The authors would like to acknowledge Marcos Di Falco for his expertise and advice with the preparation of the samples for nano-LC MS/MS as well as Dr. Zoran Minic from the University of Regina for the LC MS/MS analysis. This work was supported by NSERC (DG402214-2011) and CRC (950-221184) funding. D.C. was supported by Concordia Institute for Water, Energy, and Sustainable Systems and FQRNT.

1. Préparer Réactifs <ol><li> Préparer la solution de SDS-extraction: 0,1 M Tris-HCl pH 7,5, 5% de glycerol, 10 mM d&#39;EDTA et 1% de SDS. Filtre-stériliser en utilisant un filtre de 0,22 um et stocker à 4 ° C. </li><li> Préparer les réactifs sous licence nécessaires au gel de Polyacrylamide. <ol><li> Préparer 1,5 M Tris-HCl pH 8,8. Filtre-stériliser en utilisant un filtre de 0,22 um et stocker à température ambiante. </li><li> 0,5 M de Tris-HCl pH 6,8. Filtre-stériliser en utilisant un filtre de 0,22 um et stocker à température ambiante. </li><li> Préparer 10% de SDS. Stériliser par filtration en utilisant un filtre de 0,22 um et stocker à température ambiante. </li></ol></li><li> Préparer les solutions nécessaires pour en gel digestion à la trypsine et de l&#39;extraction de peptide. <ol><li> Préparer 100 mM de bicarbonate d&#39;ammonium. Filtre-stériliser en utilisant un filtre de 0,22 um et stocker à 4 ° C. </li><li> Préparer 1 Les stocks M TNT. En suspension dans 100 mM bicarbonate d&#39;ammonium et conserver à -80 ° C. </li><li> Préparer 550 mm stocks iodoacétamide. Suspendu dans100 mM de bicarbonate d&#39;ammonium et conserver à -80 ° C. </li><li> Préparer 100 ng / ul stocks de trypsine. Aliquote de 60 ul dans 1,5 ml microtubes et conserver à -80 ° C. </li><li> Préparer la solution d&#39;extraction: l&#39;acide formique à 1%, 2% d&#39;acétonitrile. </li><li> Préparer la solution de remise en suspension: 5% acétonitrile et de l&#39;acide formique à 0,1%. </li></ol></li></ol> 2. Effectuez lyse cellulaire dans la cartouche filtrante Unité avec cellules conservées dans la stabilisation des ARN Solution <ol><li> Expulser la solution de stabilisation de l&#39;ARN à partir de l&#39;unité de filtre à cartouche (1,5 ml) et dans un tube de microcentrifugeuse de 2 ml en utilisant une seringue de 60 ml attaché à l&#39;extrémité du luer-lock du filtre. </li><li> Centrifuger le tube de microcentrifugation de 2 ml pendant 10 min à 17 000 x g pour sédimenter les débris cellulaires. Ceci est fait de telle sorte que le filtre à l&#39;étape 2.3 ne bouche pas. </li><li> Transférer le surnageant dans une unité de filtre ultracentrifugation 10 K pour capturer des protéines provenant de cellules qui ont lysé provenant de la congélation / thaw de l&#39;échantillon. Ne pas jeter le culot. Il sera utilisé dans l&#39;étape 2.5. Effectuer centrifugation de l&#39;unité de filtre ultracentrifugation à 3270 xg pendant 30 min ou jusqu&#39;à ce que le volume soit réduit à 600 ul. </li><li> Faire fondre la pointe d&#39;une pointe de p10 et de bloquer le côté non luer-lock de l&#39;unité de filtration à cartouche avec l&#39;extrémité ouverte de la pointe. Cela permettra d&#39;assurer qu&#39;aucun tampon d&#39;extraction et de la biomasse échappe lors des étapes 2,5-2,7. </li><li> Suspendre le culot dans 1 ml de solution SDS-extraction et la pipette dans l&#39;unité de filtration à cartouche originale. La meilleure façon de pipette dans l&#39;unité de filtration à cartouche est d&#39;empiler une pointe de P200 sur une pointe de p1000 et utiliser cette double pointe pour pipetage. </li><li> Ajouter 1 ml de solution d&#39;extraction SDS à l&#39;unité de filtre à cartouche de sorte que le volume total est d&#39;environ 2 ml et incuber pendant 10 min à la température ambiante tout en tournant dans un four à hybridation. Placer 3 essuie laboratoire froissé au fond d&#39;un tube conique de 50 ml. Parafilm deux extrémités de l&#39;unité de filtre à cartouche ferméeet mettre l&#39;unité de filtre à cartouche dans le tube de 50 ml. Fermer le couvercle et mettre le tube dans le four d&#39;hybridation. </li><li> Après 10 min lieu filtrer le Sterivex sur un flotteur en mousse et fixez-le en place avec une seringue de 5 ml sur la fin de luer-lock. Flotter et incuber dans un bain-marie à 95 ° C pendant 15 min. </li><li> Soit l&#39;unité de filtre à cartouche froide et tourner à la température ambiante pendant une heure (comme à l&#39;étape 2.6). </li><li> Expulser la solution d&#39;extraction / SDS lysat cellulaire sur le filtre avec 60 ml d&#39;une seringue dans la même unité de filtre ultracentrifugation comme précédemment (étape 2.3). Ajouter 1 ml de solution fraîche d&#39;extraction SDS à l&#39;unité de filtration à cartouche et mélanger pendant 30 secondes à la main, puis expulser dans l&#39;unité de filtre ultracentrifuge aide de la seringue de 60 ml. Ceci est pour rincer l&#39;unité de filtre à cartouche pour assurer que toutes les protéines ont été enlevées. </li><li> Effectuer centrifugation sur l&#39;unité de filtre ultracentrifugation pendant 45 min à 3270 x g ou jusqu&#39;à ce que le volume dans l&#39;unité de filtre est inférieur à 600 ul. </li><li> Jeter l&#39;effluent et le haut de l&#39;unité de filtre ultracentrifugation par une solution fraîche SDS-extraction. </li><li> Centrifuger l&#39;unité de filtrage pour un autre 45 min à 3270 x g. </li><li> Répétez les étapes 2.11 et 2.12 fois plus. Assurer le volume final dans l&#39;unité de filtration ultracentrifugation est au plus 600 pi à la fin de l&#39;essorage final. </li><li> À ce stade, le concentré diviser en deux. Une fraction sera utilisé pour la précipitation de l&#39;ADN et l&#39;autre pour la précipitation des protéines. Remarque: Le montant de fractionnement dépend de la quantité de biomasse qui a été filtré et les utilisations prévues des produits. Dans notre cas, nous avons divisé le concentré avec 10% vers des précipitations de l&#39;ADN et à 90% par la précipitation des protéines. </li></ol> 3. précipitation des protéines <ol><li> Ajouter 4 volumes de methanol: acétone (50:50) à un volume de concentré et vortex pendant 10 s. Incuber pendant la nuit à -20 ° C. </li><li> Isoler à 17.000 g pendant 30 min. Décanter le surnageantet laissez le culot (peut être invisible) sec dans un speedvac pendant 1 heure (ou jusqu&#39;à ce que sec). Note: Ne pas trop sécher le culot car cela pourrait rendre difficile pour remettre en suspension. </li><li> Suspendre le culot dans 25 ul de solution SDS-extraction. Laisser reposer pendant une heure, puis remettre en suspension par pipetage de haut en bas. </li><li> Quantifier la protéine en utilisant un kit de dosage de protéine et les instructions du fabricant. </li></ol> 4. ADN Précipitations <ol><li> Ajouter une solution de SDS-extraction de la fraction de concentré pour être utilisé pour l&#39;ADN précipitation jusqu&#39;à la marque de 500 pi. Cette étape consiste simplement à augmenter le volume de la solution, ce qui rend plus facile de travailler avec. </li><li> Ajouter 0.583 volumes d&#39;un réactif de précipitation de protéines (telles que la protéine MPC réactif de précipitation) et vortex pendant 10 s. Vous devriez voir une forme de précipité blanc. Note: Nous avons également utilisé le phénol: méthodes d&#39;extraction d&#39;ADN chloroforme, mais il est plus difficile en raison des faibles volumes. Nous avons obtenu de meilleurs rendements d&#39;ADN en utilisant laMPC précipitation des protéines réactif. </li><li> Centrifuger à 17 000 x g et 4 ° C pendant 10 min. </li><li> Transférer le surnageant dans un autre tube de 1,5 ml et ajoutez 0,95 volumes d&#39;isopropanol. Inversez 30-40 fois. </li><li> Centrifuger pendant 10 min à 4 ° C à la vitesse maximale. </li><li> Décanter avec soin et jeter le surnageant. </li><li> Rincer deux fois avec 750 pi d&#39;éthanol à 70%. </li><li> Retirer autant que possible l&#39;éthanol par pipetage, puis laissez sécher à l&#39;air. Note: Ne pas trop sécher l&#39;ADN comme cela peut rendre difficile de remettre en suspension. </li><li> Remettre en suspension dans 25 ul de tampon TE faible, pH 8 (10 mM de Tris-HCl, 0,1 mM d&#39;EDTA). </li><li> Quantification de l&#39;ADN en utilisant un kit de dosage d&#39;ADNdb et les instructions du fabricant. Effectuer gel d&#39;agarose électrophorèse (1%) sur 3 pi de l&#39;ADN pour vérifier sa qualité. </li></ol> 5. Gel SDS-PAGE de protéines <ol><li> Préparer un tampon d&#39;échantillon (950 pi de tampon d&#39;échantillon de Laemmli et 50 pi de β-mercaptoéthanol). &lt;/ li&gt; <li> Ajouter le volume correspondant à 15 pg de protéine, ou un maximum de 20 pi à un volume égal de tampon d&#39;échantillon et faire bouillir pendant 4 min. Les échantillons peuvent maintenant être stockés à -80 ° C jusqu&#39;à SDS-PAGE peut être effectuée. </li><li> Préparer 10% d&#39;acrylamide résoudre gel avec un gel d&#39;empilement acrylamide à 5%. </li><li> Chargez le gel avec des échantillons et 4 ul d&#39;une échelle de protéines. Exécutez le gel à 120 V constante jusqu&#39;à ce que le marqueur de 250 kDa échelle vient d&#39;atteindre le gel de résolution. </li><li> Colorer le gel en utilisant un Coomassie base selon les instructions du fabricant. </li></ol> 6. Dans gel trypsine Digest et Peptide Extraction Remarque: Toutes les étapes d&#39;ici jusqu&#39;à ce que 6.10 sont effectuées dans une enceinte de sécurité biologique pour minimiser la contamination. <ol><li> Coupez l&#39;excédent de gel sous la barre des 10 kDa échelle pour chaque voie. Chaque voie sera analysé sur la MS / MS séparément. Couper chaque piste en 1 mm x 1 mm carrés pour augmenter la surface et de placer tous squares de la voie dans un tube à faible liaison micro-centrifugeuse. Répétez cette opération pour toutes les voies. (Acide acétique à 1% peut être utilisé pour prévenir le gel de se dessécher et de devenir difficile à couper). Remarque: minimiser la contamination est essentiel à ce stade, de sorte gel tranchage est effectué dans une enceinte de sécurité biologique sur le verre SDS-PAGE moule de gel utilisé pour fabriquer le gel. </li><li> De-taches <ol><li> Distribuer 50 pi de bicarbonate d&#39;ammonium 100 mM dans chaque tube à faible liaison, fermer le bouchon et incuber à 37 ° C pendant 10 min. </li><li> Distribuer 50 ul d&#39;acétonitrile, fermer le bouchon et incuber à 37 ° C pendant 5 min. </li><li> Aspirer et jeter 150 pi. </li><li> Répétez les étapes 6.2.1 et 6.2.2. </li><li> Aspirer et jeter 95 pi. </li></ol></li><li> Déshydration <ol><li> Distribuer 50 pi acétonitrile, fermer le bouchon et attendre 5 min. Aspirer et jeter 45 pi et attendre 10 min. </li></ol></li><li> Réduction <ol><li> Distribuer 50 pi de DTT (10 mM, dilué dans amm 100 mMbicarbonate onium), fermer le bouchon et attendre 30 min à 37 ° C. </li></ol></li><li> Alkylation <ol><li> Distribuer 50 ul d&#39;iodoacétamide (55 mM, dilué dans du bicarbonate d&#39;ammonium 100 mM), fermer le bouchon et attendre 20 min à 37 ° C. </li><li> Distribuer 100 ul d&#39;acétonitrile, fermer le bouchon et incuber pendant 5 min à 37 ° C. Aspirer et jeter 195 pi. </li></ol></li><li> lavage <ol><li> Distribuer 50 pi de bicarbonate d&#39;ammonium, fermer le bouchon et incuber pendant 10 min à 37 ° C. </li><li> Distribuer 50 ul d&#39;acétonitrile, fermer le bouchon et incuber à 37 ° C pendant 5 min. Aspirer et jeter 120 pi. </li></ol></li><li> Déshydration <ol><li> Distribuer 50 pi acétonitrile, fermer le bouchon et attendre 5 min. Aspirer et jeter 45 ul. </li><li> Distribuer 50 ul d&#39;acétonitrile, attendez 5 min. </li><li> Aspirer et jeter 75 pi et attendre 5 min. </li></ol></li><li> Digestion <ol><li> Distribuer 25-30 pi de 6 ng / ul trypsine (uusqu&#39;à tous les fragments de gel sont couverts). Fermer bouchon et attendre 30 min à température ambiante. </li><li> Incuber pendant la nuit (4,5 heures minimum) à 37 ° C. </li><li> Laisser reposer à la température ambiante pendant 30 min. </li></ol></li><li> Extraction et transfert Peptide <ol><li> Distribuer 30 pi de solution d&#39;extraction et couvrez avec le couvercle pendant 30 minutes sur la glace. </li><li> Aspirer 30 pi et distribuer le volume aspiré dans un nouveau tube à faible liaison marqué. </li><li> Distribuer 12 ul de la solution d&#39;extraction et de 12 ul d&#39;acétonitrile dans le tube initial (par gel). Fermer capuchon et incuber pendant 30 min sur la glace. </li><li> Aspirer 15 pi et le dépôt dans le nouveau tube. </li><li> Répétez les étapes (6.9.3 et 6.9.4). </li></ol></li><li> Placez nouveaux tubes dans un SpeedVac jusqu&#39;à sec. </li><li> Remettre en suspension dans 50 ul de solution de remise en suspension. Vortex sur milieu pendant 10 min pour remettre en suspension. </li><li> Solution de peptide de la pipette dans des flacons soit des nano LC / ou des plaques à 96 puits appropriés pour la nano / LCTravail MS / MS. </li></ol>

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H., Olsen, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature protocols. 1 (6), 2856-2860 (2007).</li><li>Thomas, T., Gilbert, J., Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomics+-+a+guide+from+sampling+to+data+analysis.">Metagenomics - a guide from sampling to data analysis.</a> Microbial Informatics and Experimentation. 2 (1), 3 (2012).</li><li>Huson, D. H., Auch, A. F., Qi, J., Schuster, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEGAN+analysis+of+metagenomic+data.">MEGAN analysis of metagenomic data.</a> Genome research. 17 (3), 377-3786 (2007).</li><li>Huson, D. H., Mitra, S., Ruscheweyh, H. -. J., Weber, N., Schuster, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+analysis+of+environmental+sequences+using+MEGAN4.">Integrative analysis of environmental sequences using MEGAN4.</a> Genome research. 21 (9), 1552-1560 (2011).</li><li>Ea Ottesen, ., Marin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metatranscriptomic+analysis+of+autonomously+collected+and+preserved+marine+bacterioplankton.">Metatranscriptomic analysis of autonomously collected and preserved marine bacterioplankton.</a> The ISME journal. 5 (12), 1881-1895 (2011).</li><li>Feike, J., J&#252;rgens, K., Hollibaugh, J. T., Kr&#252;ger, S., Jost, G., Labrenz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+unbiased+metatranscriptomics+in+suboxic+waters+of+the+central+Baltic+Sea+using+a+new+in+situ+fixation+system.">Measuring unbiased metatranscriptomics in suboxic waters of the central Baltic Sea using a new in situ fixation system.</a> The ISME journal. 6 (2), 461-470 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Exemple de préservation est essentielle pour metaproteomic études et des travaux antérieurs ont démontré que la solution de stabilisation de l&#39;ARN est un tampon de stockage pour stocker des cellules utile avant l&#39;extraction des protéines 28. Idéalement, les échantillons seraient conservés in situ pour annuler des changements dans l&#39;expression des protéines pendant la manipulation 33,34. En effet, in situ technologies d&#39;échantillonnage et de fixation ont ...

Les microorganismes sont omniprésents et jouent des rôles essentiels dans les cycles biogéochimiques de la Terre 1. Actuellement, il existe de nombreuses approches moléculaires disponibles pour caractériser la structure de la communauté microbienne et la fonction. La plus courante est l&#39;analyse du gène ARNr 16S séquences amplifié par PCR de l&#39;ADN de l&#39;environnement 2 - 4. Un inconvénient de l&#39;analyse du gène ARNr 16S est qu&#39;elle ne fournit des informations sur l&#39;identité phylogénétique et structure de la communauté, avec peu d&#39;informations sur la fonction métabolique. En revanche, les approches telles que la métagénomique, metatranscriptomics et métaprotéomique fournissent des informations sur la structure des communautés et le métabolisme. La métagénomique, ou l&#39;analyse de la teneur en gène d&#39;un assemblage d&#39;organismes, fournit des informations sur la structure et le potentiel fonctionnel de la communauté 5-8. Bien que puissant, ce potentiel fonctionnel peut ne pas correspondre à la métaboliqueactivités des organismes. Le génotype d&#39;un organisme est représenté par ses gènes, dont chacun peut être transcrit en ARN et traduit en outre à la protéine, ayant pour résultat un phénotype. Ainsi, pour aider à la compréhension de l&#39;activité fonctionnelle microbienne dans un milieu, l&#39;analyse post-génomique doit être effectué neuf. Metatranscriptomics, ou l&#39;analyse des transcrits d&#39;ARN est utile car elle révèle que gènes sont transcrits dans un environnement donné. Cependant, les taux d&#39;ARNm ne correspondent pas toujours aux niveaux correspondants de protéines due à une régulation de la traduction, la demi-vie d&#39;ARN, et le fait que des copies multiples de la protéine peuvent être générées pour chaque ARNm 10. Pour ces raisons métaprotéomique est maintenant reconnu comme un outil important pour la microbiologie environnementale. Metaproteomic commune analyses utiliser une approche protéomique fusil de chasse où le plein complément près de protéines dans un échantillon complexe sont purifiés et analysés simultanément, généralement par le biais frla digestion zymatic en peptides et des analyses sur un spectromètre de masse. Après la spectrométrie de masse (MS / MS) &quot;empreintes de peptide» est utilisé pour déterminer la séquence des peptides et des protéines potentiel d&#39;origine par la base de données de recherche de protéines (pour une revue voir 11). Travaux protéomique a parcouru un long chemin dans les 25 dernières années grâce à l&#39;augmentation de la disponibilité de données génomiques et l&#39;augmentation de la sensibilité et la précision des spectromètres de masse permettant à haut débit l&#39;identification des protéines et la quantification 11,12. Puisque les protéines sont le produit final de l&#39;expression des gènes, les données metaproteomic peuvent aider à déterminer quels organismes sont actifs dans un environnement donné et ce que les protéines qu&#39;ils expriment. Ceci est avantageux lorsque vous essayez de déterminer comment un ensemble particulier de variables environnementales aura une incidence sur le phénotype d&#39;un organisme ou d&#39;une communauté. Dès le début, les études metaproteomic base-MS / MS dans l&#39;océan ont été utilisés pour identifier des protéines spécifiques dans ciblélignées microbiennes, avec la première étude mettant l&#39;accent sur ​​la lumière axée sur la pompe à protons protéorhodopsine dans SAR11 bactéries marines 13. Plus récemment, des analyses comparatives metaproteomic ont élucidé les profils d&#39;expression différentielle des protéines complexes entre les communautés. Les exemples incluent l&#39;identification des décalages temporels dans le métabolisme du littoral Atlantique Nord-Ouest 14 ou la péninsule antarctique 5. D&#39;autres études ont décrit des variations dans les modes d&#39;expression de protéines à travers les échelles spatiales, par exemple, le long d&#39;un transect géographique d&#39;un gyre océanique faible en éléments nutritifs à un système d&#39;upwelling côtier très productif 15. Pour de plus amples commentaires de métaprotéomique nous recommandons Schneider et al. (2010) 9 et Williams et al. (2014) 16. Protéomique ciblée a également été employés au cours des dernières années pour quantifier l&#39;expression des voies métaboliques spécifiques dans l&#39;environnement 17,18. There sont trois phases principales dans l&#39;analyse metaproteomic. La première phase est la préparation des échantillons, qui comprend la collecte de l&#39;échantillon, la lyse des cellules et la concentration de protéine. Prélèvement de l&#39;échantillon en microbiologie marine entraîne souvent la filtration de l&#39;eau de mer à travers un pré-filtre pour éliminer les cellules eucaryotes plus grandes particules et les bactéries de particules associé, suivie d&#39;une filtration pour la capture de cellules microbiennes vivant libres, communément avec l&#39;utilisation d&#39;une cartouche de 0,22 pm unité de filtre 19,20. Ces filtres sont incased dans un cylindre en plastique et une lyse cellulaire et la protéine protocole d&#39;extraction qui peut être effectuée à l&#39;intérieur de l&#39;unité de filtration, il est un outil précieux. Une fois la biomasse est obtenue, les cellules doivent être lysées pour permettre l&#39;extraction de la protéine. Plusieurs méthodes peuvent être utilisées, y compris la guanidine-HCl sulfate lyse 21 et le sodium dodécyl (SDS) méthodes de lyse à base. Bien que des détergents comme SDS sont très efficaces à perturber les membranes et solubilisation de nombreux types de protéines, concentrations dons aussi faible que 0,1% peut interférer avec la digestion des protéines en aval et l&#39;analyse MS 22. De préoccupation majeure est les effets négatifs de SDS sur l&#39;efficacité de la digestion de la trypsine, la puissance de la chromatographie inverse en phase liquide et la suppression d&#39;ions ou de l&#39;accumulation à l&#39;intérieur de la source d&#39;ions 23 résoudre. La deuxième phase est le fractionnement et d&#39;analyse, où les protéines sont soumises à une digestion enzymatique suivie d&#39;une analyse LC MS / MS, entraînant schéma de fragmentation am / z qui peut être utilisé pour déterminer la séquence d&#39;acides aminés primaire du peptide tryptique initial. Divers procédés de digestion peut être effectuée en fonction des types de détergents utilisés, ainsi que la spectrométrie de masse en aval flux de travail. Dans notre protocole, une électrophorèse PAGE-D suivie de l&#39;élimination du SDS à partir du gel est utilisé pour enlever toute contamination de détergent. L&#39;analyse de protéines qui sont difficiles à solubiliser, tels que des protéines membranaires, nécessite l&#39;utilisation de haute concentrations de SDS ou d&#39;autres détergents. Cela conduit à des problèmes de compatibilité avec l&#39;électrophorèse SDS-gel. Si l&#39;objectif d&#39;une étude nécessite la solubilisation de ces durs pour solubiliser les protéines, le système de tube de gel peut être utilisé 22,24. Procédé tube gel comprend moins de protéines de la matrice de gel sans l&#39;utilisation d&#39;électrophorèse. Par la suite des détergents utilisés pour la solubilisation sont retirés avant la digestion des protéines. La troisième phase est l&#39;analyse bioinformatique. Dans cette phase, les données de peptide MS / MS sont recherchées contre une base de données de séquences nucléotidiques traduites de déterminer quels sont les peptides et les protéines présentes dans l&#39;échantillon. L&#39;identification des peptides dépend de la base de données contre il est recherché. Metaproteomic données marines sont généralement recherchées contre les bases de données comprenant des génomes de référence, les données métagénomiques tels que le jeu de données mondial océan échantillonnage 25, ainsi que des génomes de cellules amplifié simples de li incultesneages 26,27. Identification des protéines peut également être augmentée par l&#39;inclusion de séquences metagénomiques partir du même échantillon que les données metaproteomic 5 a été dérivée. Ici, nous fournissons un protocole pour la production de peptides appropriés pour l&#39;analyse comparative MS / MS à partir de biomasse microbienne recueilli par filtration et stockées dans une solution de stabilisation de l&#39;ARN. Le protocole décrit ici permet d&#39;ADN et de protéines pour être isolés à partir du même échantillon de sorte que toutes les étapes menant à la protéine et les précipitations ADN sont identiques. D&#39;un point de vue pratique, moins filtration est nécessaire, car un seul filtre est nécessaire à la fois pour les protéines et l&#39;extraction d&#39;ADN. Nous tenons également à souligner que ce protocole a été créé grâce à la combinaison, l&#39;adaptation et la modification des deux protocoles précédemment publiés. Les étapes de lyse des cellules sont adaptées de Saito et al. (2011) 28 et la trypsine dans le gel digérer composant est conçu à partir de Shevchenko et al. (2007) 29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterivex -GP 0.22 &#956;m filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SVGP01050</td>
			<td>Sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater Stabilization Solution</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>Sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>77-86-1 or TB0196-500G</td>
			<td>Protein Extraction/ SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632-1G</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>15-21-3</td>
			<td>Protein Extraction/ SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10K Amicon Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337-4L</td>
			<td>Protein Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td>Protein Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPC Protein Precipitation reagent</td>
			<td>Epicenter</td>
			<td>mmP03750</td>
			<td>DNA Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td>DNA Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>DNA Quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Protein Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33211</td>
			<td>Protein Quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0158</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0718</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0375EDU</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CABDH6044-4</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4HCO3</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>1066-33-7</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632-1G</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0507-500ML</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270733-4L</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>144-48-9</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tube 1.5ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL ROBO vial 9mm</td>
			<td>Candian Life Science</td>
			<td>VT009/C395SB</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP BM insert, No spring</td>
			<td>Candian Life Science</td>
			<td>4025P-631</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an aquatic microbial metaproteomics workflow: from cells to tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based analysis

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and metabolism. Although powerful, metagenomics alone can only elucidate functional potential. On the other hand, metaproteomics enables the description of the expressed in situ metabolism and function of a community. Here we describe a protocol for cell lysis, protein and DNA isolation, as well as peptide digestion and extraction from marine microbial cells collected on a cartridge filter unit (such as the Sterivex filter unit) and preserved in an RNA stabilization solution (like RNAlater). In mass spectrometry-based proteomics studies, the identification of peptides and proteins is performed by comparing peptide tandem mass spectra to a database of translated nucleotide sequences. Including the metagenome of a sample in the search database increases the number of peptides and proteins that can be identified from the mass spectra. Hence, in this protocol DNA is isolated from the same filter, which can be used subsequently for metagenomic analysis.

Comme une démonstration, nous avons effectué le protocole sur deux échantillons d&#39;eau de mer prélevés dans la surface et le maximum de la chlorophylle de l&#39;océan côtier dans le Nord canadien. En mer, l&#39;eau de mer 7/6 L a été passé à travers un 3 um GF / D préfiltre, puis les cellules microbiennes ont été recueillis sur un filtre à cartouche de 0,22 pm en suivant le protocole de Walsh et al. 20. Les cellules ont été immédiatement stockés dans une solution de stabilisatio...

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An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis

This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

Un microbienne aquatique métaprotéomique Workflow: à partir de cellules à tryptique peptides appropriés pour l&#39;analyse comparative-spectrométrie de masse en tandem

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and ...

an-aquatic-microbial-metaproteomics-workflow-from-cells-to-tryptic

Research

JoVE Journal

Environment

8.7K vues.  Concordia University. This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

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Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study provides a protocol for the passive sampler preparation, calibration, extraction method and instrumental analysis. Sampling rates (RS) and passive sampler-water partition coefficients (KPW) were calculated for silicone rubber, polar organic chemical integrative sampler POCIS-A, POCIS-B, SDB-RPS and C18 disk. The uptake of the selected compounds depended on their physicochemical properties, i.e., silicone rubber showed a better uptake for more hydrophobic compounds (log octanol-water partition coefficient (KOW) &#62; 5.3), whereas POCIS-A, POCIS-B and SDB-RPS disk were more suitable for hydrophilic compounds (log KOW &#60; 0.70).

A protocol about the characterization and application of five different passive sampling devices is presented.

Caractérisation et Application des échantillonneurs passifs pour la surveillance des pesticides dans l&#39;eau

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study ...

Recherche

Environnement

Alternative Method of Removing Otoliths from Sturgeon

Extracting the otoliths (ear bones) from fish that have very thick skulls can be difficult and very time consuming. The common practice of making a transverse vertical incision on the top of the skull with a hand or electrical saw may damage the otolith if not performed correctly. Sturgeons (Acipenseridae) are one family in particular that have a very large and thick skull. A new laboratory method entering the brain cavity from the ventral side of the fish to expose the otoliths was easier than other otolith extraction methods found in the literature. Methods reviewed in the literature are designed for the field and are more efficient at processing large quantities of fish quickly. However, this new technique was designed to be more suited for a laboratory setting when time is not pressing and successful extraction from each specimen is critical. The success of finding and removing otoliths using this technique is very high and does not compromise the structure in any manner. This alternative technique is applicable to other similar fish species for extracting the otoliths.

The goal of the protocol is to show an effective method to extract the otoliths from sturgeon carcasses.

Méthode alternative de Retrait otolithes de Sturgeon

Extracting the otoliths (ear bones) from fish that have very thick skulls can be difficult and very time consuming. The common practice of making a ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about the overall structure of terrestrial microbial communities. PLFA profiling has been extensively used in a range of ecosystems as a biological index of overall soil quality, and as a quantitative indicator of soil response to land management and other environmental stressors.
The standard method presented here outlines four key steps: 1. lipid extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, 2. fractionation using solid phase extraction columns to isolate phospholipids from other extracted lipids, 3. methanolysis of phospholipids to produce fatty acid methyl esters (FAMEs), and 4. FAME analysis by capillary gas chromatography using a flame ionization detector (GC-FID). Two standards are used, including 1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC(19:0/19:0)) to assess the overall recovery of the extraction method, and methyl decanoate (MeC10:0) as an internal standard (ISTD) for the GC analysis.

Phospholipid fatty acids provide information about the structure of soil microbial communities. We present methods for extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, fractionation of extracted lipids using solid phase extraction columns, and methanolysis to produce fatty acid methyl esters, which are analyzed by capillary gas chromatography.

Extraction et analyse des acides gras des phospholipides microbiens dans les sols

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond quickly to environmental changes and can be thus used as indicators of water quality. Currently, biofilm assessment is mostly based on integrative and functional endpoints, such as photosynthetic or respiratory activity, which do not provide information on the biofilm community structure. Flow cytometry and computational visualization offer an alternative, sensitive, and easy-to-use method for assessment of the community composition, particularly of the photoautotrophic part of freshwater biofilms. It requires only basic sample preparation, after which the entire sample is run through the flow cytometer. The single-cell optical and fluorescent information is used for computational visualization and biological interpretation. Its main advantages over other methods are the speed of analysis and the high-information-content nature. Flow cytometry provides information on several cellular and biofilm traits in a single measurement: particle size, density, pigment content, abiotic content in the biofilm, and coarse taxonomic information. However, it does not provide information on biofilm composition on the species level. We see high potential in the use of the method for environmental monitoring of aquatic ecosystems and as an initial biofilm evaluation step that informs downstream detailed investigations by complementary and more detailed methods.

Flow cytometry in combination with visual clustering offers an easy-to-use and fast method for studying aquatic biofilms. It can be used for biofilm characterization, detection of changes in biofilm community structure, and detection of abiotic particles embedded in the biofilm.

Caractérisation des Biofilms aquatiques avec écoulement Cytometry

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The purpose of this manuscript is to provide detail on how to rapidly sample soil, rhizosphere, and endosphere of replicated field trials and analyze changes that may occur in the microbial communities due to sample type, treatment, and plant genotype. The experiment used to demonstrate these methods consists of replicated field plots containing two, pure, warm-season grasses (Panicum virgatum and Andropogon gerardii) and a low-diversity grass mixture (A. gerardii, Sorghastrum nutans, and Bouteloua curtipendula). Briefly, plants are excavated, a variety of roots are cut and placed in phosphate buffer, and then shaken to collect the rhizosphere. Roots are brought to the laboratory on ice and surface sterilized with bleach and ethanol (EtOH). The rhizosphere is filtered and concentrated by centrifugation. Excavated soil from around the root ball is placed into plastic bags and brought to the lab where a small amount of soil is taken for DNA extractions. DNA is extracted from roots, soil, and rhizosphere and then amplified with primers for the V4 region of the 16S rRNA gene. Amplicons are sequenced, then analyzed with open access bioinformatics tools. These methods allow researchers to test how the microbial community diversity and composition varies due to sample type, treatment, and plant genotype. Using these methods along with statistical models, the representative results demonstrate there are significant differences in microbial communities of roots, rhizosphere, and soil. Methods presented here provide a complete set of steps for how to collect field samples, isolate, extract, quantify, amplify, and sequence DNA, and analyze microbial community diversity and composition in replicated field trials.

Excavation of plant roots from the field as well as processing of samples into endosphere, rhizosphere, and soil are described in detail, including DNA extraction and data analysis methods. This paper is designed to enable other laboratories to use these techniques for the study of soil, endosphere, and rhizosphere microbiomes.

Isolement et analyse des communautés microbiennes dans le sol, rhizosphère et racines dans des expériences de graminée vivace

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and toxicological studies. Using automated digital tracking platforms, recent efforts in neuropharmacology are leveraging larval fish locomotor behaviors to identify potential therapeutic targets for novel small molecules. Similar to these efforts, research in the environmental sciences and comparative pharmacology and toxicology is examining various behaviors of fish models as diagnostic tools in tiered evaluation of contaminants and real-time monitoring of surface waters for contaminant threats. Whereas the zebrafish is a popular larval fish model in the biomedical sciences, the fathead minnow is a common larval fish model in ecotoxicology. Unfortunately, fathead minnow larvae have received considerably less attention in behavioral studies. Here, we develop and demonstrate a behavioral profile protocol using caffeine as a model neurostimulant. Though photomotor responses of fathead minnows were occasionally affected by caffeine, zebrafish&#160;were markedly more sensitive for photomotor and locomotor endpoints, which responded at environmentally relevant levels. Future studies are needed to understand comparative behavioral sensitivity differences among fish with age and time of day, and to determine whether similar behavioral effects would occur in nature and be indicative of adverse outcomes at the individual or population levels of biological organization.

Here, we present a protocol to examine larval zebrafish and fathead minnow locomotor activities and photomotor responses (PMR) using an automated tracking software. When incorporated in common toxicology bioassays, analyses of these behaviors provide a diagnostic tool to examine chemical bioactivity. This protocol is described using caffeine, a model neurostimulant.

Protocole expérimental pour l’examen des profils de réponse comportementale dans les larves de poissons : Application à la caféine Neuro-stimulant

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, we described a protocol for multiple analyses of the biological compositions in environmental PM. Five experiments are presented: (1) PM number monitoring by using a laser particle counter; (2) PM collection by using a cyclonic aerosol sampler; (3) PM collection by using a high-volume air sampler with filters; (4) culturable microbes collection by the Andersen six-stage sampler; and (5) detection of biological composition of environmental PM by bacterial 16SrDNA and fungal ITS region sequencing. We selected hazy days and a livestock farm as two typical examples of the application in this protocol. In this study, these two sampling methods, cyclonic aerosol sampler and filter sampler, showed different sampling efficiency. The cyclonic aerosol sampler performed much better in terms of collecting bacteria, while these two methods showed the same efficiency in collecting fungi. Filter samplers can work under low temperature conditions while cyclonic aerosol samplers have a sampling limitation for temperature. A solid impacting sampler, such as an Andersen six-stage sampler, can be used to sample bioaerosols directly into the culture medium, which increases the survival rate of culturable microorganisms. However, this method mainly relies on culture while more than 99% of microbes cannot be cultured. DNA extracted from the culturable bacteria collected by the Andersen six-stage sampler and samples collected by cyclonic aerosol sampler and filter sampler were detected by bacterial 16S rDNA and fungal ITS region sequencing.All the methods above may have wide application in many fields of study, such as environmental monitoring and airborne pathogen detection. From these results, we can conclude that these methods can be used under different conditions and may help other researchers further explore the health impacts of environmental bioaerosols.

Understanding the biological composition of environmental particulate matter is important for the study of its significant impacts on human health and disease spread. Here, we used three types of bioaerosol sampling methods and a biological analysis of airborne microbes to better explore airborne microbial communities under different environmental conditions.

Composition et analyse de la Distribution des bioaérosols sous différentes Conditions environnementales

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...

Identifying Per- and Polyfluorinated Chemical Species with a Combined Targeted and Non-Targeted-Screening High-Resolution Mass Spectrometry Workflow

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the local to federal levels. The continuing evolution of PFAS chemistries presents a challenge to the environmental monitoring, where ongoing development of targeted methods necessarily lags the discovery of new chemical compounds. There is a need, therefore, to have forward-looking methodologies that can detect emerging and unexpected compounds, monitor these species over time, and resolve details of their chemical structure to enable future work in human health. To this end, non-targeted analysis by high-resolution mass spectrometry offers a broad base detection approach that can be combined with almost any sample preparation scheme and provides significant capabilities for compound identification after detection. Herein, we describe a solid-phase extraction (SPE) based sample concentration method tuned for shorter chain and more hydrophilic PFAS chemistries, such as per fluorinated ether acids and sulfonates, and describe analysis of samples prepared in this fashion in both targeted and non-targeted modes. Targeted methods provide superior quantification when reference standards are available but are intrinsically limited to expected compounds when performing analysis. In contrast, a non-targeted approach can identify the presence of unexpected compounds and provide some information about their chemical structure. Information about chemical features can be used to correlate compounds across sample locations and track abundance and occurrence over time.

Here, we present a protocol for the sequential targeted quantification and non-targeted analysis of fluorinated compounds in water by mass spectrometry. This methodology provides quantitative levels of known fluorochemical compounds and identifies unknown chemicals in related samples with semi-quantitative estimates of their abundance.

Identification par- et les espèces chimiques polyfluorés avec un flux de travail combinée spectrométrie de masse à haute résolution ciblée et Non-ciblés-dépistage

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the ...

Fluorescently Labeled Bacteria as a Tracer to Reveal Novel Pathways of Organic Carbon Flow in Aquatic Ecosystems

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial communities has many limitations, and determining a predator, prey, and predatory rates is often difficult. Presented here is an optimized method based on the addition of fluorescently labelled prey as a tracer, which allows for reliable quantitation of the grazing rates in aquatic predatory eukaryotes and estimation of nutrient transfer to higher trophic levels.

Presented here is a protocol for a single-cell, epifluorescence microscopy-based technique to quantify grazing rates in aquatic predatory eukaryotes with high precision and taxonomic resolution.

Bactéries étiquetées fluorescentes comme traceur pour révéler de nouvelles voies de flux de carbone organique dans les écosystèmes aquatiques

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial ...

A Guide to Concentration Alternating Frequency Response Analysis of Fuel Cells

An experimental setup capable of generating a periodic concentration input perturbation of oxygen was used to perform concentration-alternating frequency response analysis (cFRA) on proton-exchange membrane (PEM) fuel cells. During cFRA experiments, the modulated concentration feed was sent to the cathode of the cell at different frequencies. The electric response, which can be cell potential or current depending on the control applied on the cell, was registered in order to formulate a frequency response transfer function. Unlike traditional electrochemical impedance spectroscopy (EIS), the novel cFRA methodology makes it possible to separate the contribution of different mass transport phenomena from the kinetic charge transfer processes in the frequency response spectra of the cell. Moreover, cFRA is able to differentiate between varying humidification states of the cathode. In this protocol, the focus is on the detailed description of the procedure to perform cFRA experiments. The most critical steps of the measurements and future improvements to the technique are discussed.

We present a protocol for concentration alternating frequency response analysis of fuel cells, a promising new method of studying fuel cell dynamics.

Guide de concentration En alternance d'analyse des réponses aux fréquences des piles à combustible

An experimental setup capable of generating a periodic concentration input perturbation of oxygen was used to perform concentration-alternating frequency ...