Name: neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture
Uploaded: 2015-05-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture at JoVE.com

Work was funded by a Development and Promotion of Science and Technology scholarship from the Thai Ministry for Education to W.W. and grants from Tenovus and the Anonymous Trust to M.P.S.

1. Medya Hazırlık Not:: 1 oranında, tipik olarak 1, B27 eki ile takviye modifiye N2 ek ve Neurobasal ile desteklenmiş DMEM / F12: Protokol iki ayrı ortam karışımı kullanımına dayanır. <ol><li> 15 ml&#39;lik bir tüp içinde bileşenlerin karıştırılması ile değiştirilmiş N2 ek hazırlayın. Vorteks veya bu filtre etmeyin; çözüm netleşene kadar tersini tüp karıştırın. <ol><li> Daha sonra, (0.01 M HCl içinde yapılır) 25 mg / ml insülin 1 ml ilave edilir ve tersini tüp iyice karıştırın, DMEM / F12 içinde 7.2 ml pipetleme başlayın. Çözelti berrak olana kadar bu birkaç dakika sürer. </li><li> (Su içinde oluşan), 100 mg, 1 ml / ml apo-transferrin, mi progesternone (etanol içinde oluşan) / 0.6 mg 33 ul, 160 mg / ml (1 M), putreskin, 100 ul (su içinde yapılan ), 10, su içinde yapılır 3 mM sodyum selenit () ve% 7.5 sığır serum albümini 666 ul ul ve de tüp karıştırın. -20 ° 2.5 ml kısım ve mağaza2 aya kadar ısıtılır. </li></ol></li><li> Ortamı hazırlayın. <ol><li> DMEM / F12 içinde 250 ml&#39;lik bir N2 2.5 ml. İyice karıştırın ama sallamak ya da filtre yoktur. </li><li> Neurobasal 250 ml&#39;lik ortam B27 ek 5 ml ekleyin. İyice karıştırın ama sallamak ya da filtre yoktur. </li><li> : 1 oranında bir 1 adım 1.2.1 ve 1.2.2 medya karıştırın. 1 Bazı durumlarda: 3 karışım gerekebilir (: Adım 1.2.4 1 mix 1 olarak desteklenmiş). </li><li> Karışımına L-glutamin (son konsantrasyon 0.2 mM) ve 2-merkaptoetanol (nihai konsantrasyon 0.1 mM) 3.5 ul 0.5 ml ilave edilir ve çalkalamadan iyice karıştırın. En fazla 3 hafta boyunca 4 ° C&#39;de muhafaza edilir ve ortam ışığına maruz kaçının. Bu son karışım N2B27 olarak adlandırılır. </li></ol></li><li> Jelatin çözeltisi hazırlayın. <ol><li> 15 dakika boyunca, 121 ° C, 15 psi, ultra saf su ve otoklav içinde% 1 jelatin çözeltisi hazırlayın. Bunun için kullanılan şişe deterjan veya dezenfektan tamamen temiz olması önemlidir, bu yüzden yeni bir şişe tavsiye edilirBu işlem için kullanılan ve sadece hiç kullanımlar arasında, aşırı saf su içinde çalkalanır. 50 ml&#39;lik miktarlar halinde% 1 çözeltisi eş-payı ve ay için 4 ° C&#39;de tutun. </li><li> Çözülene kadar 37 ° C su banyosu içinde,% 1 jelatin bir kısım ısıtın ve ılık fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) 500 ml ekle. İyice karıştırın ve iyi ya da plaka her alt karşılamak için yeterli pipetlemeyin. En az 30 dakika süreyle kaplamak için jelatin satıh izin verir. </li></ol></li></ol> 2. Hücreler Kaplama NOT: Bu protokol, lösemi önleyici faktör (LİF), LİF ve kemik morfogenetik protein 4 (BMP4) veya MEK ve GSK3 inhibitörlerinin (2R ortam) sahip LIF ve serumsuz ortam ile, serum yerine% 10 serum içinde yetiştirilen fare ESC için de geçerlidir veya LİF yoktur. Bununla birlikte, farklılaşma zamanlaması ve verimlilik ortam ve hücreler (tartışmaya bakınız) bağlı olarak değişebilir. Burada gösterilen deneyler için biz bir EGFP muhabiri o içine çaldı vardır (46C fare ESC hattını kullanılan% 10 serum ve LİF ile GMEM yetiştirilen endojen Sox1 allel NE). En iyi sonuçlar için, hücreler ayrılmış ve N2B27 ortam içinde yeniden kaplanmıştır olması önemlidir; N2B27 zaman hücrelerin şarjı ile karşılaştırıldığında daha düşük bir farklılaşma verimi ile sonuçlanır basitçe GMEM / serum / LİF ortamların değiştirilmesi. <ol><li> % 10 serum, 1 mM sodyum piruvat, 1 x esansiyel olmayan amino asitler ile GMEM hücreler büyümek 0.1 M 2-merkaptoetanol ve 100 birim / ml LİF 13. Fare ESC, plaka SUBCONFLUENT kültürünü almak için 2 götürecek bir T25 kültür balona 1 x 10 6 hücre - 3 gün. </li><li> Aydınlık alan mikroskobu altında hücreleri gözlemleyin. Hücreler geçişine SUBCONFLUENT ve hazır olduğunuzda, PBS içinde iki kez yıkayın. Hücre ayrışma reaktifi 1 ml ilave edilir ve 2 için inkübatöre geri - 5 dak. Tripsin ve diğer enzimler de hücre ayrılma için kullanılabilmesine rağmen kaplama yoğunlukları olması gerekir, bu yüzden onlar Adju hücre eki üzerinde olumsuz bir etkisi olabilirsted. </li><li> Hücreler plaka kaldırmaya başlıyor sonra, tek bir hücre süspansiyonu içine çıkarmak için gemi dokunun. 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü içine ortam ve hücre ayrışma reaktif ve pipet 10 ml toplam içine hücreleri toplamak. </li><li> Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g&#39;de hücreleri dönerler. </li><li> Dikkatle süpernatant aspire ve aşağı 3 yukarı pipetleme tarafından önceden ısıtılmış N2B27 10 ml pelletini - 5 kez. Aşağı süspansiyon pipetleme yaparken, tüpün kenarına pipet hava kabarcıkları oluşturarak önlemek için. Otomatik hücre sayacı veya haemocytometer ile hücre sayımı ve konsantrasyon kaydedin. </li><li> Birim hacim başına hücre istenen sayıda ihtiva eden bir hücre süspansiyonu önceden ısıtılmış N2B27 içinde oyuk başına kaplama için hazırlayın. 6-çukurlu tabak cm2 başına 10,500 hücre olan bir yoğunlukta (yani, 6-çukurlu tabak oyuk başına 1 x 10 5 hücre) en uygunudur. Cm2 ve pla başına hücre önerilen sayıda Tablo 1&#39;e bakınızHücre kültürü damarlarının çeşitli ting medya hacimleri. </li><li> Kültür kabından jelatin aspire ve Tablo 1&#39;de önerilen yoğunluğu ve hacmine göre hücre süspansiyonu plaka. Bu merkeze hücreleri konsantre olacak gibi plakaları girdap etmeyin. 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 de nemli bir inkübatörde kültür yerleştirin. </li><li> Taze N2B27 ile tüm medya değiştirerek 2 gün - her 1 ortam değiştirin. Pipet hafifçe yoğunluğunu etkiler ve önümüzdeki günlerde farklılaşma verimliliği azaltmak olabilir hücreleri kızarma olarak. Kaplama sonraki ilk canlılık yoksul olduğu durumlarda, 1 hücreleri plaka: N2 ve B27-desteklenmiş medya 3 karışımı ve ilk iki gün sonra N2B27 bu değiştirin. Hücreler ayırt başlayacak ve 4 içinde (burada kullanılan 46C hücre hattında muhabiri yeşil floresan görünür) Sox1 ifadesini göstermesi gerekir - 6 gün. </li></ol> 3. Immunofluorescent Boyama HAYIRTE: protokol her gemi tipine uygulanabilir. her reaktif hacmi 6-çukurlu plaka içinde çukur başına anlatılan herhangi bir yüzey alanına ölçeklendirilebilir. Şarjı sonradan düşük canlılığı nedeniyle tavsiye edilmez. <ol><li> Farklılaşma Ortamı çıkarın ve 4,% 500 ul (h / h) paraformaldehit eklenerek hücrelerin tespit, 15 dakika boyunca bırakın. </li><li> Yıkayıp ((hac / hac) Tween-20% 0.5 fosfat tamponlu tuzlu su), iki kez PBS-T 2 ml hücre geçirgenliği. Hücreler, 4 ° C&#39;de 2 aya kadar PBS-T içinde tutulabilir. </li><li> % 10 (sekonder antikor ile aynı türden) (v / v) serumu ile PBS-T, 1 ml PBS-T değiştirin. Herhangi bir spesifik olmayan bağlanma bloke etme oda sıcaklığında levha rocker 1 saat inkübe edin. </li><li> 1 saat sonra, PBS-T 2 ml hücreler iki kez yıkayın ve βIII-tubulin karşı 500 ul fare IgG inkübe (:% 10 serum ile PBS-T içinde 1000: 1 seyreltilmiş). Plaka rocker koyun ve 4 ° C&#39;de O / N bırakın. </li><li> Bu adımdan itibaren, her zaman gemiyi korumakışıktan. Daha sonra (% 10 serum ile PBS-T içinde 2 ug / ml&#39;ye seyreltilmiş) floresan-etiketli anti-fare IgG antikoru 500 ul PBS-T ile hücreler iki kez yıkanır. Oda sıcaklığında 1 saat plaka rocker koy. </li><li> Daha sonra DAPI 500 ul PBS-T ile hücreler iki kez yıkayın (PBS-T içinde 0.5 ug / ml&#39;ye seyreltilmiş) ve 5 dakika boyunca bırakın. </li><li> Tekrar hücreleri yıkayın ve PBS-T saklayın. Hücreler çekilmeye hazır olduğunu ve 4 ° C&#39;de 2 haftaya kadar saklanabilir. Bu sabit ve canlı hücre ya da farklı zamanlarda, sabit hücrelerde GFP yoğunluğunu karşılaştırma uygunsuz şekilde GFP sinyali, zaman içerisinde kaybolur edin. </li></ol>

<ol>
	<li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo-derived+stem+cells:+of+mice+and+men.">Embryo-derived stem cells: of mice and men.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).</li><li>Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+express+neuronal+properties+in+vitro.">Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro.</a> Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).</li><li>Fraichard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro.+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+glial+cells+and+functional+neurons.">In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons.</a> J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).</li><li>Strubing, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+into+the+neuronal+lineage+in+vitro+gives+rise+to+mature+inhibitory+and+excitatory+neurons.">Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons.</a> Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).</li><li>Stavridis, M. P., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Neural differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).</li><li>Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+embryonic+stem+cells+into+neuroectodermal+precursors+in+adherent+monoculture.">Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture.</a> Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).</li><li>Ying, Q. L., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+conditions+for+neural+commitment+and+differentiation.">Defined conditions for neural commitment and differentiation.</a> Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).</li><li>Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+discrete+period+of+FGF-induced+Erk1/2+signalling+is+required+for+vertebrate+neural+specification.">A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification.</a> Development. 134, 2889-2894 (2007).</li><li>Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+orchestrates+fibroblast+growth+factor+signalling+to+drive+embryonic+stem+cell+differentiation.">Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation.</a> Development. 137, 881-890 (2010).</li><li>Speakman, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+O-GlcNAc+Levels+Activate+Epigenetically+Repressed+Genes+and+Delay+Mouse+ESC+Differentiation+Without+Affecting+Naive+to+Primed+Cell+Transition.">Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition.</a> Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).</li><li>Kunath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+stimulation+of+the+Erk1/2+signalling+cascade+triggers+transition+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+from+self-renewal+to+lineage+commitment.">FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment.</a> Development. 134, 2895-2902 (2007).</li><li>Dani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+induction+of+stem+cell+renewal+by+LIF-deficient+cells:+a+new+ES+cell+regulatory+pathway.">Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway.</a> Dev Biol. 203, 149-162 (1998).</li><li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+differentiation+of+embryonic+stem+cells.">Culture and differentiation of embryonic stem cells.</a> Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).</li><li>Aubert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+mammalian+neural+genes+via+fluorescence-activated+cell+sorter+purification+of+neural+precursors+from+Sox1-gfp+knock-in+mice.">Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 11836-11841 (2003).</li><li>Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+is+mediated+via+activation+of+STAT3.">Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3.</a> Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).</li><li>Silva, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+pluripotency.">Capturing pluripotency.</a> Cell. 132, 532-536 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

tek tabaka sinir farklılaşma protokolü on üzerinden 6 kullanımda olmuştur. Protokol tanımlanan ortam oluşan ve pratik için sistem daha uygulanabilir kılan bir tek-tabakalı sistemde yapılır, yüksek verimli (örneğin, ilaç tarama) kullanır. Ancak, farklılaşma etkinliğini belirleyen bazı kritik faktörler vardır. Bu makalede, bu faktörleri ve her engel için çözüm işaret ediyor. Farklılaşma durumu kaplama sonrası hücrelerin yoğunluğu belki de...

Embriyonik kök hücreler, sinjeneik ya da bağışıklık yetersizliği konaklara (a Kimera oluşturarak) uygun bir aşamada embriyo yeniden yerleştirilmesi, aşağıdaki tüm yetişkin hücre tiplerine farklılaşma yetisine, enjeksiyon koruyarak, in vitro olarak sonsuza çoğalma kapasitesi ile erken embriyodan türetilen pluripotent hücreler (Bir teratom oluşturarak) ya da uygun işaretlere 1 in vitro konu. Nöral soy içine fare embriyonik kök hücrelerinin in vitro farklılaşması ve 1995 tarif edilmiştir ve morfojen retinoik asit ile takviye edilmiş 2-4 serum ihtiva eden ortam içinde çok-hücreli süspansiyon agregatların oluşumunu (embriyoid organları, EBS) yer aldı. O zamandan bu yana çeşitli protokoller nöral farklılaşma 5 izin vermek için geliştirilmiştir. Hala toplanmasını kullanmak Birçok diğerleri hücre tipleri indükleyici ile-kültür co ve çeşitli serum serbest medya kullanımını içerir. Tüm protokoller avantajlara bir olmasınd dezavantajları ve sinirsel hassas doğası veya nöronal hücreleri de kullanılan protokole göre değişir üretti. İdeal protokol, sağlam ölçeklenebilir olması ve tam olarak tanımlanmış medya ve yüzeylerde faydalanmak, farklılaşma sürecinin non-invazif izleme için uygun olmalı ve mümkün sinirsel atalarıdır saf popülasyonlarının nesil neden dış ipuçlarının tarafından ve ayırt desenli olmak istiyorum nispeten kısa bir süre içinde yüksek verim ve verim bütün nöronal ve glial alt tiplere. Son düzine yıllarda biz bir düşük yoğunluklu, serum serbest yapışık tek tabaka kültürü 6-10 fare ESC nöral atalarıdır ve nöronlar üretmek için bir yöntem kullanıyoruz. Bu protokol, yukarıda belirtilen kriterler içinde, birçok yerine getirir: Elimizdeki farklılaşma verimliliği oldukça uzun yıllar boyunca tutarlı ve hücre çizgileri, çeşitli olmuştur, bu yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir edilebilir (başarıyla 96 oyuklu plakalar, damar kullanımı 15 cm çapında dio kız) ve kullanılan ortam iyi tanımlanmış bulunmaktadır. süreci (dopaminerjik nöronların 6 örneğin, Shh ve FGF8) nöronal alt tiplerinin farklı tiplerinin üretimini indüklemek için ilave edilebilir farklılaşma izlenmesi ve desen ipuçlarının çeşitli timelapse mikroskopi elverişlidir. Yine, bu protokolün başarılı bir uygulama için bazı zorluklar vardır. Anahtar yönlerinden biri medyanın dikkatli bir hazırlık olduğunu. Biz her zaman ticari alternatiflerin varlığına rağmen içi ortam hazırlar. Kullanılan takviyeleri biri (N2; Protokolü bakınız) standart piyasada mevcut sürümleri üzerinde değişiklikler vardır. Son olarak, bu yöntemin başarılı bir uygulama için en önemli adımlardan biri kaplama optimum hücre yoğunluğudur. Uyaran sinyallerin biri (Fgf4 11) otokrin yapısı gerektirirken, bu yeterli hücre uygun viabil izin vermek için mevcut olması esas olarakçok yüksek yoğunlukları farklılaşma de Sığ ve farklılaşma, (nedeniyle LIF 12 otokrin üretimine muhtemelen kısmen) bozulur. Hem medya hazırlama ve hücre kaplama özenle yapılır ve sürekli optimum sonuçlar sağlamak için bu nedenle önemlidir.

<table><tbody><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement, serum free</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td>Reconstitute with sterile 0.01 M HCl</td></tr><tr><td>Apo-transferrin</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td>Reconstitute with sterile water</td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td>Reconstitute with ethanol</td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td>Reconstitute with sterile water</td></tr><tr><td>Sodium selenite</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td>Reconstitute with sterile water</td></tr><tr><td>Bovine albumin fraction V</td><td>Life Technologies</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented</td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>6-well tissue culture dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>24-well tissue culture dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>96-well tissue culture dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>GMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-essential amino acids solution</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Leukaemia inhibitory factor</td><td>prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>Protect from light</td></tr><tr><td>Mouse anti &amp;beta;III tubulin IgG antibody</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence-labelled anti-mouse IgG antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A31571</td><td>Protect from light</td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; tissue culture flask</td><td>Thermo Scientific</td><td>156367</td><td></td></tr></tbody></table>

neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture

nöral progenitörlerin fare embriyonik kök hücreleri ayırt etmek yeteneği (ESC) nöral özellikleri yanı sıra, daha fazla çalışma için olgun nöral hücre tiplerinin üretimini kontrol eden mekanizmaların çalışmasını sağlar. Bu protokolde serum serbest, tek tabaka kültürü kullanarak sinir atalarıdır için ESC farklılaşması için bir yöntem açıklanmaktadır. yöntem, etkili, ölçeklenebilir ve 4 içinde% 70 nöral projenitör hücrelerinin ~ üretimi ile sonuçlanır - 6 gün. Bu, çeşitli koşullar altında yetiştirilen çeşitli suşlardan ESC uygulanabilir. Sinir progenitörler, mikroskopla fonksiyonel nöronlar ve glia veya analiz içine daha ayırt sitometri veya moleküler teknikler akmasına izin verilebilir. farklılaşma süreci zaman atlamalı mikroskopi için uygun olduğunu ve nöral şartname sürecini izlemek üzere raportör hatlarının kullanımı ile kombine edilebilir. Biz sürecin b izin medya hazırlanması ve hücre yoğunluğu optimizasyonu hakkında ayrıntılı yönergeler sağlarE en ESC hatları ve hücre kültür kapları çeşitli uygulanan.

Bu deneyde, nöral farklılaşma izlemek için, bir endojen Sox1-GFP raportör ile, fare embriyonik kök hücreleri 46C hücre hattı 14 kullanılır. Sox1 nöral progenitor için bir marker Bu hücre hattı, ifade kullanılarak, yeşil floresan tespit edilebilir. Yoğunluğu Kaplama nöronal farklılaşma elde etmek için kritik bir faktördür. Fare embriyonik kök hücreleri / cm2 10,500 88.500 hücre arasında değişen farklı yoğunluklarda 6-çukurlu plaka içinde plakalanmıştır. ...

Watch this Scientific Journal Video about Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture at JoVE.com

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Serum serbest Tek tabakalı Kültüründe Fare Embriyonik Kök Hücre Sinir Farklılaşma

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

neural-differentiation-mouse-embryonic-stem-cells-serum-free

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.0K Görüntüleme.  University of Dundee. This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Video: Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

İki ve Üç boyutlu Embriyoid Oluşumu Fare Embriyonik Kök Hücreler Retinoik Asit kaynaklı sinir Farklılaşma analizi

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Gelişim Biyolojisi

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Tek Hücre Kültürünü Kullanarak Etkin Nöral Farklılaşma

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

Nöral Progenitörlerin ve Nöronların Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Farklılaşması ve Karakterizasyonu

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to screen new drug compounds, and to develop new therapies for motor neuron diseases such as spinal muscular atrophy (SMA) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Many current protocols use a combination of retinoic acid (RA) and sonic hedgehog (Shh) to differentiate mouse embryonic stem (mES) cells into motor neurons1-4. However, the differentiation efficiency of mES cells into motor neurons has only met with moderate success. We have developed a two-step differentiation protocol5 that significantly improves the differentiation efficiency compared with currently established protocols. The first step is to enhance the neuralization process by adding Noggin and fibroblast growth factors (FGFs). Noggin is a bone morphogenetic protein (BMP) antagonist and is implicated in neural induction according to the default model of neurogenesis and results in the formation of anterior neural patterning6. FGF signaling acts synergistically with Noggin in inducing neural tissue formation by promoting a posterior neural identity7-9. In this step, mES cells were primed with Noggin, bFGF, and FGF-8 for two days to promote differentiation towards neural lineages. The second step is to induce motor neuron specification. Noggin/FGFs exposed mES cells were incubated with RA and a Shh agonist, Smoothened agonist (SAG), for another 5 days to facilitate motor neuron generation. To monitor the differentiation of mESs into motor neurons, we used an ES cell line derived from a transgenic mouse expressing eGFP under the control of the motor neuron specific promoter Hb91. Using this robust protocol, we achieved 51&plusmn;0.8% of differentiation efficiency (n = 3; p &lt; 0.01, Student's t-test)5. Results from immunofluorescent staining showed that GFP+ cells express the motor neuron specific markers, Islet-1 and choline acetyltransferase (ChAT). Our two-step differentiation protocol provides an efficient way to differentiate mES cells into spinal motor neurons.

We developed a new protocol to improve efficiency of in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons. The differentiated ES cells acquired motor neurons features as evidenced by expression of neuronal and motor neuron markers using immunohistochemical techniques.

Motor Nöronlar içine Fare Embriyonik Kök Hücre Verimli Farklılaşma

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Biyoloji

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

Yalıtım ve kültür embriyonik fare nöral kök hücrelerin

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Nörobilim

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Serumsuz Tüm Embriyo Kültür Sistemde Fare Embriyonik Development

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

Fare Embriyonik Kök Hücre in vitro nöronal farklılaşma

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Generating Neural Progenitors from Embryonic Stem Cells in Serum-Free Monolayer Cultures

Source: Wongpaiboonwattana, W., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52823">Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture.</a> J. Vis. Exp.(2015)
The video demonstrates a protocol that uses serum-free media to generate neural progenitors from mouse embryonic stem cells. The desired concentration of embryonic stem cells, suspended in serum-free media, is plated on gelatin-coated coverslips. At an optimal cell density, cells produce autocrine signaling factors, which, along with the neural differentiation-inducing factors in the serum-free media, trigger the differentiation of embryonic stem cells into neural progenitors.

Serumsuz Monotabaka Kültürlerde Embriyonik Kök Hücrelerden Nöral Progenitörlerin Üretilmesi

1. Media Preparation
NOTE: The protocol relies on using a mix of two separate media: DMEM/F12 supplemented with modified N2 supplement and Neurobasal ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Nöronal Kültür Teknikleri

Gelişmiş Nöron Modelleri

Generating Cortical Interneuron Precursors From Mouse Embryonic Stem Cells

Source: Tischfield, D. J., et al <a href="https://app.jove.com/v/56358">Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video presents a method for generating cortical interneuron precursors from mouse embryonic stem cells. The protocol entails culturing the stem cells in media containing specific small molecule inhibitors, which facilitate stem cell proliferation and aggregation into embryoid bodies (EBs). Subsequently, the EBs are dissociated with enzymes and plated on culture plate wells coated with adhesion proteins to promote their differentiation into cortical interneuron precursors.

Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Kortikal İnternöron Öncüllerinin Üretilmesi

1. Media Preparation
NOTE: Warm all media to 37 &#38;#176;C before use in cell culture.

	Mouse Embryonic Fibroblast (MEF) media (for preparing 500 mL)
	
	...

Differentiating Mouse Embryonic Stem Cells into a Networked Neuron Population

Source: Hubbard, K. et al., <a href="https://app.jove.com/v/52361">Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates a technique for embryonic stem cell differentiation into a networked population of neurons with functioning synapses. It outlines the steps involved in embryonic stem cell differentiation into neurons, induction of neuronal network formation, and enrichment of the culture with networked neurons.

Fare Embriyonik Kök Hücrelerini Ağa Bağlı Bir Nöron Popülasyonuna Farklılaştırmak

1. Neuronal Differentiation
NOTE: Conduct steps 1.1 - 1.5 before noon and step 1.7 after noon. An overview of the differentiation procedures is presented ...