Nous tenons à remercier le Dr Julie Gordon et le Dr Nancy Manley pour leurs conseils utiles à la technique de la culture. Ce travail a été soutenu par la Fondation des enfants glaucome et Sharon Stewart Aniridie Research Trust.

Embryon de souris culture: Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées en stricte conformité avec les National Institutes of Health des lignes directrices en suivant le protocole # A2010 07-119, qui a été examiné et approuvé par l&#39;Université de Géorgie institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation Comité, qui assure la surveillance réglementaire continue. Une. Préparation de milieux de culture <ol><li> Préparer le milieu de culture en utilisant commercialement disponibles médias de cellules souches et les suppléments pour les montants suivants: KnockOut DMEM, KnockOut Serum Replacement (KSR) (10%), N-2 Supplément (1x), d&#39;albumine, de sérum bovin (2%), la pénicilline ( 50 UI / ml), streptomycine (50 ug / ml) et de l&#39;amphotéricine-B (1,25 ug / ml). Le milieu de culture préparé est similaire à celui décrit précédemment 15 avec les modifications suivantes: l&#39;addition d&#39;anti-mycotics et en utilisant le double de la concentration d&#39;antibiotiques (pour des détails sur le matériel et les réactifs spécifiques, voir Lier des matériaux). Remarque: la concentration en antibiotique utilisé précédemment (. Moore-Scott, et al 15) est suffisante pour les cultures d&#39;embryons réalisés jusqu&#39;à 24 période de temps d&#39;une heure. Toutefois, lorsque la culture a été poursuivie au-delà de 24 heures, nous avons eu contamination de la culture et cela a été contrôlé avec succès par le doublement de la concentration de l&#39;antibiotique. </li><li> Stocker les composants de médias à 4 ° C ou à -20 ° C selon les recommandations du fabricant. KSR et N-2 Complément doivent être stockés dans des aliquotes à -20 ° C pour éviter la congélation et la décongélation répétées. KnockOut DMEM une fois ouvert doit être utilisé dans les 30 jours selon les recommandations du fabricant. Avant utilisation, réchauffer les composants dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. </li><li> Préparez le support dans des conditions stériles. Désinfecter la surface de tout l&#39;équipement et les bouteilles contenant les composants de médias avec 70% d&#39;alcool pulvérisation avant de les placer dans la hotte de culture. </li><li> Les composants du milieu peuvent être mélangés soit dans un bêcher stérile ou directement dans le système de filtre (Corning). D&#39;abord ajouter la poudre d&#39;albumine à la KnockOut DMEM. Bien mélanger en secouant doucement jusqu&#39;à ce que le albumine se dissout complètement. Puis ajouter la N-2 Supplément, KSR et les antibiotiques et bien mélanger à l&#39;aide d&#39;une pipette. Puis filtrer stériliser le support à l&#39;aide d&#39;un filtre de 0,22 um de taille de pore avec aspiration sous vide. Distribuer les médias dans 50 ml tubes coniques et magasins à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. Les médias, une fois préparés doivent être utilisés dans les 4-5 jours pour la culture. </li></ol> 2. Préparation de l&#39;équipement Culture <ol><li> Stériliser les flacons de culture en verre et bouchons en caoutchouc. Envelopper les flacons de culture dans une feuille d&#39;aluminium et placer les bouchons en caoutchouc dans un bêcher d&#39;eau et stériliser à l&#39;autoclave. </li><li> Stériliser la chambre de culture (Unité de précision Incubateur) avec 70% de pulvérisation d&#39;alcool et chaud à 37 ° C avant de commencer la culture. La chambre de culture est eplaisanté avec un disque de roulement au centre qui maintient les bouteilles de culture. L&#39;écoulement du gaz dans la chambre est régulée par une jauge de pression et le débit d&#39;écoulement peut être ajustée en observant la sortie de bulles d&#39;air à travers l&#39;eau dans un tube de verre à la fin. Cet appareil de culture de la bouteille de roulement est une version modifiée de l&#39;appareil d&#39;origine introduit par la Nouvelle et Cockroft 17. </li><li> Raccorder une bouteille de gaz contenant un mélange gazeux de 95% O 2/5% CO 2 dans la chambre de culture et d&#39;ajuster le débit de gaz à &quot;une bulle d&#39;air par seconde&quot; qui donne un débit de 50 cc / min d&#39;écoulement et assure un approvisionnement suffisant en oxygène pour les embryons de culture. </li></ol> 3. Embryon de souris prélèvement et la préparation de la Culture <ol><li> Pour obtenir des embryons de souris de type sauvage, nous avons utilisé des souris de C57BL/6J et CD-1 (Charles River Laboratories) souches de fond génétique. </li><li> Vérifiez la souris femelle pour bouchon vaginal tous les matins de jour. Le midi le jour de trouver èmee bouchon vaginal doit être considérée comme E 0,5 dpc (jours après le coït). </li><li> Recueillir des embryons de souris à E10.5 dpc par euthanasier les souris enceintes suivant des protocoles standard. Les souris ont été euthanasiés au moyen d&#39;un dispositif d&#39;inhalation de CO 2 comme spécifié par l&#39;American Veterinary Medical Association (AVMA) Lignes directrices pour l&#39;euthanasie des animaux (2013). Pour assurer la mort, la dislocation cervicale a été réalisée après exposition au CO 2. </li><li> Vaporiser éthanol à 70% sur la surface ventrale pour éviter le collage de cheveux abdominale pour les instruments. Ensuite, ouvrez la cavité abdominale ventrale en utilisant un arêtes franches ciseaux d&#39;exploitation et une paire de 4-3/4 à microdissecting pince pour localiser l&#39;utérus. L&#39;utilisation d&#39;un 4 en pince microdissecting soulever tout l&#39;utérus et le séparer du corps en le coupant avec des ciseaux une lumière d&#39;exploitation sur le corps de l&#39;utérus et à la pointe des cornes utérines. </li><li> Rincer rapidement tout l&#39;utérus en 1x PBS chauffé à 37 ° Cpour éliminer toute adhérence de sang à l&#39;utérus et placer immédiatement dans du DMEM réchauffé à 37 ° C dans une boîte de Pétri. Stériliser les instruments de 70% d&#39;éthanol pulvérisation avant une nouvelle utilisation. Remarque: le préchauffage de la solution, y compris le PBS, du DMEM et du milieu de culture et de les maintenir à 37 ° C pendant toute la procédure est conseillée. </li><li> Sous un microscope de dissection, l&#39;utérus doit être disséqué par segments avec une lumière ciseaux d&#39;exploitation. Il en résulte de petites ouvertures de chaque côté de l&#39;utérus segmentée à travers laquelle une paire de pinces de microdissecting modifiés (extrémités émoussées) peut être inséré en douceur à élargir l&#39;ouverture. Ceci permet à l&#39;exposition de la caduque placentaire, qui peut ensuite être éliminé par déchirement doucement avec une paire de pinces de microdissecting pour exposer le sac vitellin pariétal (PYS) avec la membrane de Reichert. Utilisation d&#39;un bord de la pince à épiler doucement percer la membrane de Reichert avec les PYS et séparée de the sous-jacente vésicule ombilicale viscérale (VYS) une couche d&#39;exposer les embryons avec VYS intactes. Le cône ectoplacentaire et les dérivés de trophoectoderm peuvent être éliminés soit par la caduque ou de placenta avec la membrane de Reichert. Des précautions doivent être prises pour éviter la rupture de la VYS que les embryons sautent immédiatement. </li><li> Les embryons avec VYS intactes doivent ensuite être transférés sur une boîte de Pétri contenant le milieu de culture chauffé à 37 ° C en utilisant une pipette de transfert en plastique. Remarque: Le transfert de milieu de culture immédiatement après la séparation de l&#39;utérus aide pour un meilleur développement de l&#39;embryon dans la culture. </li><li> Une petite ouverture doit être faite dans le sac vitellin d&#39;une paire de pincettes microdissecting en évitant les vaisseaux sanguins principaux. Une paire de pinces pointu peut être utilisé pour rendre l&#39;ouverture par perçage doucement dans une zone adjacente à la zone de tête. Vous pouvez également deux paires de pinces franches peuvent être utilisés pour maintenir le sac jaune et doucement déchirer pour faire une petite ouverture.Puis creuser doucement l&#39;ouverture par l&#39;expansion avec les pinces à la taille juste assez pour tenir la tête embryonnaire. La membrane amniotique qui est enveloppant étroitement l&#39;embryon doit être délicatement tenu loin du corps et déchiré en utilisant une paire de pinces. La tête embryonnaire et par la suite l&#39;ensemble de l&#39;embryon doit être doucement extériorisés à partir de la vésicule ombilicale, tout en maintenant l&#39;intégrité du système vasculaire embryonnaire à celle de la vésicule ombilicale 15. Remarque: Les dommages aux vaisseaux sanguins de la vésicule ombilicale peut potentiellement affecter le développement de l&#39;embryon dans la culture. Ces embryons avec vasculaire endommagé ne doivent pas être utilisés pour la culture et peuvent être utilisés pour mettre en scène les embryons qui peuvent ensuite être éliminés. </li><li> Critères d&#39;arrêt embryonnaires: Examiner les embryons au microscope de dissection et de groupe par des critères morphologiques dont le corps et la taille de la tête, des membres et de la morphologie de l&#39;œil et le stade en comptant le nombre de somites (s) pour au moins deux embryons de chaque groupe. &lt;strong&gt; Note: Habituellement embryons obtenus à partir des mêmes déchets présentent des différences dans le développement in utero et diffèrent par la taille du corps, les caractéristiques morphologiques et le nombre de somites. Cependant, nous avons constaté que les embryons groupés par nos critères morphologiques exposées habituellement au nombre de somites similaire (± 1). Pour cette raison, il n&#39;est pas nécessaire de compter somites pour chaque embryon comme ce serait retarder le moment de démarrage de la culture. Note: Ne pas utiliser les embryons qui ont été utilisés pour compter les somites de la culture. Compter les somites après le début de la culture des embryons pour les autres afin d&#39;éviter le retard dans le démarrage de la culture. Les embryons qui ont été retardés à la culture après la séparation de l&#39;utérus présentent généralement faible développement. </li><li> Transférer les embryons immédiatement à une boîte de Pétri avec la culture du milieu frais chauffé à 37 ° C et le prendre à la hotte de culture où les embryons doivent encore être transférés à une boîte de Pétri avec cultur stérilee médias avant de les mettre dans les bouteilles de culture avec du milieu pour commencer la culture. Remarque: Les transferts multiples de médias pour les embryons avant la culture aide à prévenir la contamination que les différentes étapes de collecte et de dissection embryon ont été réalisées sous un microscope à dissection qui n&#39;a pas été installé dans la hotte de culture. Remarque: Lorsque la taille de la portée est grande (&gt; 12 embryons), le processus de la moitié des embryons et de commencer la culture ou les mettre dans un plat avec un milieu de culture et le placer dans un incubateur à CO2 à 37 ° C. Lorsque les embryons ont été laissés à l&#39;extérieur pendant de longues périodes (&gt; 35-40 min), nous avons observé le rythme cardiaque ralentir et cela va affecter le développement ultérieur de la culture. </li></ol> 4. La culture embryons de souris <ol><li> Ouvrez les bouteilles de culture autoclave dans la hotte de culture et bien les étiqueter. Transfert de 3 ml de milieu de culture chauffé à 37 ° C à chacun des tes bouteilles, puis les embryons de souris devraient être transférés doucement dans les flacons de culture à l&#39;aide de pipettes de transfert en plastique stériles. Les flacons de culture doivent ensuite être coiffés avec des bouchons en caoutchouc qui aident à tenir les flacons de culture au disque de laminage dans le dispositif de culture. Remarque: Les flacons de culture avec les médias peuvent être préparés et placés sur le disque de roulement de l&#39;appareil de culture avant euthanasier les souris. Cela réduit le temps de transfert d&#39;embryons dans les flacons de culture. Remarque: Des embryons de souris peuvent être cultivées individuellement ou en tant que co-cultures avec deux ou trois embryons dans le même flacon de culture. </li><li> Les flacons de culture doivent être effectuées de manière aseptique à l&#39;appareil de culture à 37 ° C et hermétiquement les accrocher sur les trous du disque de roulement avec des bouchons en caoutchouc. Allumer le disque de roulement de tourner à une vitesse constante de 35 tours par minute (rpm), ce qui permet la flottaison libre de la embryo dans les médias et contribue également à l&#39;échange de gaz libre par le tissu embryonnaire. Le gaz de la bouteille reliée à la chambre de culture s&#39;écoule à travers le disque de roulement et les bouchons en caoutchouc dans les flacons de culture. </li><li> Culture des embryons pour 16-40 h et vérifier régulièrement pour l&#39;évacuation des gaz et de la température de la chambre de culture. Remarque: la manipulation des embryons de souris en culture: Laissez les embryons se adaptées aux conditions de culture pendant au moins 30 min. Ensuite, les embryons qui exécutent mal et montrant le rythme cardiaque faible peuvent être jetés et les embryons restants peuvent être utilisés pour des études ultérieures de manipulation. manipulations d&#39;embryons comme l&#39;électroporation 5,9,16, 18 micro-injections, perle implantation 16, traitement de la toxicomanie et d&#39;autres procédures peuvent être effectuées à cette époque. Nous avons effectué avec succès de l&#39;implantation des billes d&#39;agarose Affi-Gel traités avec certaines molécules de signalisation pour étudier leur rôle dans le développement précoce de l&#39;œil. Les embryons aprèsmanipulations peuvent être retournés dans un milieu frais et continué dans la culture. </li><li> Remplacer les milieux de culture totalement avec les médias frais à des intervalles spécifiques après 9-10 h et 18-19 h de culture lorsque la culture a été poursuivie pendant 40 heures. Remarque: Culture remplacement des médias ne peut pas être nécessaire si la culture est arrêtée par 16-18 h. </li><li> Les mesures de succès dans la culture: la survie embryonnaire dans la culture devrait être déterminée par battement de coeur visible et la circulation sanguine dans le corps alors que la croissance embryonnaire dans la culture doit être évaluée par l&#39;augmentation de la taille du corps, le nombre de somites et le développement morphologique de la tête, des membres, le cœur et les yeux. </li><li> In utero développé embryons à E11.0 dpc (~ 40-41 s) et E12.0 dpc (~ 49-50 s) devraient être utilisés comme témoins pour comparer embryons cultivés pour 16-18 h et 38-40 h, respectivement. </li><li> Le développement embryonnaire à différents moments au cours de la culture et de par étapes in utero peut être CAPTureD sous loupe binoculaire. logiciel d&#39;imagerie Spot a été utilisé pour capturer les images et plus tard transformé en utilisant un logiciel de traitement d&#39;image. </li></ol>

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Nous n&#39;avons pas d&#39;intérêts financiers concurrents.

L&#39;embryon de souris de phase à mi-gestation ont été cultivées dans un milieu de culture exempt de sérum dans une atmosphère de 95% O 2/5% CO 2 dans un appareil de culture de flacon roulant à 37 ° C. le développement de l&#39;embryon ex utero dépendait essentiellement de plusieurs facteurs, à chaque étape au cours de la procédure à partir du moment de l&#39;utérus est isolé à partir des souris euthanasiées à la fin de la culture (Figure 1). Le facteur...

Méthodes in vitro de culture en utilisant des embryons entiers sont bien adaptés à l&#39;étude des mécanismes impliqués dans l&#39;organogenèse embryonnaire qui sont difficiles d&#39;accès dans l&#39;utérus de signalisation. Embryons entiers fournissent l&#39;intégrité des tissus et de soutien appropriés pour les interactions de tissus qui sont cruciaux pour survenue en temps opportun des mécanismes essentiels de signalisation pour les différents processus cellulaires pendant l&#39;organogenèse. Tandis que les cultures d&#39;embryons entiers fournissent une plate-forme pour une multitude d&#39;applications telles que des études de transplantation, les manipulations génétiques et de tissus, des études perle d&#39;implantation, études toxicologiques, etc., Des systèmes de culture d&#39;embryons actuellement utilisés dépendent principalement de sérum pour la croissance et l&#39;entretien des embryons dans la culture de 1 à 9. Le sérum a été utilisé comme l&#39;un des principaux composants allant de 10 à 100% du milieu de culture 8.6, 10, 11.; Cependant, la composition de sérum n&#39;est pas bien défini et peut varier d&#39;un animal à chaque fois, et le sérum est recueilli. Alors que la préparation de sérum de laboratoire est consommatrice de temps et implique des procédures strictes, sérum procuré présente commercialement variabilité considérable entre les différents lots et augmente les coûts de laboratoire. Ajoutés à ceux-ci, le sérum peut contenir des facteurs inconnus tels que des facteurs de croissance, des hormones, ou d&#39;autres protéines, qui peuvent avoir une incidence sur les résultats de certaines expériences, en particulier ceux qui impliquent l&#39;étude des molécules importantes dans les interactions tissulaires de signalisation. Des études ont montré que l&#39;addition de sérum à la culture peut potentiellement modifier les niveaux intracellulaires de certaines molécules de signalisation telles que l&#39;adénosine monophosphate cyclique (AMPc) et les protéines impliquées dans la signalisation mitogénique et 3 phosphoinositide (PI 3)-kinase voies de signalisation 12-14. Contrairement à ceux-ci, un système de culture sans sérum offre les avantages de l&#39;antigène libre environnement,abstinence de enzymes biologiquement actives qui peuvent altérer les processus cellulaires et permet la cohérence entre les expériences. Dans la présente étude, nous avons utilisé un milieu de culture sans sérum préparé à partir de commerce suppléments de milieux de cellules souches à toute la culture étape à mi-gestation des embryons dans une atmosphère de 95% d&#39;O 2/5% de CO 2 dans un appareil de culture de la bouteille de roulement à 37 ° C 15,16. Des embryons de souris en culture pendant 16 à 40 heures dans ces conditions définies présentaient progression dans le développement morphologique des structures du corps et les différentes embryonnaires globaux tels que le cœur, les membres, le cerveau et les yeux indiquant des niveaux appropriés de la prolifération cellulaire, la migration, la différenciation et interactions tissulaires. L&#39;analyse moléculaire du développement embryonnaire dans la culture de l&#39;un des systèmes organiques complexes tels que l&#39;œil a révélé la mise au point oculaire d&#39;être cohérent avec celui observé dans le tissu oculaire dans embryo développement in utero (Kalaskar et Lauderdale, en préparation). Ainsi, nous montrons que les embryons de souris en culture au stade mi-gestation, affichent une croissance progressive et le développement morphologique comparable à celle observée dans les embryons en développement in utero.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<tbody>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10829-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Stock: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, from Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418-50G</td>
			<td>Stock: 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic - Antimycotic Solution</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30-004-Cl</td>
			<td>Stock: Penicillin (10000 IU/ml); Streptomycin (10000 &#181;g/ml; Amphotericin (250&#181;g/ml)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;&#160;</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Incubator Unit</td>
			<td>B.T.C. Engineering Milton Cambridge England</td>
			<td>Id.No. 840-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottles for Rotating Unit</td>
			<td>B.T.C. Engineering</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Rubber Cork</td>
			<td>B.T.C. Engineering</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2/5% CO2 Cylinder</td>
			<td>AirGas Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi SV6 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Water Jacketed Incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>Model: 3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Hood</td>
			<td>Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2</td>
			<td>Model: Nu-425-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>IsoTemp205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh Balance</td>
			<td>Mettler Toledo&#160;</td>
			<td>AG285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube &#8211; 50ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Operating Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Sharp-Blunt Scissors&#160;</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Forceps &#8211; 4&#8221;</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Forceps - Hudson (cWALD) &#8211; 4-3/4&#8221;</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezers (5/45)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5005</td>
			<td>Modified - Sharp ends were made blunt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezers (5)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5060</td>
			<td>Modified - Sharp ends were made blunt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezers (55)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5063</td>
			<td>Modified - Sharp ends were made blunt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument Tray</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RT-1401S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument Tray Lid</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RT-1401L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish-100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>087571Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish-60mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish-35mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0875711YZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-150ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-250ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-500ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-aid Pipetter</td>
			<td>Drummond Scientific Co.</td>
			<td>D57849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipette-10ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serological Pipette-25ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipette - 7.7ml</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>202-20S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system

L&#39;embryon de souris de phase à mi-gestation ont été cultivées en utilisant un milieu de culture sans sérum disponibles dans le commerce préparé à partir de suppléments de milieux de cellules souches dans un système de culture de flacon roulant oxygéné. Des embryons de souris à E10.5 ont été soigneusement isolés à partir de l&#39;utérus intact avec le sac vitellin et dans un processus impliquant geste chirurgical précis les embryons ont été extériorisés doucement à partir de la vésicule ombilicale, tout en maintenant la continuité vasculaire de l&#39;embryon avec le sac vitellin. Par rapport aux embryons préparés avec intact sac vitellin ou avec le sac vitellin éliminée, ces embryons exposés taux de survie supérieur et la progression du développement quand elle est cultivée dans des conditions similaires. Nous montrons que ces embryons de souris, lorsqu&#39;elles sont cultivées dans un milieu défini dans une atmosphère de 95% O 2/5% CO 2 dans un appareil de culture de flacon roulant à 37 ° C pendant 16 à 40 heures, présentent une croissance et un développement comparable à morphologique les embryons en développement in utero. Nous croyons èmeest la méthode sera utile pour les enquêteurs qui ont besoin d&#39;utiliser la culture de l&#39;embryon entier pour étudier les interactions importantes dans l&#39;organogenèse embryonnaire de signalisation.

Le développement d&#39;embryons de souris ex utero dépend de multiples facteurs de départ à partir du moment de l&#39;utérus est isolé de l&#39;organisme à la fois les embryons sont mis en culture. Comme représenté sur la figure 1, la procédure implique une série d&#39;étapes comprenant la séparation de l&#39;utérus gravide à partir du corps (figure 1A), l&#39;isolement des embryons avec sac vitellin intact (figure 1B), l&#39;extériorisation des...

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Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Sérum utilisé dans les cultures d&#39;embryons contient des composants inconnus qui peuvent affecter le résultat d&#39;expériences en particulier dans les études portant sur les interactions de signalisation. Ici nous avons utilisé un système de culture oxygéné sans sérum et montrons que les embryons mi-gestation souris en culture pour 16-40 h présentent développement morphologique comparable à des embryons en développement in utero.

Souris développement embryonnaire dans tout un système de culture d&#39;embryons sans sérum

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

mouse-embryonic-development-serum-free-whole-embryo-culture

Research

JoVE Journal

Biology

25.6K vues.  University of Georgia.  Sérum utilisé dans les cultures d'embryons contient des composants inconnus qui peuvent affecter le résultat d'expériences en particulier dans les études portant sur les interactions de signalisation. Ici nous avons utilisé un système de culture oxygéné sans sérum et montrons que les embryons mi-gestation souris en culture pour 16-40 h présentent développement morphologique comparable à des embryons en développement in utero. 

Vidéo: Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

Culture et entretien des cellules souches embryonnaires humaines

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Recherche

Biologie

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of the lung endoderm with its surrounding mesenchyme and mesothelium. Lung mesenchyme has been shown to be the source of inductive signals for lung branching morphogenesis. Epithelial-mesenchymal-mesothelial interactions are also critical to embryonic lung morphogenesis. Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system (in the absence of maternal influence and blood flow). More importantly this technique can be readily done in a serumless, chemically defined culture media. Gain and loss of function can be achieved using expressed proteins, recombinant viral vectors and/or analysis of transgenic mouse strains, antisense RNA, as well as RNA interference gene knockdown.

Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system.

Culture poumon embryonnaire de la souris, un système pour évaluer les mécanismes moléculaires des Branching

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Une Ex-ovo- Poulet embryonnaire du système de culture approprié pour les applications d&#39;imagerie et de microchirurgie

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

La méthode de culture des embryons rongeurs entier en utilisant le système des rotateurs de type flacon de culture

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice. HYPERStack vessels allow closed system scale up from the current stacked plate products and delivers >2.5X more cells in the same volumetric footprint. The HYPERStack vessels function via gas permeable material which allows gas exchange to occur, therefore eliminating the need for internal headspace within a vessel. The elimination of headspace allows the compartment where cell growth occurs to be minimized to reduce space, allowing more layers of cell growth surface area within the same volumetric footprint.
For many applications such as cell therapy or vaccine production, a closed system is required for cell growth and harvesting. The HYPERStack vessel allows cell and reagent addition and removal via tubing from media bags or other methods.
This protocol will explain the technology behind the gas permeable material used in the HYPERStack vessels, gas diffusion results to meet the metabolic needs of cells, closed system cell growth protocols, and various harvesting methods.

An Introduction into the technology, protocol and handling of the Corning HYPERStack Vessels and accessories used for high yield adherent cell culture. The protocol will show how to use the closed system vessels for increasing cell harvesting over current stacked plate products.

Fermé protocole Culture Cell System utilisant des navires HyperStack avec la technologie des matériaux perméables au gaz

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

Whole-Mont analyse immunohistochimique à la vascularisation cutanée Limb embryonnaires: un modèle pour l&#39;étude vasculaire morphogenèse de branchement de l&#39;embryon

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Un système d&#39;<em&gt; Ex vivo</emLa culture&gt; de pancréas embryonnaire

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Méthode de la culture pour le embryonnaire Souris Coeur

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Système de culture à étudier la thyroïde développement

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Souris foetal entier Intestin Système de culture pour<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Manipulation des voies de signalisation et d&#39;imagerie en direct en trois dimensions du développement des villosités