Ce manuscrit est dédié à la mémoire du Dr Wang Wenlan qui est décédé le 26 mai 2011. Nous remercions le Dr Douglas A. Kerr pour avoir généreusement fourni les cellules HBG3 MES utilisées dans cette étude. Ce travail a été financé par Nemours, une subvention (2 RR016472-10) dans le cadre du programme de INBRE du National Center for Research Resources (NCRR), et un prix COBRE subvention de la NCRR (5 P20 RR020173-05) pour soutenir le Centre pour la recherche pédiatrique à l&#39;Hôpital Alfred I. duPont pour les enfants, Wilmington, Delaware, Etats-Unis.

1. Étape 1: Souris souches embryonnaires de culture cellulaire (MES) (Durée: 3 jours) 1. Plaqué primaire fibroblastes embryonnaires de souris (PMEF) <ol><li> Manteau quatre de 100 mm boîtes de culture tissulaire avec de la gélatine pour l&#39;adhésion PMEF. Ajouter 8 ml de solution de gélatine à 0,1% (StemCell Technologies) à chaque plat et laisser incuber pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Retirer l&#39;excès de gélatine à partir de plats. Ne pas rincer la vaisselle. </li><li> Diluer un flacon de la mitomycine C-inactivé PMEF (Millipore) qui contient environ. 5 x 10 6 cellules dans 40 ml de PMEF médias (voir la recette dans le tableau 1) et la plaque sur quatre de 100 mm boîtes de culture tissulaire. Le PMEF fournir une couche nourricière de cellules MES. </li><li> PMEF devront être ensemencés au moins un jour avant d&#39;ajouter les cultures de cellules MES. PMEF peut être utilisé jusqu&#39;à 1 semaine après placage. </li></ol> 2. Placage cellules MES Pour surveiller l&#39;efficacité de la différenciation cellulaire MES dans les neurones moteurs, On utilise HBG3, une ligne de cellules ES proviennent d&#39;une souris transgénique exprimant eGFP sous le contrôle du promoteur spécifique des neurones moteurs HB9. <ol><li> Dégivrage 1 flacon de cellules MES HBG3 (env. 1 x 10 7, ont contribué par le Dr Douglas Kerr, l&#39;Université Johns Hopkins) dans un bain à 37 ° C l&#39;eau. Ajouter 5 ml de ES médias (voir la recette dans le tableau 1) dans un tube de 15 ml et centrifuger les cellules à 800 rpm pendant 5 min. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules MES dans 20 ml de médias ES fraîchement ajouté le facteur inhibiteur de leucémie (LIF) à une concentration finale de 10 ng / ml. REMARQUE: FRV doit être ajouté sur la journée d&#39;utilisation et est nécessaire pour maintenir les cellules MES dans un état indifférencié. </li><li> Retirer 10 ml de milieu PMEF du PMEF dans chaque plat et ajouter 10 ml de la suspension de cellules ES HBG3 à chaque plat. </li><li> 24 h après le placage, les cellules forment de petites colonies MES, similaire en taille à la colonie indiqué par la flèche dans la figure 1B. 72 h après le placage, colonsaugmentation de la taille es, beaucoup étant d&#39;environ 100 um de diamètre (figure 1B, indiqué par des flèches). Ces cellules sont prêtes pour la différenciation. Médias doit être remplacé par jour pour maintenir la prolifération des cellules. </li></ol> 2. Étape 2: l&#39;induction neurale (Durée: 2 jours) Pour induire la différenciation des cellules MES dans les neurones moteurs, cellules MES doivent être séparés de PMEF et cultivé dans un environnement de suspension. Gélatine flacons enduits sont utilisés pour séparer PMEF à partir de cellules MES. <ol><li> Lorsque les colonies MES sont prêts pour l&#39;induction neurale (définie comme 0 jours de différenciation), manteau de 2 flacons T150 avec 0,1% (18 ml / flacon) de gélatine pendant 30 min à température ambiante, puis retirer la gélatine et lavez avec du PBS 1X à trois reprises. REMARQUE: Chaque boîte de culture de 100 mm aurez besoin d&#39;un T150-gélatine flacon revêtu de séparer PMEF. </li><li> Retirez délicatement les médias par aspiration, en veillant à ne pas déloger les colonies faiblement attachées. Ajouter 10 ml de PBS brèvement, puis retirez par aspiration pour effectuer l&#39;étape de lavage. </li><li> Pour séparer les cellules du MES PMEF, ajouter 0,25% de trypsine / EDTA (3 ml / boîte, StemCell Technologies) et incuber pendant 3-5 min à 37 ° C jusqu&#39;à ce que les cellules souches et PMEF détacher de la plaque. Ajouter 15 ml de milieu ES frais sans LIF et les cellules de pipette et pour briser les colonies (environ 15-20 fois). Ensuite, ajoutez à un 0,1% de gélatine enduit T150 flacon et incuber pendant 30 min à 37 ° C. Après incubation, PMEF devrait s&#39;attacher à la surface tandis que les cellules ES gélatinisé devrait flotter. Recueillir les cellules flottantes MES dans un tube de 50 ml. </li><li> Centrifuger à 800 rpm et remettre les cellules dans 10 ml de milieu de différenciation neurale (voir la recette dans le tableau 1). </li><li> Compter les cellules en utilisant une plaque, puis hémocytomètre environ 2 x 10 6 cellules MES sur un plat de 100 mm culture bactérienne ou d&#39;une suspension. Ces plaques permettent la croissance des cultures en suspension et de favoriser la formation de corps embryoïdes (EBS). </li><li> Sur différenciation1 jour tion, les cellules MES former de petits agrégats flottants (EBS) qui sont visibles au microscope optique. Toute PMEF report joindre à l&#39;antenne. Transférer les cellules en suspension et les médias dans un tube de 15 ml et centrifuger à faible vitesse (500 rpm) pendant 3 min. Aspirer soigneusement les médias, ajouter 10 ml de milieu de différenciation neurale frais à l&#39;granulés EBS, puis les cellules de la plaque dans un nouveau plat bactérienne. En plus de réapprovisionner les médias, cette étape supprime toute PMEF qui transportent plus de l&#39;étape préalable. </li><li> Le 2 jours différenciation, EB sont prêts à être induite dans les neurones moteurs. </li></ol> 3. Étape 3: Spécification du motoneurone (Durée: 5 jours) <ol><li> Sur deux jours de différenciation, tourbillon la boîte de culture et de transférer les médias et EBS dans un tube de 15 ml. Laissez-EB se déposent par gravité (~ 10 min) ou par centrifugation à basse vitesse (500 rpm) pendant 3 min. </li><li> Aspirer soigneusement moyennes et remettre en suspension EBS dans 10 ml de la différenciation des neurones moteur (DMN) à moyen (voir la recette dans <strong&gt; Tableau 1). Plaque EBS dans un nouveau plat bactérienne et de changer les médias par jour pendant 5 jours. </li><li> Sur 7 jours de différenciation, EBS doit être d&#39;environ 150 à 200 um de diamètre et doit exprimer des signaux forts GFP (figure 1C). Ces EBS sont prêts à être dissociées et plaquée sur poly-DL-ornithine/laminin plats revêtus ou lamelles. </li></ol> 4. Étape 4: Préparation de Poly-DL-ornithine/laminin Lamelles enrobés (Durée: 2 jours) Deux jours avant la dissociation EBS (c&#39;est à dire sur 5 jours de différenciation), préparer des lamelles poly-DL-ornithine/laminin-coated. <ol><li> Placer 12 mm lamelles rondes (Warner Instruments) sur le fond d&#39;une plaque de 24 puits. Dissoudre 25 mg de poly-DL-ornithine (Sigma-Aldrich) dans 25 ml de l&#39;eau stérile bidistillée (d 2 H 2 O) pour obtenir une solution stock 10X (1 mg / ml). Lorsque vous êtes prêt à utiliser, faire une dilution au 1/10 de la poly-DL-ornithine avec d 2 H 2 O pour obtenir concentration de 100 pg / ml. Ajouter 0,5 ml à chaque puits de la plaque de 24 puits et incuber à 4 ° C pour la nuit. </li><li> Le lendemain (6 jours de différenciation), aspiration poly-DL-ornithine et de laisser les plaques de couverture et les feuillets de l&#39;air sec dans une hotte de culture tissulaire. Rincer les puits de la plaque avec D 2 H 2 O trois fois. Laissez sécher à l&#39;air pendant une heure. </li><li> Dissoudre 1 mg laminine de souris (Millipore) dans 5 ml de glace-froid du PBS 1X à préparer une solution mère 100x (200 pg / ml). Lorsque vous êtes prêt à utiliser, assurez-1/100 de dilution en glace-froid du PBS 1X (2 pg laminine / ml). Ajouter 0,5 ml / puits dans une plaque de 24 puits et incuber à 4 ° C pour la nuit. Avant que les cellules d&#39;ensemencement, de la laminine excès doit être retiré et les puits rincés avec du PBS 1X à deux reprises. Lamelles peuvent être stockées dans la DMN moyenne (0,5 ml / puits). </li></ol> 5. Étape 5: Allongement Axon (Durée: 2 jours) <ol><li> Sur 7 jours de différenciation, de recueillir EB dans un tube de 15 ml et laisser EB à régler (environ 3 min). Aspirer des médias et re-suspend EB dans du PBS. Permettez-EB à régler, puis aspirer PBS. Répétez cette étape 3 fois. Ajouter 1 ml de Accumax (Millipore) à l&#39;EBS, mélanger délicatement et incuber pendant 5 min à température ambiante. Puis aspirer Accumax excès couvrant l&#39;EBS. </li><li> Pour dissocier EBS, ajouter 3 ml de milieu de la DMN. Pipet haut et en bas 20 fois en utilisant une micropipette Eppendorf 1 ml (bleu pointe) de perturber EBS. Incuber pendant 2 min à température ambiante. Transférer la suspension de cellules à un tube mm 12x75 avec la cellule crépine capuchon (BD Falcon) pour obtenir une suspension cellulaire unique. Répétez cette étape de dissociation avec des touffes restantes et les cellules retenues par le filtre de manière à enrichir le rendement des cellules individuelles. La suspension cellulaire finale unique sera de 6 ml. </li><li> Mélanger délicatement cette suspension cellulaire unique et compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. Diluer cellules dans DMN support (supplémenté avec 10 ng / ml de chaque BDNF, GDNF, le CNTF, et NT-3) à une densité de 2x10 5 cellules par ml. Ajouter suspension cellulaire (0,5 ml / puits) pour plaques à 24 puits contenant polamelles ly-DL-ornithine/laminin enrobés (préalablement préparé comme décrit ci-dessus). Les cellules différenciées étendre neurites longtemps après 2 jours de culture (figure 1D). </li></ol> 6. Les résultats représentatifs La figure 1A montre un aperçu du protocole. Dans l&#39;étape 1, les cellules sont cultivées sur MES PMEF et complété par FRV pour prévenir une différenciation spontanée. En général, indifférenciées colonies MES sont ronds et compacts, et ont clairement défini les bords. Les colonies sont pas en contact avec l&#39;autre. En règle générale, les cellules de ce statut devait être divisé à un ratio de 1:4 tous les 3 2 ~ jours. Cependant, chaque lignée cellulaire individuelle va croître à un rythme différent et le rapport de division doit être déterminé de manière empirique. Les flèches dans la figure 1B indiquent l&#39;aspect typique des cellules MES après culture sur une couche nourricière PMEF pendant 3 jours. Ces colonies sont de grande taille (50-100 m de diamètre), mais tout en conservant bord rond et définis. A ce stade, les colonies sont prêts pour la différenciation ou de sous-culture. Une pointe de flèche dans la figure 1B montre une petite colonie MES que vous trouverez généralement 24 heures après placage. Quatre jours après le placage, les cellules envahies par la végétation MES. Ils montrent un aspect aplati et la perte de limites définies, ce qui indique qu&#39;ils commencent à se différencier. Ces cellules ne sont pas optimales pour la différenciation en cellules neuronales. Pour différencier les cellules MES dans les neurones moteurs, cellules MES doivent être cultivés dans des conditions de suspension pour permettre la formation EB. Dans l&#39;étape 2, les cellules ES sont transférées sur une surface de culture sans une couche d&#39;alimentation pour favoriser la formation EB. Dans cette étape, ils sont incubés dans un milieu de différenciation neurale complétée par Noggin, bFGF, et FGF-8 pour 2 jours à cellules directs à un lignage neuronal. Petit EBS peut être observée sous le microscope au jour 1 de la différenciation. Ils devraient être flottant dans le milieu. Report PMEF peuvent également être trouvés au jour 1de la différenciation et doit être retiré. Ces cellules adhèrent aux plats bactériens sont éliminés du moment où EBS sont passées à un nouveau plat bactérienne. Ainsi, au jour 2 de la différenciation, PMEF peu ou pas devrait être vu dans la boîte de culture. À l&#39;étape 3, a poursuivi le transfert de l&#39;EBS à de nouveaux plats devraient veiller à l&#39;enlèvement de tout PMEF restants. EB sont cultivées dans la différenciation des neurones moteurs (MND) des milieux supplémentés avec RA et SAG pendant 5 jours pour différencier les cellules dans les neurones moteurs. Pendant la culture, EBS continuer à croître en taille et peut être vu par l&#39;œil nu à 3 jours de différenciation ~ 4. Figure 1C montre l&#39;aspect microscopique de l&#39;EBS sur les 7 jours de différenciation. Contrairement aux cellules indifférenciées, EBS montrent une forte fluorescence due à l&#39;expression de la GFP. Ces EBS sont différenciés de façon optimale et sont prêts pour la dissociation. La cytométrie en flux a montré que 51% ± 0,8% des cellules provenant de la dissociation EB se sont différenciées en cellules exprimant la GFP 5. Dans l&#39;étape 5, la culture de la eese neurones moteurs de la présence de GDNF, le CNTF, le BDNF, NT3 et des résultats en extension de longues projections axonales. figure 1D montre l&#39;apparition de cellules différenciées 2 jours après le placage de dissocier EBS. Notez neurites longs s&#39;étendant à partir des corps cellulaires des cellules étalées. La coloration par immunofluorescence montre que les cellules GFP + exprimer le marqueur pan-neuronal (neurofilaments-à chaîne moyenne) et deux marqueurs de neurones moteurs spécifiques (Islet-1 et de la choline acétyltransférase, figure 2). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3813/3813fig1.jpg" /> Figure 1. La différenciation des cellules MES dans les neurones moteurs (image modifiée de Wu et al. 5). A) Schéma du protocole de la différentiation de cellules MES aux neurones moteurs. B) Cellules non différenciées MES former des colonies rondes sur le sommet d&#39;une couche nourricière de fibroblastes. Ils ont expression de la GFP faibles. C) des cellules MES ont été séparés de couches nourricières et culturouge sur les bas-fixation plats pour former EBS. Au cours des deux premiers jours du processus de différenciation, les cellules ont été exposées à 50 ng / ml Noggin, 20 ng / ml de bFGF, et 20 ng / ml de FGF-8. Par la suite, ils ont été induites à se différencier avec 1 acide rétinoïque uM et 1 uM sonore SAG agoniste hérisson pendant 5 jours. Cellules différenciées MES exprimé une forte fluorescence de la GFP. D) Après 7 jours de différenciation, EBS ont été dissociées et plaquée sur poly-DL-ornithine/laminin plaques revêtues. Les cellules différenciées à très longue durée des processus neuronaux après 2 jours de culture. Échelle = 200 um. MN = neurone moteur. B, C et D sont des images de champ lumineux et B &#39;, C&#39; et D &#39;sont correspondants des images de fluorescence. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3813/3813fig2.jpg" /> Figure 2. Caractérisation des neurones moteurs MES dérivés de cellules. Immunofluorescence à chaîne moyenne neurofilaments (NF-M, rouge), ChAT (rouge), et de l&#39;Islet-1 (rouge) a coïncidé avec la GFP (green) expression. DAPI (bleu) a été utilisé pour identifier les noyaux. Échelle = 50 microns.

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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

La qualité des cellules MES est le paramètre le plus critique pour la production efficace des neurones moteurs. MES cellules doivent être cultivées sur des PMEF pour prévenir une différenciation spontanée. Ajout d&#39;un FRV permet de maintenir les cellules MES dans un état indifférencié. Comme les cellules se divisent toutes les MES h 12-15, le milieu de culture devient rapidement épuisées et doivent être remplacés tous les jours. Activation efficace de la voie Shh est un para...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> La concentration finale </td></tr><tr><td> PMEF </td><td> Millipore </td><td> PMEF-H </td><td> NA </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PMEF moyennes </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-118 </td><td> NA </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-071 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-063 </td><td> 1% </td></tr><tr><td></td><td></td&gt; <td></td><td></td></tr><tr><td> MES moyennes </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCell Technologies </td><td> 36250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES Cell-qualifié FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16141-079 </td><td> 15% </td></tr><tr><td> Glutamax-je </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Non-acides aminés essentiels </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Nucléosides </td><td> Millipore </td><td> ES-008-D </td><td> 1% </td></tr><tr><td> β-mercaptoéthanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0,1 mM </td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FRV </td><td> Millipore </td><td&gt; LIF2010 </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Milieu de différenciation neurale </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCell Technologies </td><td> 36250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES FBS Cult </td><td> StemCell Technologies </td><td> 06905 </td><td> 15% </td></tr><tr><td> Non-acides aminés essentiels </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Mono-thio glycérol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-6145 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Caboche </td><td> Invitrogen </td><td> PHC1506 </td><td> 50 ng / ml </td></tr><tr><td> FGF-8 </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0274 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0024 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MND moyennes (différenciation) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-Secte Un moyen basal </td><td> StemCell Technologies </td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Le remplacement du sérum Knockout </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> N-2 supplément </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> SON Supplément-B </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07155 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> L&#39;acide ascorbique </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07157 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Glutamax-je </td><td>Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-8270 </td><td> 0,15% en d 2 H 2 O </td></tr><tr><td> La fibronectine </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07159 </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td> Héparine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> 20 pg / ml dans D 2 H 2 O </td></tr><tr><td> β-mercaptoéthanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0,1 mM </td></tr><tr><td> L&#39;acide rétinoïque </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R-2625 </td><td> 1 uM </td></tr><tr><td> SAG </td><td> EMD Chemicals </td><td> 566660 </td><td> 1 uM </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MND moyennes (la culture du motoneurone) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-Secte Un moyen basal </td><td> StemCell Technologies </td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Le remplacement du sérum Knockout </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> N-2 supplément </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> SON Supplément-B </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07155 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> L&#39;acide ascorbique </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07157 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Glutamax-je </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-8270 </td><td> 0,15% en d 2 H 2 O </td></tr><tr><td> La fibronectine </td><td> StemCTechnologies ell </td><td> 07159 </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td> Héparine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> 20 pg / ml dans D 2 H 2 O </td></tr><tr><td> β-mercaptoéthanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0,1 mM </td></tr><tr><td> BDNF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 248-BD-005/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> CNTF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 257-NY-010/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> GDNF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 212-GD-010/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 267-N3-005/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr></tbody></table> NA = Non applicable. Tableau 1. PMEF et des médias pour la culture cellulaire ou la différenciation MES. <table border="1"><tbody><tr><td> &lt;Nom strong&gt; du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Concentration finale </td></tr><tr><td> 0,1% de gélatine </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07903 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Poly-DL-ornithine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0421 </td><td> 0,1 mg / ml dans d 2 H 2 O </td></tr><tr><td> Laminine de souris </td><td> Millipore </td><td> CC095 </td><td> 2 ug / ml dans du PBS </td></tr><tr><td> 0,25% / trypsine EDTA </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07901 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Accumax </td><td> Millipore </td><td> SCR006 </td><td> NA </td></tr></tbody></table> NA = Non applicable. Tableau 2. Réactifs pour revêtement et la dissociation.

efficient differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons

Différenciation directe de souches embryonnaires (ES) des cellules dans les neurones moteurs fonctionnels représente une ressource prometteuse pour étudier les mécanismes des maladies, afin de déceler de nouveaux composés médicamenteux, et à développer de nouvelles thérapies pour les maladies du motoneurone telles que l&#39;atrophie musculaire spinale (SMA) et la sclérose latérale amyotrophique ( SLA). De nombreux protocoles actuels utilisent une combinaison de l&#39;acide rétinoïque (AR) et Sonic Hedgehog (Shh) à différencier souches embryonnaires de souris (MES) dans les cellules neurones moteurs 1-4. Cependant, l&#39;efficacité de différenciation des cellules MES dans le motoneurone a seulement rencontré un succès modéré. Nous avons développé un protocole de différenciation des deux l&#39;étape 5 qui améliore considérablement l&#39;efficacité de différenciation par rapport aux protocoles actuellement établies. La première étape consiste à améliorer le processus en ajoutant neuralisation Noggin et les facteurs de croissance des fibroblastes (FGF). Noggin est une protéine morphogénétique osseuse (BMP) antagoniste et est impliqué dans l&#39;induction neurale uneelon le modèle par défaut de la neurogenèse et les résultats dans la formation de motifs de neurones antérieure 6. FGF signalisation agit en synergie avec Noggin dans l&#39;induction de la formation du tissu neuronal par la promotion d&#39;une identité postérieure neurones 7-9. Dans cette étape, les cellules MES ont été sensibilisées avec Noggin, bFGF, et FGF-8 pendant deux jours pour promouvoir la différenciation vers des lignées de neurones. La deuxième étape consiste à induire la spécification des neurones moteurs. Noggin / FGF ont exposé des cellules ont été incubées avec MES RA et d&#39;un agoniste Shh, agoniste Smoothened (SAG), pour un autre 5 jours pour faciliter la génération de motoneurones. Pour surveiller la différenciation des neurones moteurs en MES, on utilise une lignée cellulaire dérivée d&#39;un ES eGFP souris transgénique exprimant sous le contrôle du promoteur spécifique des neurones moteurs HB9 1. L&#39;utilisation de ce protocole robuste, nous avons atteint 51 ± 0,8% de l&#39;efficacité de différenciation (n = 3, p &lt;0,01, t de Student-test) 5. Les résultats de immunofluorescencecoloration a montré que des cellules GFP + de expriment les marqueurs spécifiques, neurones moteurs Islet-1 et de la choline acétyltransférase (ChAT). Notre protocole de différenciation en deux étapes fournit un moyen efficace pour différencier les cellules MES dans les neurones moteurs spinaux.

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Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Nous avons développé un nouveau protocole pour améliorer l&#39;efficacité de la différenciation in vitro de cellules souches embryonnaires de souris en neurones moteurs. Les cellules ES différenciées acquis motoneurones dispose comme en témoigne l&#39;expression de marqueurs neuronaux et des neurones moteurs en utilisant des techniques d&#39;immunohistochimie.

Différenciation efficace des cellules souches embryonnaires de souris dans les neurones moteurs

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

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Research

JoVE Journal

Biology

22.2K vues.  Alfred I. duPont Hospital for Children. Nous avons développé un nouveau protocole pour améliorer l'efficacité de la différenciation in vitro de cellules souches embryonnaires de souris en neurones moteurs. Les cellules ES différenciées acquis motoneurones dispose comme en témoigne l'expression de marqueurs neuronaux et des neurones moteurs en utilisant des techniques d'immunohistochimie.

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Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Dérivation de cellules souches hématopoïétiques de cellules souches embryonnaires murines

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Recherche

Biologie

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either remain a stem cell or become another type of cell with a more specialized function, This promising of science is leading scientists to investigate the possibility of cell-based therapies to treat disease.

When culture in suspension without antidifferentiation factors, embryonic stem cells spontaneously differentiate and form three-dimensional multicellular aggregates. These cell aggregates are called embryoid bodies(EB). Hanging drop culture is a widely used EB formation induction method. The rounded bottom of hanging drop allows the aggregation of ES cells which can provide mES cells a good environment for forming EBs. The number of ES cells aggregatied in a hanging drop can be controlled by varying the number of cells in the initial cell suspension to be hung as a drop from the lid of Petri dish. Using this method we can reproducibly form homogeneous EBs from a predetermined number of ES cells. 

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem mES Cells Using the Hanging Drop Method

This video demonstrates how to conduct in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells to embryoid bodies using the hanging drop method.

Différenciation in vitro de souris embryonnaires souches (MES) Cellules utilisant la méthode de goutte suspendue

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

L&#39;isolement et la dérivation de cellules germinales embryonnaires de souris

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

La différenciation des cellules souches embryonnaires en précurseurs d&#39;oligodendrocytes

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Dérivation efficace des ressources humaines précurseurs cardiaques et les cardiomyocytes à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l&#39;induction de petites molécules

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Préparation des cellules de souris embryonnaires fibroblastiques conviennent pour la culture embryonnaires humaines et cellules souches pluripotentes induites

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Génération de souris dérivées de cellules souches pluripotentes induites

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are multistep procedures involving the isolation and expansion of neural precursor cells, prior to terminal differentiation. In comparison to these time-consuming approaches, we have recently found that combined inhibition of three signaling pathways, TGF&beta;/SMAD2, BMP/SMAD1, and FGF/ERK, promotes rapid induction of neuroectoderm from hPSCs, followed by immediate differentiation into functional neurons. Here, we have adapted our procedure to a novel multititre plate format, to further enhance its reproducibility and to make it compatible with mid-throughput applications. It comprises four days of neuroectoderm formation in floating spheres (embryoid bodies), followed by a further four days of differentiation into neurons under adherent conditions. Most cells obtained with this protocol appear to be bipolar sensory neurons. Moreover, the procedure is highly efficient, does not require particular expert skills, and is based on a simple chemically defined medium with cost-efficient small molecules. Due to these features, the procedure may serve as a useful platform for further functional investigation as well as for cell-based screening approaches requiring human sensory neurons or neurons of any type.

Protocols for neuronal differentiation of pluripotent human stem cells (hPSCs) are often time-consuming and require substantial cell culture skills. Here, we have adapted a small molecule-based differentiation procedure to a multititre plate format, allowing simple, rapid, and efficient generation of human neurons in a controlled manner.

Génération rapide et efficace des neurones à partir de cellules souches pluripotentes humaines dans un format plaque Multititre

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

Différenciation de la peau de souris nouveau-nés des cellules souches dérivées dans les cellules germinales comme<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

Rétroviral infection de cellules souches embryonnaires murines dérivées de cellules du corps embryoïdes pour l&#39;analyse de la différenciation hématopoïétique

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...