogger, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structured+illumination+microscopy+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrations.">Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations.</a> J Struct Biol. 171 (3), 382-388 (2010).</li><li>Braet, F., de Zanger, R., Seynaeve, C., Baekeland, M., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+atomic+force+microscopy+study+on+living+skin+fibroblasts+and+liver+endothelial+cells.">A comparative atomic force microscopy study on living skin fibroblasts and liver endothelial cells.</a> J Electron Microsc. 50 (4), 283-290 (2001).</li><li>Monkemoller, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+fenestrations+in+liver+sinusoidal+endothelial+cells+by+optical+localization+microscopy.">Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy.</a> Phys Chem Chem Phys. 16 (24), 12576-12581 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La capacité de mesurer de façon précise et reproductible l&#39;état du foie endothélium sinusoïdal est une étape importante dans la compréhension de la biologie de ces cellules hautement spécialisées. De nouvelles techniques telles que la microscopie d&#39;éclairage structuré 32, microscopie à force atomique 33 et d-STORM (directe stochastique optique reconstrucion Microscopy) 34 seront de communiquer des informations importantes concernant la morphologie de ces cellules...

Les cellules endotheliales sinusoïdales hépatiques (LSECs) sont très différenciées des cellules endothéliales qui tapissent la paroi de la sinusoïde hépatique. LSECs sont perforées avec des fenestrations qui sont non diaphragmée, transcellulaire des pores de 50 à 250 nm de diamètre. Jusqu&#39;à 20% de la surface de LSECs est couverte par fenestrations, qui sont habituellement en groupes de quelques dizaines à quelques centaines appelés plateaux perforés 1 à 3 (figure 1). Fenestrations permettent le transfert de plasma et nanosubstrates entre le sang et les hépatocytes, la création d&#39;un système d&#39;ultrafiltration est performant. Fenestrations sont des structures dynamiques - à la fois leur taille et / ou le numéro peuvent être modifiées en réponse à différents états physiologiques, les médicaments et la maladie. Par exemple, fenestrations sont plus grandes dans le jeun que dans l&#39;état nourri 4; 2-di-iodoamphétamine augmente numéro de fenestration; 5,6 et une réduction de la taille et du nombre de fenestrations par cellule se produit au cours du vieillissement et de nombreux états pathologiques 7-13 </sup&gt;. La mesure précise de la taille et du nombre de fenestrations est important pour comprendre comment LSEC morphologie est influencé par diverses maladies, toxiques, et les états physiologiques; leur impact sur la fonction hépatique; et pour le développement de fenestration modulation des interventions thérapeutiques 1. L&#39;étude de fenestrations est difficile. Le diamètre de fenestrations est inférieure à la résolution de la microscopie optique classique, de sorte que précédemment microscopie électronique d&#39;observation en utilisant à la fois LSECs de tissus du foie ou de culture a été possible intactes. Le microscope électronique à balayage (MEB) a le plus souvent été utilisée pour étudier la taille de fenêtrage, de la fréquence et de la porosité (pourcentage de membrane LSEC qui est perforée par des fenestrations) car SEM permet l&#39;observation de vastes zones de la surface de l&#39;endothélium et la mesure des milliers, sinon des dizaines de milliers de fenestrations. Malgré son utilité, les résultats qui sont rapportés de SEM-basés pour des étudesLSEC paramètres tels que la taille de la fenestration, le nombre, la fréquence et la porosité varient largement dans la littérature (tableau 1). Fenestrations et des plaques de tamis sont des structures fragiles de ce contrat, se brisent, se dilatent ou se unissent pendant la préparation de l&#39;échantillon, le traitement ainsi minutieuse est nécessaire pour préserver leur intégrité. La pression de perfusion élevée 14; osmolarité incorrecte du fixateur et tampons 15; une mauvaise fixation ou la fixation du temps; et la vitesse de post-fixation déshydratation et séchage sont tous les domaines de la transformation des SEM qui peuvent produire des artefacts qui interfèrent avec la préservation de l&#39;ultrastructure (Figure 2). La perte de fenestrations (&#39;defenestration&#39;) et fenestration rétrécissement peut se produire à la suite d&#39;une mauvaise fixation, ce qui entraîne diamètre réduit de fenêtrage et la porosité de la cellule. Méthodes pour améliorer la conservation des spécimens pour analyse SEM ont été décrits précédemment 15-17 et seront discutésici avec des conseils supplémentaires sur la façon d&#39;améliorer la conservation de l&#39;échantillon. Les principaux objectifs de la préservation de l&#39;échantillon sont pour enlever le sang des sinusoïdes de telle sorte que la surface de la LSEC peut être visualisé et pour éviter d&#39;endommager LSEC soit de haute pression ou de la fixation retardée. Toute perfusion du foie de fixateur via la veine porte est la méthode préférée pour la fixation du foie. Comme décrit en détail ailleurs 16,18 perfusion doit être effectué à basse pression (par exemple 10 cm de H 2 0) pour éviter les artefacts et les dommages liés à la pression de perfusion à l&#39;LSEC, manifestent généralement que de grandes lacunes au sein de la membrane cellulaire. Toutefois, la fixation raisonnable peut souvent être obtenue en utilisant l&#39;aiguille de perfusion biopsies du foie provenant d&#39;humains et d&#39;animaux, comme décrit en détail par ailleurs 19. Cette technique consiste à injecter directement fixateur dans le tissu jusqu&#39;à ce que le sang est évacuée de l&#39;échantillon et le tissu est ferme et fixe. Fixation d&#39;échantillons pour la microscopie électronique doit être perfOrmed aussi rapidement que possible après l&#39;arrêt de la circulation sanguine pour éviter les changements ultrastructuraux survenant à la suite des foies des processus d&#39;autolyse extrêmement rapides. Nous présentons également une méthode d&#39;analyse d&#39;image qui réduit au minimum l&#39;inclusion d&#39;artefacts, et normalise la mesure de fenestrations. Variation dans la sélection des sinusoïdes pour microscopie, analyse d&#39;images d&#39;objets, et la mesure de la surface de la cellule pour la porosité et la fenestration fréquence ont conduit à des écarts importants dans les résultats publiés. Une approche normalisée pour l&#39;évaluation et la mesure des fenestrations et les exigences minimales pour la présentation des données ne sont pas clairement abordée dans la littérature précédemment 4,10,20-31.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="658">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Name of material</td>
			<td style="width:100px;">Company</td>
			<td style="width:93px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:311px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:155px;">EM grade Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:100px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:93px;">C001</td>
			<td style="width:311px;">Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:155px;">Paraformaldehyde powder</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td style="width:311px;">Always prepare Paraformaldehyde fresh</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:155px;">Sodium Cacodylate powder</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">C0250</td>
			<td style="width:311px;">Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:155px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">C1016</td>
			<td style="width:311px;">Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:155px;">Osmium tretroxide</td>
			<td style="width:100px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:93px;">C011</td>
			<td style="width:311px;">Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:155px;">Ethanol- Absolute</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>459836&#160;</td>
			<td style="width:311px;">100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Other grades of Ethanol</td>
			<td style="width:100px;">Labtech</td>
			<td style="width:93px;">EL5</td>
			<td style="width:311px;">Prepare graded Ethanols with dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:155px;">Hexamethyldisilazane</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>52619&#160;</td>
			<td style="width:311px;">Allow to reach room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:155px;">Cannulas</td>
			<td style="width:100px;">Terumo</td>
			<td style="width:93px;">TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C</td>
			<td style="width:311px;">18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:155px;">Conductive Carbon tape</td>
			<td style="width:100px;">ProSciTech</td>
			<td>IA0201</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:155px;">Carbon Paint</td>
			<td style="width:100px;">ProSciTech</td>
			<td>I003</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:155px;">Ketamine</td>
			<td style="width:100px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:311px;">Must be optained under licence</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:155px;">Xylazine</td>
			<td style="width:100px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:311px;">Must be obtained under licence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:155px;">Molecular Sieve</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">208647</td>
			<td style="width:311px;">Removes water from the 100 % Ethanol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a standardized method for the analysis of liver sinusoidal endothelial cells and their fenestrations by scanning electron microscopy

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures - both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.

La visualisation initiale à faible grossissement par microscopie électronique à balayage révèle une surface plane de l&#39;échantillon de foie avec une zone exposée assez grand pour observer de nombreux grands vaisseaux du foie et des sinusoïdes (figure 1A). Assurer le placement de bloc de foie correcte sur le talon de montage est essentiel pour obtenir des images claires des sinusoïdes et la capsule de Glisson du foie devraient être évités pour cette raison (figure 1B). L&#...

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A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.

Une méthode standardisée pour l&#39;analyse des cellules endothéliales et sinusoïdale du foie Leurs fenestrations par microscopie électronique à balayage

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

a-standardized-method-for-analysis-liver-sinusoidal-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

14.2K vues.  University of Sydney and Concord Hospital. The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.

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In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo suivi 4-Dimensional de hématopoïétiques cellules souches et progénitrices adultes dans la voûte du crâne de souris de moelle osseuse

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Recherche

Biologie

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolement des cellules endothéliales murines Valve

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix biology, there are still major gaps related to how the matrix is formed, how physiological and pathological remodeling differ, and most importantly how matrix dynamics might be manipulated to promote healing and inhibit fibrosis. There is currently no treatment option for controlling, preventing, or reversing cardiac fibrosis. Part of the reason is likely the sheer complexity of cardiac scar formation, such as occurs after myocardial infarction to immediately replace dead or dying cardiomyocytes. The extracellular matrix itself participates in remodeling by activating resident cells and also by helping to guide infiltrating cells to the defunct lesion. The matrix is also a storage locker of sorts for matricellular proteins that are crucial to normal matrix turnover, as well as fibrotic signaling. The matrix has additionally been demonstrated to play an electromechanical role in cardiac tissue. Most techniques for assessing fibrosis are not qualitative in nature, but rather provide quantitative results that are useful for comparing two groups but that do not provide information related to the underlying matrix structure. Highlighted here is a technique for visualizing cardiac matrix ultrastructure. Scanning electron microscopy of decellularized heart tissue reveals striking differences in structure that might otherwise be missed using traditional quantitative research methods.

Shown here is a method for visualizing extracellular matrix ultrastructure in decellularized cardiac tissues.

Microscopie électronique à balayage du tissu macéré pour visualiser la matrice extracellulaire

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we describe a technique for studying the supramolecular organization of photosynthetic (thylakoid) membranes within leaf samples. This is achieved by high-pressure freezing of leaf tissues, freeze-fracturing, double-layer coating and finally cryo-SEM imaging. Use of the double-layer coating method allows acquiring high magnification (&#62;100,000X) images with minimal beam damage to the frozen-hydrated samples as well as minimal charging effects. Using the described procedures we investigated the alterations in supramolecular distribution of photosystem and light-harvesting antenna protein complexes that take place during dehydration of the resurrection plant Craterostigma pumilum, in situ.

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

L&#39;étude de l&#39;Organisation supramoléculaire de photosynthétiques Membranes dans les tissus foliaires Gel fracturés par Cryo-microscopie électronique à balayage

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Microscopie électronique à balayage (MEB) Protocoles pour Problematic plantes, Oomycètes et échantillons Fungal

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to cells, tissues, organelles, and even whole organisms. This protocol focuses on two chemical drying methods, hexamethyldisilazane (HMDS) and t-butyl alcohol (TBA), and their application to imaging of both prokaryotic and eukaryotic organisms using SEM. In this article, we describe how to fix, wash, dehydrate, dry, mount, sputter coat, and image three types of organisms: cyanobacteria (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp., and an unknown sp.), two euglenoids from the genus Monomorphina (M. aenigmatica and M. pseudopyrum), and the fruit fly (Drosophila melanogaster). The purpose of this protocol is to describe a fast, inexpensive, and simple method to obtain detailed information about the structure, size, and surface characteristics of specimens that can be broadly applied to a large range of organisms for morphological assessment. Successful completion of this protocol will allow others to use SEM to visualize samples by applying these techniques to their system.

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

SEM analysis is an effective method to aid in species identification or phenotypic discrimination. This protocol describes the methods for examining specific morphological details of three representative types of organisms and would be broadly applicable to examining features of many organismal and tissue types.

Préparation des organismes procaryotes et eucaryotes à l’aide de séchage chimique pour l’analyse morphologique en microscopie électronique (MEB)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Préparation de l’échantillon biologique par congélation à haute pression, amélioration du contraste assistée par micro-ondes et minime résine enrobage pour l’imagerie de Volume

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise subcellular localization of proteins is thus important for answering many biological questions. The quest for a robust label to identify protein localization combined with adequate cellular preservation and staining has been historically challenging. Recent advances in electron microscopy (EM) imaging have led to the development of many methods and strategies to increase cellular preservation and label target proteins. A relatively new peroxidase-based genetic tag, APEX2, is a promising leader in cloneable EM-active tags. Sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) has also advanced in recent years with the advent of cryofixation by high pressure freezing (HPF) and low-temperature dehydration and staining via freeze substitution (FS). HPF and FS provide excellent preservation of cellular ultrastructure for TEM imaging, second only to direct cryo-imaging of vitreous samples. Here we present a protocol for the cryoAPEX method, which combines the use of the APEX2 tag with HPF and FS. In this protocol, a protein of interest is tagged with APEX2, followed by chemical fixation and the peroxidase reaction. In place of traditional staining and alcohol dehydration at room temperature, the sample is cryofixed and undergoes dehydration and staining at low temperature via FS. Using cryoAPEX, not only can a protein of interest be identified within subcellular compartments, but also additional information can be resolved with respect to its topology within a structurally preserved membrane. We show that this method can provide high enough resolution to decipher protein distribution patterns within an organelle lumen, and to distinguish the compartmentalization of a protein within one organelle in close proximity to other unlabeled organelles. Further, cryoAPEX is procedurally straightforward and amenable to cells grown in tissue culture. It is no more technically challenging than typical cryofixation and freeze substitution methods. CryoAPEX is widely applicable for TEM analysis of any membrane protein that can be genetically tagged.

This protocol describes the cryoAPEX method, in which an APEX2-tagged membrane protein can be localized by transmission electron microscopy within optimally-preserved cell ultrastructure.

Méthode CryoAPEX pour l’analyse de la microscopie électronique de la localisation des protéines membranaires dans les cellules ultrastructuralement conservées

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission Electron Microscopy (TEM) provided insight into cell ultrastructure, but in the recent decade, the development of modern Scanning Electron Microscopes (SEM) has changed the way of looking inside the cells. Even though the resolution of TEM is superior when protein-level structural details are needed, SEM-resolution is sufficient for the majority of the organelle-level cell biology-related questions. The advancement in technology enabled automatic volume acquisition solutions such as Serial block-face imaging (SBF-SEM) and Focused ion beam SEM (FIB-SEM). Nevertheless, to this day, these methods remain inefficient when the identification and navigation to areas of interest are crucial. Without the means for precise localization of target areas before imaging, operators need to acquire much more data than they need (in SBF-SEM), or, even worse, prepare many grids and image them all (in TEM). We propose the strategy of "lateral screening" using Array Tomography in SEM, which facilitates the localization of areas of interest, followed by automated imaging of the relevant fraction of the total sample volume. Array tomography samples are conserved during imaging, and they can be arranged into section libraries ready for repeated imaging. Several examples are shown in which lateral screening enables us to analyze structural details that are incredibly challenging to access with any other method.

We describe the preparation of ribbons of serial sections and their collection on large transfer support for use as Array Tomography samples, along with automated imaging procedures in a scanning electron microscope. The protocol allows screening, retrieval, and targeted imaging of local, rare events, and the acquisition of large data volumes.

Flux de travail de tomographie en réseau pour l’acquisition ciblée d’informations de volume à l’aide de la microscopie électronique à balayage

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, offering an unprecedented three-dimensional view of tissue microanatomy. While SBF-SEM has seen an exponential increase in use in recent years, technical aspects such as proper tissue preparation and imaging parameters are paramount for the success of this imaging modality. This imaging system benefits from the automated nature of the device, allowing one to leave the microscope unattended during the imaging process, with the automated collection of hundreds of images possible in a single day. However, without appropriate tissue preparation cellular ultrastructure can be altered in such a way that incorrect or misleading conclusions might be drawn. Additionally, images are generated by scanning the block-face of a resin-embedded biological sample and this often presents challenges and considerations that must be addressed. The accumulation of electrons within the block during imaging, known as "tissue charging," can lead to a loss of contrast and an inability to appreciate cellular structure. Moreover, while increasing electron beam intensity/voltage or decreasing beam-scanning speed can increase image resolution, this can also have the unfortunate side effect of damaging the resin block and distorting subsequent images in the imaging series. Here we present a routine protocol for the preparation of biological tissue samples that preserves cellular ultrastructure and diminishes tissue charging. We also provide imaging considerations for the rapid acquisition of high-quality serial-images with minimal damage to the tissue block.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

This protocol outlines a routine method for using serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM), a powerful 3D imaging technique. Successful application of SBF-SEM hinges on proper fixation and tissue staining techniques, as well as careful consideration of imaging settings. This protocol contains practical considerations for the entirety of this process.

Microscopie électronique à balayage par blocs série (SBF-SEM) d’échantillons de tissus biologiques

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...