This work was supported by EU FP7-ITN Marie-Curie Network program RADDEL. MB and KAJ would like to acknowledge Joe Varguese and Rui Serra Maia for their help and suggestions along the optimization of the Kupffer cell isolation.

Toutes les expériences sur les animaux ont été exécutés en conformité avec toutes les directives, les règlements et les organismes de réglementation. Le protocole en démonstration a été réalisée sous la direction et l&#39;approbation de la réglementation de bureau au Royaume-Uni Accueil 1. Perfusion et Cell Collection (Figure 1) <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig1.jpg" /> Figure 1:. Foie Perfusion Après l&#39;anesthésie de la souris, le tube digestif est déplacé latéralement vers la gauche de l&#39;abdomen afin de rendre la veine porte (PV) accessible. Le PV est pourvue d&#39;une canule en utilisant une faible vitesse d&#39;écoulement (3.1 ml / min) de la solution d&#39;EGTA / HBSS et la Veina cave inférieure (VCI) est rompue immédiatement pour éviter toute surpression à l&#39;intérieur du foie. Au sein de la première minute de la perfusion, le débit est progressivement augmentée à 7 ml / min. La solution la collagénase est ensuite perfusé à 10 ml / min jusqu&#39;à ce que sa digestion complète est obtenue. <ol><li> Prepare fraîchement tous les réactifs décrits dans la table des matières. </li><li> Réchauffez la EGTA (Ethylene Glycol Tetra-acétique) / HBSS (solution saline équilibrée de Hank) Solution (50 ml par souris) et la solution la collagénase (100 ml par souris) pendant 30 min à 40 ° C. </li><li> Rincer le tube flexible de la pompe d&#39;abord avec 70% d&#39;éthanol. Verser 40 ml d&#39;EGTA / HBSS Solution dans un tube de centrifugeuse immergé dans le bain d&#39;eau et rincer le tube flexible de la pompe avec / HBSS Solution EGTA préchauffé. </li><li> Effectuer anesthésie terminale en utilisant un barbiturique à produire de manière fiable l&#39;inconscience avant la dépression respiratoire et la mort. Injecter phénobarbital à 1 mg / kg, ip dans une souris CD1 femelle ou mâle (35-45 g). Confirmez l&#39;anesthésie par pincement orteil. </li><li> Raser les poils abdominaux et stériliser la surface abdominale en utilisant une solution d&#39;éthanol à 70%. </li><li> Couper à travers la cavité abdominale et exposer la veine porte et la veine cave inférieure en déplaçant latéralement l&#39;intestin à la gauche de l&#39;abdomen. </li><li> Étoilet la pompe à une vitesse de 1-3 ml / min avec la solution EGTA / HBSS et cathétériser la veine porte en utilisant une aiguille 23 g de papillon (ailes coupées). Fixer la section de la veine porte canule avec l&#39;aiguille de 23 G et puis retournez les forceps serrefine à la surface de l&#39;abdomen de la souris ouvert. Le foie devrait rapidement pâle dans le 30 premières secondes de la perfusion EGTA / HBSS Solution. </li><li> Inciser rapidement la partie inférieure de la veine cave inférieure pour éviter la construction de surpression dans le foie, et ensuite augmenter le débit progressivement à 7 ml / min, au cours de la première minute de la perfusion. L&#39;animal meurt en raison de saignements secondaire à la veine cave ponction veineuse. </li><li> Lorsque moins de 5 ml de EGTA / HBSS Solution restante dans le tube de la centrifugeuse, le remplir avec Solution collagénase (40-50 ml). Augmenter le débit progressivement à 10 ml / min, 30 sec. </li><li> Faire la houle du foie en appliquant une pression à la veine cave inférieure, en utilisant des pinces, pour les 5-10 secondes d&#39;intervalle. This peut être fait périodiquement (5-10 fois au cours de la digestion). Cette étape permettra d&#39;améliorer la dissociation des cellules du foie et de réduire le temps de perfusion de collagénase. </li><li> Lorsque moins de 10 ml de solution de collagénase reste dans le tube de centrifugation, verser 40 à 50 ml de solution de collagénase préchauffé dans le tube de centrifugeuse. </li><li> Après 10-15 minutes de la perfusion et environ 70-80 ml de collagénase Solution perfusés, appliquer une petite pression sur la surface du foie avec une pince. Une copie de la pression indique que les cellules du foie sont dissociés. </li><li> Retirer le foie de la cavité abdominale d&#39;une seule pièce et le placer dans un tube de centrifugeuse contenant 20 à 30 ml de cellules de Kupffer Isolation moyenne. Gardez les cellules du foie sur la glace ou à 4 ° C pendant une période maximale de 3 heures pour éviter d&#39;affecter la viabilité des cellules du foie. </li><li> Répétez la procédure de perfusion sur plusieurs animaux en cas de besoin, tout en gardant le foie perfusé sur la glace. Piscine de une à trois foies pour la purification et de procéder à l&#39;étape 3. </li></ol> 2. Préparation du gradient de densité de centrifugation (figure 2) <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig2.jpg" /> Figure 2:. Préparation du gradient de densité Toutes les procédures sont effectuées dans des conditions stériles. Le protocole SIP est préparée en mélangeant 15,3 ml de solution de particules de silice revêtu avec 1,7 ml de 10 x PBS. A 5 ml de SIP sont mélangés avec 15 ml de PBS pour faire SIP solution 20 ml de 25%. 10 ml de SIP sont mélangés avec 10 ml de PBS pour faire une solution de 20 ml de SIP à 50%. Un tube de centrifugation contenant la solution à 50% de SIP (20 ml) est inclinée et la solution SIP à 25% (20 ml) est lentement ajouté en utilisant une pipette sérologique de 25 ml. <ol><li> Suivez les étapes suivantes (section 2., 3. et 5.) dans des conditions stériles et garder les cellules sur la glace ou à 4 ° C. Préparer le SIP (solution de particules de silice revêtues isotonique) en mélangeant 15,3 ml de solution de particules de silice enrobée avec 1,7 ml de 10 x PBS. </li&gt; <li> Pour faire 20 ml de solution SIP 25%, mélanger 5 ml de SIP avec 15 ml de PBS. Pour 20 ml de solution de SIP à 50%, mélanger 10 ml de SIP avec 10 ml de PBS. </li><li> Remplir un tube à centrifuger de 20 ml de la solution de SIP à 50%. Incliner le tube de centrifugeuse à un angle proche de 90 ° et ajouter lentement la solution de SIP à 25% (20 ml) sur la paroi latérale du tube en utilisant une 25 ml pipette sérologique, sans toucher la surface de la couche de protocole SIP à 50%. Lors de l&#39;ajout de la solution SIP de 25%, réduire progressivement l&#39;angle du tube. Gardez le gradient de densité sur la glace jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 3. cellules de Kupffer Purification (Figure 3) <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig3.jpg" /> Figure 3:. Purification des cellules de Kupffer par gradient de densité centrifugation et l&#39;adhésion cellulaire Toutes les procédures sont effectuées dans des conditions stériles. (A) Après rupture de la capsule de Glisson la, les cellules du foie sont filtrés à travers un 100 um crépine. La suspension est centrifugée à 50 x g à jeter hépatocytes (pellets) et recueillir la fraction de cellules non parenchymateuses (surnageant). Cette étape est répétée trois fois. Les cellules non-parenchymales sont ajoutés au-dessus d&#39;un gradient discontinu isotonique et centrifugées à 800 xg pendant 15 min. Les cellules de Kupffer recueillies à partir du SIP coussin de 25% sont purifiés en outre par la sélection de l&#39;adhésion cellulaire. (B) Les cellules sont étalées dans une plaque à 24 puits et incubées à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 30 minutes. Les cellules non adhérentes sont lavées une fois avec 500 ul de HBSS. Les cellules de Kupffer afficher leur adhérente morphologie 4 heures après l&#39;étalement, lorsque -CNTs f peuvent être ajoutés aux cellules. La barre d&#39;échelle représente 25 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52989/52989fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <ol><li> Mettez un foie perfusé dans une boîte de Petri avec 15 ml de cellules de Kupffer Isolation moyenne. La rupture de la capsule de Glisson la (membrane du foie) en utilisant des ciseaux et libérer toutes les cellules du foie dans le milieu d&#39;isolement des cellules de Kupffer. Filtrer la solution à une cellule si tamis 100 um pour être recueilli dans un tube de centrifugation. Répétez la procédure de perfusion sur foies perfusés supplémentaires et mettre en commun les cellules dans le même tube de centrifugeuse (15 ml à partir d&#39;une souris, jusqu&#39;à 45 ml de trois souris). </li><li> Centrifuger la suspension cellulaire à 50 g pendant 2 min à 4 ° C. Les cellules parenchymateuses (hépatocytes) seront dans le culot et les cellules non-parenchymales (y compris les cellules de Kupffer) seront dans le surnageant. </li><li> Récupérer le surnageant dans un tube à centrifuger propre et centrifuger à 50 x g pendant 2 min chacun. Répétez cette étape trois fois de plus. </li><li> Centrifuger à 1350 xg pendant 15 min pour sédimenter les cellules non parenchymateuses. Jeter le surnageant et remettre le culot dans 10 ml de cellules de Kupffer Isolation moyenne. </li><li> Ajouter la solution de cellules non parenchymateuses du gradient isotonique discontinue 25/50% comme décrit dans 2.3. Centrifuge à 850 g pendant 15 min sans accélération ni pause. </li><li> Localiser la fraction des cellules de Kupffer enrichi trouble apparaissant à l&#39;intérieur de la fraction SIP à 25% près de l&#39;interface SIP 25/50% de (Figure 3). En utilisant une pipette 10 ml sérologique, aspirer environ 12 ml de la fraction enrichie en cellules de Kupffer. Transfert des cellules dans un tube de centrifugeuse contenant 35-40 ml de cellules de Kupffer Isolation moyenne. Mélanger doucement et centrifuger à 1350 g pendant 15 min à 4 ° C pour sédimenter les cellules. </li><li> Jeter les cellules surnageant et remettre en 5-10 ml de pré-chauffé cellules Kupffer milieu de culture. Compter les cellules (Hémocytomètre) et de mesurer la viabilité en utilisant une coloration au bleu trypan. </li><li> Plaque les cellules parenchymateuses non purifiés dans des plaques à 24 puits à une densité de 5 x 10 5 cellules / puits. Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2 (Figure 3). Après 30 min, retirez délicatement le milieu, laver avec préchauffé solution saline équilibrée de Hank (HBSS) une fois puis remplacezavec 500 pi de frais et préchauffé cellules Kupffer milieu de culture (par puits). </li><li> Donner des cellules de Kupffer pendant au moins 4 heures à 37 ° C et 5% de CO 2 avant le traitement avec des nanoparticules, à leur permettre d&#39;acquérir leur morphologie adhérente. </li></ol> 4. Caractérisation <ol><li> Kupffer cellules Pureté <ol><li> Préparer une solution fraîche PBS / BSA utilisé pour maintenir la viabilité des cellules de Kupffer. Laver les cellules une fois avec 500 ul de solution PBS / BSA. Retirer la solution de PBS / BSA et détacher les cellules de Kupffer dans 500 pi de solution fraîche PBS / BSA en utilisant grattant délicatement. Lorsque les cellules sont étalées dans des plaques à 24 puits, de raccourcir les extrémités des lames de raclage avec des ciseaux pour faire le détachement facile de procéder. Transfert cellules dans des tubes de cytométrie en flux. </li><li> Compter les cellules de Kupffer utilisant un hémocytomètre et centrifuger 1 x 10 5 cellules à 1350 x g. Remettre en suspension les cellules de Kupffer dans 30 ul de F4 / 80 anticorps (sans solvant). Bien mélanger et incuber à température ambiante pendant 30 min. Gardez les cellules non colorées (non incubées avec l&#39;anticorps) sur de la glace. </li><li> Ajouter 2 ml de solution de PBS / BSA dans les cellules colorées, centrifuger à 1350 g pendant 5 minutes et jeter le surnageant résultant. Remettre en suspension les cellules colorées dans 200 ul de PBS / BSA. </li><li> Pour cytométrie de flux, portail 10.000 pas souillé cellules de Kupffer selon leur taille (de diffusion vers l&#39;avant) et la granularité (diffusion latérale). Analyser la fluorescence des cellules gated dans FL-1 canal. </li><li> Répétez la procédure pour les cellules de Kupffer colorées en gardant les mêmes paramètres utilisés pour la cytométrie de flux des cellules de Kupffer non colorées. Sélectionner et quantifier la fluorescence des cellules colorées pour évaluer la pureté des cellules de Kupffer. </li></ol></li><li> Kupffer cellules phagocytaires activité <ol><li> Remplacez le support avec 0,5% (v / v) des billes fluorescentes dans Kupffer milieu de culture cellulaire et incuber pendant 4 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Afin d&#39;éliminer les billes non intériorisées, les cellules de Kupffer de centrifugeuses à 1350 xg, diSCard les cellules surnageant et remettre en suspension dans 500 pi de PBS / BSA Solution. Répétez cette étape deux fois plus. </li><li> Grattez les cellules de Kupffer dans 500 pi de cellules de solutions et de transfert PBS / BSA dans un tube de cytométrie en flux. </li><li> Centrifugeuse cellules Kupffer à 1350 xg, jeter les cellules surnageant et remettre dans 200 pi de PBS / BSA Solution. </li><li> Pour cytométrie de flux, portail 10.000 pas souillé cellules de Kupffer selon leur taille (de diffusion vers l&#39;avant) et la granularité (diffusion latérale). Analyser la fluorescence des cellules gated dans FL-2 canaux. </li></ol></li></ol> 5. Incubation chimiquement fonctionnalisés nanotubes de carbone (f -CNTs) <ol><li> Préparer une dispersion de -CNTs f (1 mg / ml) dans de l&#39;eau par traitement aux ultrasons pendant 15 minutes avant utilisation. -CNTs F sont préparés en interne 22. </li><li> Préparer 2x NTC f- concentrés dispersion dans Kupffer milieu de culture cellulaire. NTC f- Soniquer dispersées dans le milieu pour2 min avant de passer à l&#39;étape 5.3). </li><li> Pour chaque puits, 250 pi de remplacer les anciens médias avec 250 ul de 2x -CNTs f dispersion. Puits non traités (250 pi de milieu conditionné + 250 pl de cellules fraîches Kupffer milieu de culture) et des puits traités avec 10% de DMSO sont utilisées comme contrôle négatif et positif, respectivement. </li><li> Incuber les cellules de Kupffer à 37 ° C et 5% de CO2 pendant 24 ou 72 heures. </li></ol> 6. Évaluation de la toxicité des -CNTs f dans les cellules de Kupffer par la lactate déshydrogénase (LDH) Dosage modification <ol><li> Jeter le surnageant. </li><li> Ajouter 200 pi (par puits de plaque de 24 puits) de tampon de lyse et incuber à 37 ° C pendant 30 min-1 heure. </li><li> Après avoir procédé à un pipetage vigoureux, collecter lysé les cellules de Kupffer dans des tubes de microcentrifugation et centrifuger à 40 000 xg pendant 10 min pour former un culot -CNTs f qui ont été prises par les cellules et les débris cellulaires. </li><li> Recueillir les surnageants (gratuit ƒ-CNT) dansmicrotubes et conserver à -20 ° C ou passez à l&#39;étape 6.5). </li><li> Transférer 50 ul dans une plaque de 96 puits et ajouter un volume égal de la solution substrat de mélange (kit LDH) à chaque puits. Couvrir la plaque et incuber à température ambiante pendant 15 min avant d&#39;ajouter 50 ul de la solution d&#39;arrêt (kit LDH). Ajouter triple de puits à blanc contenant 50 ul de tampon de lyse, 50 pi de solution substrat de mélange et 50 ul de solution d&#39;arrêt. </li><li> Lire l&#39;absorbance à 490 nm dans un lecteur de microplaques et utiliser la formule suivante pour calculer la (%) viabilité cellulaire. </li></ol><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/52989/52989eq1.JPG" />

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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+liver+Kupffer+cells.">Isolation of liver Kupffer cells.</a> Curr Protoc Toxicol. Chapter 14, Unit14 14 (2003).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Les étapes suivantes sont essentielles pour atteindre un rendement élevé et une haute viabilité des cellules de Kupffer. Des conditions d&#39;asepsie doivent être utilisés pour limiter le risque de contamination bactérienne et fongique. Tous les instruments doivent être stérilisés avant utilisation. Les réactifs doivent être fraîchement préparées avant d&#39;effectuer la procédure d&#39;isolement. Le choix de la collagénase IV, avec une faible activité tryptique, est crucia...

Le domaine de la recherche de la nanotoxicologie vise à caractériser l&#39;effet biologique des nanoparticules. Les études toxicologiques basées sur des investigations in vivo restent les méthodes les plus précises. Toutefois, leur utilisation est limitée par leur coût, travail et temps exigences 1. Comme essais alternatives, in vitro ont été utilisées en raison de leur simplicité et de la possibilité de développer à haut débit dans les plateformes de test in vitro 2 - étendant ainsi le nombre de conditions testées. La plupart des études sont effectuées en utilisant nanotoxicological dans des essais in vitro sur des lignées de cellules immortalisées. Cependant, il ya des préoccupations concernant l&#39;extrapolation de ces résultats expérimentaux à des effets toxicologiques in vivo 3. En effet, les propriétés des lignées cellulaires immortalisées peuvent être significativement différents de tissus ils ont été dérivés à partir, par exemple, la transformation génétique 4, la détérioration des caractéristiques morphologiques clés5, la perte de la polarité cellulaire 6 et altérations fonctionnelles telles que la réglementation des médiateurs inflammatoires 7. Les cellules de Kupffer population des macrophages sont les plus abondants dans le corps et sont directement en contact avec le sang en alignant la paroi de sinusoïdes hépatiques. Dans le cadre du système réticulo-endothélial (RES), les macrophages sont responsables de la capture des nanoparticules de circulation et, par conséquent, constituent un modèle très approprié pour étudier la toxicité des nanoparticules. In vivo 8 et in vitro 9 études de réponses inflammatoires associées à des cellules de Kupffer exposés à des nanoparticules ont été publiés ailleurs. Les cellules de Kupffer ont également été impliqués dans la pathogenèse des maladies du foie telles que la maladie alcoolique du foie 10, la fibrose hépatique ou hépatite virale 11 12. Il a été rapporté que les cellules de Kupffer isolés donnent un aperçu utile de décrire les mécanismes cellulaires involved dans la perturbation du foie 13,14. Plusieurs procédés ont été rapportés pour isoler et purifier des cellules de Kupffer. l&#39;isolement cellulaire peut causer de la dissociation mécanique ou enzymatique 15. Digestion collagénase montre l&#39;intérêt de la conservation de l&#39;intégrité fonctionnelle des cellules de Kupffer, tout en conduisant à haute Kupffer rendement de la cellule 16. De nombreuses approches expérimentales différentes, la complexité et les coûts, ont été utilisées pour séparer les cellules de Kupffer les autres populations de cellules du foie. Par exemple, des cellules de Kupffer pureté peut être obtenue par immunoaffinite 17, le flux 18 électrophorèse, l&#39;adhérence sélective 16 ou par des techniques d&#39;épandage 16, qui sélectionnent les cellules selon leur taille et leur densité. Une combinaison de ces méthodes peut être choisie pour augmenter la pureté de la population 16. Il n&#39;y a pas de consensus sur la méthode idéale pour l&#39;isolation des cellules de Kupffer, car elle dépend principalement sur les applications disponibles et équipemt. Toutefois, dans le cas des essais de toxicité de nanoparticules, la simplicité et un rendement élevé de la technique associée à la conservation fonctionnelle des cellules de Kupffer ont semblé être plus approprié pour cette application. La méthode d&#39;isolement des cellules de Kupffer est question ici est basé sur une méthode de perfusion deux étapes suivi d&#39;une purification sur gradient de densité. Le procédé a été modifié par rapport au protocole initial développé par Smedsrød et al. 16 conçus pour l&#39;isolement des cellules de foie de rat. La plupart des études ont rapporté et décrit l&#39;isolement de cellules de Kupffer du foie de rat. Ici, nous décrivons une méthode pour isoler les cellules de Kupffer du foie de la souris, avec un rendement élevé et de pureté. L&#39;utilisation de souris réduit le coût de l&#39;expérimentation et permet le traitement de plusieurs foies d&#39;obtenir de grandes quantités de cellules de Kupffer pour les tests de toxicité des nanoparticules. Dans le protocole suivant, les cellules de Kupffer ont été incubées avec des nanotubes de carbone fonctionnalisés (f </em&gt; -CNTs). Les propriétés physico-chimiques uniques de NTC - c.-à-haute rapport de longueur à diamètre et grande surface, ont fait NTC candidats intéressants comme vecteurs pour des fins de thérapie et de diagnostic. Toutefois, des préoccupations ont été soulevées concernant la toxicité des nanotubes de carbone 19, et le développement de nouveaux tests in vitro vise à accroître la compréhension des effets biologiques CNT. Toxicité chez les cellules de Kupffer est associé à un manque d&#39;intégrité structurelle de la membrane cellulaire. Elle est mesurée par la perte de l&#39;enzyme LDH cytoplasmique de la cellule dans le surnageant. Le principe de cette méthode est donc de supprimer tout LDH libérée et de mesurer ce qui reste dans les cellules 20. Ceci est réalisé de préférence à la mesure de la LDH libérée dans le surnageant parce que la présence de nanotubes de carbone dans le surnageant interfère avec l&#39;essai 21. Nous vous proposons l&#39;utilisation de ce métho d&#39;isolement des cellules de Kupffer efficace simple et économiqued pour isoler nombre élevé de cellules fonctionnelles Kupffer. Ceci permet le criblage de la toxicité d&#39;une gamme de nanoparticules, dans un modèle de macrophage primaire pertinente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td dir="LTR">Euthatal (pentobarbital sodium)</td>
			<td dir="LTR">Merial</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">CD1 mice</td>
			<td dir="LTR">Charles River&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">-</td>
			<td dir="LTR">Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (e.g. a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">HBSS (Ca2+ and Mg2+ free, with bicarbonate)&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">Life Technologies&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">14175-053</td>
			<td dir="LTR">HBSS must be&#160; Ca2+ free.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt&#160;</td>
			<td dir="LTR">Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">E8145&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca2+ selectively.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">HEPES (1M)&#160;</td>
			<td dir="LTR">Life Technologies&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">15630-056&#160;</td>
			<td dir="LTR">100 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Collagenase type IV&#160;</td>
			<td dir="LTR">Worthington&#160;</td>
			<td dir="LTR">CSL-4&#160;</td>
			<td dir="LTR">It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">&#160;Low glucose DMEM&#160;</td>
			<td dir="LTR">Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">D5523&#160;</td>
			<td dir="LTR">500 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax&#174;)&#160;</td>
			<td dir="LTR">Life Technologies&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">12633-012&#160;</td>
			<td dir="LTR">500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Penicillin/Steptomycin&#160;</td>
			<td dir="LTR">Life Technologies&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">15140-122</td>
			<td dir="LTR">100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td dir="LTR">First-Link&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">60-00-850&#160;</td>
			<td dir="LTR">500 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Trypan blue solution&#160;</td>
			<td dir="LTR">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td dir="LTR">T8154&#160;</td>
			<td dir="LTR">100 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Coated silica particle solution (Percoll&#174;)</td>
			<td dir="LTR">GE Healtcare&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">17-0891-02&#160;</td>
			<td dir="LTR">Percoll&#174; is very stable and can be kept for several years&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">1x Phosphate Buffered Saline&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">Life Technologies&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">10010-023</td>
			<td dir="LTR">500 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">10x Phosphate Buffered Saline&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">Life Technologies&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">70011-036</td>
			<td dir="LTR">500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Dimethyl sulfoxide&#160;</td>
			<td dir="LTR">Fisher&#160;</td>
			<td dir="LTR">D/4120/PB08&#160;</td>
			<td dir="LTR">500 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">LDH kit (CytoTox 96&#174;)&#160;</td>
			<td dir="LTR">Promega&#160;</td>
			<td dir="LTR">G1781&#160;</td>
			<td dir="LTR">Keep protected from light&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">DMEM phenol red free</td>
			<td dir="LTR">Life Technologies&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">31053-028&#160;</td>
			<td dir="LTR">500 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">F4/80 antibody (Alexa 488)</td>
			<td dir="LTR">AbD Serotec</td>
			<td dir="LTR">MCA497A488</td>
			<td dir="LTR">Do not dilute, used neat for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Fluorescent beads</td>
			<td dir="LTR">Sigma</td>
			<td dir="LTR">L2778</td>
			<td dir="LTR">Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of the Material</td>
			<td>Company&#160;</td>
			<td>Catalog number&#160;</td>
			<td>Comments/Description&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Butterfly blood collection set (23G/305mm long tubing)&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">BD&#160;</td>
			<td dir="LTR">367288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Syringe Filters (0.22 &#956;m Blue Rim)&#160;</td>
			<td dir="LTR">Minisart&#160;</td>
			<td dir="LTR">16534-K&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap)&#160;</td>
			<td dir="LTR">BD Biosciences, Falcon&#160;</td>
			<td dir="LTR">35 2070&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Petri dish (90 x 15 mm)&#160;</td>
			<td dir="LTR">Thermo Fisher Scientific&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">BSN 101VR20&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">100 &#956;m cell strainer&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">BD&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Peristaltic pump&#160;</td>
			<td dir="LTR">Watson Marlow&#160;</td>
			<td dir="LTR">SciQ 300&#160;&#160;</td>
			<td>Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">24-well plates</td>
			<td dir="LTR">Corning&#160;&#160;</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">96-well plates&#160;</td>
			<td dir="LTR">Corning&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Plate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>FLUOstar Omega</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Serrefine forceps</td>
			<td>Hammacher GmbH&#160;</td>
			<td>Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051</td>
			<td>The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Flow cytometry tubes</td>
			<td>BD Biosciences, Falcon&#160;</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Microcentrifuge tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Elkay</td>
			<td>&#160; 000-MICR-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Cell scraper</td>
			<td>BD Biosciences, Falcon</td>
			<td>353086</td>
			<td>Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Name of the Reagent</td>
			<td dir="LTR">Company&#160;</td>
			<td dir="LTR">Catalog number&#160;</td>
			<td dir="LTR">Comments/Description&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">&#160;EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank&#39;s Balanced Salt Solution) Solution&#160;</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR">HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Collagenase Solution&#160;</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR">DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Kupffer Cell Isolation Medium&#160;</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR">RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax&#174; (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Kupffer Cell Culture Medium&#160;</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR">RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax&#174; (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">SIP (solution of isotonic coated silica particles)</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR">Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline&#160; with 15.3 ml of Percoll&#174; to obtain 17mL of SIP.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">25% SIP solution&#160;</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR">Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">50% SIP solution&#160;</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td></td>
			<td dir="LTR">Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Lysis Buffer</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR">DMEM media with 0.9% Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">PBS/BSA Solution</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td></td>
			<td dir="LTR">Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kupffer cell isolation for nanoparticle toxicity testing

La grande majorité des études in vitro de nanotoxicological ont utilisé des lignées cellulaires immortalisées pour leur praticité. Cependant, les résultats des tests de toxicité des nanoparticules dans des lignées cellulaires immortalisées ou des cellules primaires ont montré des anomalies, en soulignant la nécessité d&#39;étendre l&#39;utilisation de cellules primaires pour les essais in vitro. Ce protocole décrit l&#39;isolement de macrophages hépatiques de souris, les cellules de Kupffer Nom de famille, ainsi que leur utilisation pour étudier la toxicité des nanoparticules. Les cellules de Kupffer population des macrophages sont les plus abondants dans le corps et constituent une partie du système réticulo-endothélial (RES), responsable de la capture des nanoparticules de circulation. La méthode d&#39;isolement des cellules de Kupffer est question ici est basé sur une méthode de perfusion deux étapes suivi d&#39;une purification sur gradient de densité. La méthode, basée sur la digestion de collagénase et une centrifugation de densité, est une adaptation du protocole d&#39;origine développé par Smedsrød et al. conçu pour les cellules du foie de rat isolation et fournit un rendement élevé (jusqu&#39;à 14 x 10 6 cellules par souris) et de haute pureté (&gt; 95%) des cellules de Kupffer. Cette méthode d&#39;isolement ne nécessite pas d&#39;équipements sophistiqués et coûteux ou représente donc un compromis idéal entre la complexité et le rendement de la cellule. L&#39;utilisation de souris plus lourds (35 à 45 g) permet d&#39;améliorer le rendement du procédé d&#39;isolation, mais aussi facilite remarquablement le mode opératoire de canulation de la veine porte. La toxicité des nanotubes de carbone fonctionnalisés f -CNTs a été mesuré dans ce modèle par le dosage de la LDH modifié. Cette méthode évalue la viabilité des cellules en mesurant le manque d&#39;intégrité structurelle de la membrane des cellules de Kupffer après incubation avec -CNTs f. Toxicité induite par -CNTs f peut être mesurée en utilisant systématiquement ce test, soulignant que les cellules de Kupffer isolées sont utiles pour les tests de toxicité des nanoparticules. La compréhension globale de la nanotoxicologie pourrait bénéficier de ces modèles, ce qui rend la sélection de nanoparticules pour la traduction clinique plus efficace.

Le nombre de cellules parenchymateuses non purifiées était conforme et a varié entre 8 et 14 x 10 6 cellules par souris (17 isolements ont été réalisées). Chaque isolement de la souris était suffisante à la plaque 16 à 28 puits. La viabilité des cellules par coloration au bleu trypan a montré la viabilité des cellules ~ 95%. Les cellules de Kupffer ont montré une forme ronde dans les 30 minutes d&#39;incubation à 37 ° C, liée à leur morphologie adhérente incomplètes (figure 4A).</s...

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Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells.

Kupffer cellule d&#39;isolement pour les essais de toxicité des nanoparticules

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle ...

kupffer-cell-isolation-for-nanoparticle-toxicity-testing

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.5K vues.  King's College London. Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells. 

Vidéo: Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

Isolement des cellules immunitaires fonctionnelles cardiaques

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Recherche

Immunologie et infection

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

Isolement des précurseurs des cellules B des sous-ensembles à partir de sang de cordon ombilical

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

Détection de nanoparticules fluorescentes Interactions avec immunitaire primaire sous-populations de cellules par cytométrie en flux

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Lymphocytes Isolation de la peau humaine pour Analyse phénotypique et<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culture cellulaire

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Imagerie animal entier et cytométrie de flux techniques pour T CD8 + Analyse des réponses spécifiques de l&#39;antigène de cellule après nanoparticules vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Isolement et analyse par cytométrie en flux des cellules immunitaires du cerveau ischémique souris

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident immune cell populations in the oral mucosa and gingiva. We have established a technique for the isolation and study of immune cells from murine gingival tissues, an area of constant microbial exposure and a vulnerable site to a common inflammatory disease, periodontitis. Our protocol allows for a detailed phenotypic characterization of the immune cell populations resident in the gingiva, even at steady state. Our procedure also yields sufficient cells with high viability for use in functional studies, such as the assessment of cytokine secretion ex vivo. This combination of phenotypic and functional characterization of the gingival immune cell network should aid towards investigating the mechanisms involved in oral immunity and periodontal homeostasis, but will also advance our understanding of the mechanisms involved in local immunopathology.

We have established a technique for the isolation, phenotypic characterization and functional analysis of immune cells from murine gingiva.

L&#39;isolement, la caractérisation et de l&#39;examen fonctionnel du Réseau de cellules gingivale immunitaire

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Une méthode de rendement efficace et haute pour l&#39;isolement des souris dendritiques sous-ensembles cellulaires

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Évaluation de l&#39;efficacité et la toxicité des ARNs Ciblage VIH-1 Production pour utilisation en thérapie génique ou des médicaments

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

A Silver Nanoparticle Method for Ameliorating Biliary Atresia Syndrome in Mice

Biliary atresia (BA) is a severe type of cholangitis with high mortality in children of which the etiology is still not fully understood. Viral infections may be one possible cause. The typical animal model used for studying BA is established by inoculating a neonatal mouse with a rhesus rotavirus. Silver nanoparticles have been shown to exert antibacterial and antiviral effects; their function in the BA mouse model is evaluated in this study. Currently, in BA animal experiments, the methods used to improve the symptoms of BA mice are generally symptomatic treatments given via food or other drugs. The aim of this study is to demonstrate a new method for ameliorating BA syndrome in mice by the intraperitoneal injection of silver nanoparticles and to provide detailed methods for preparing the silver nanoparticle gel formulation. This method is simple and widely applicable and can be used to research the mechanism of BA, as well as in clinical treatments. Based on the BA mouse model, when the mice exhibit jaundice, the prepared silver nanoparticle gel is injected intraperitoneally to the surface of the lower liver. The survival status is observed, and biochemical indicators and liver histopathology are examined. This method allows a more intuitive understanding of both the establishment of the BA model and novel BA treatments.

This article describes in detail a method based on silver nanoparticles for ameliorating biliary atresia syndrome in an experimental biliary atresia mouse model. A solid understanding of the reagent preparation process and the neonatal mouse injection technique will help familiarize researchers with the method used in neonatal mouse model studies.

Une méthode de nanoparticules argent pour améliorer le Syndrome de l’atrésie des voies biliaires chez les souris

Biliary atresia (BA) is a severe type of cholangitis with high mortality in children of which the etiology is still not fully understood. Viral infections ...