Cette approche guidée par la lignée permet l’analyse protéomique d’événements développementaux importants avec une résolution spatiale et temporelle chez l’embryon de vertébrés transmettant des informations qui ne seraient pas accessibles par des mesures d’embryons entiers. Cette approche peut être facilement étendue à l’étude des protéines, des métabolites et des transcrits de différentes cellules embryonnaires au fur et à mesure qu’elles se différencient au cours du développement. Cette méthode peut faire progresser notre compréhension des mécanismes moléculaires qui contrôlent le développement normal et de la maladie, y compris les mécanismes d’induction tissulaire et d’engagement du devenir cellulaire au cours du développement précoce.
Utilisez une boucle capillaire pour guider chaque embryon dans un puits et positionnez-les doucement de manière à ce que la cellule ciblée d’intérêt soit perpendiculaire à la micro-aiguille. Suivez les cartes du devenir tissulaire de Xenopus laevis pour identifier la cellule précurseur de la lignée d’intérêt. Utilisez deux pinces à aiguiser pour retirer délicatement la membrane vitelline entourant l’embryon.
Isoler les cellules individuelles de l’embryon par dissection manuelle à l’aide de forceps. Commencez par installer l’aiguille d’injection contenant la solution de traceur de lignée. Montez l’aiguille de micro-injection dans un support de micro-pipette contrôlé par un micromanipulateur multi-axes.
Connectez le porte-micro-pipette à un micro-injecteur et remplissez l’aiguille avec le traceur de lignée en appliquant une pression négative. Calibrez l’aiguille et ajustez la taille de l’extrémité de l’aiguille et le temps d’injection pour fournir environ un nanolitre de la solution de traceur de lignée mesurée dans l’huile minérale. Assurez-vous que la taille des gouttelettes injectées est exacte et ajustez les paramètres de l’injecteur si nécessaire.
Inonder le plat d’argile de micro-injection avec une solution à 3% fCAL et transférer environ 10 embryons dans le plat d’argile à l’aide d’une pipette de transfert. Injecter aux cellules d’intérêt environ un nanolitre de dextrane fluorescent ou 200 picogrammes d’ARNm GFP. À l’aide d’un stéréomicroscope, confirmez le succès du marquage cellulaire.
Assurez-vous que seule la cellule prévue est injectée. Jeter les embryons contenant des cellules blessées ou mal étiquetées conformément aux politiques institutionnelles. Transférer les embryons injectés dans une boîte de Pétri contenant 0,5x la solution de Steinberg.
Cultivez-les entre 14 et 25 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade de développement souhaité. Transférer trois à cinq embryons dans une boîte de gélose contenant 0,2x la solution de Steinberg pour les microdissections. Utilisez une pince pour disséquer le clone marqué de l’embryon.
Recueillir le tissu disséqué avec une pipette de 0,5 à 10 microlitres et le déposer dans un fichier de microcentrifugeuse. À l’aide d’une pipette, aspirer le milieu entourant le tissu prélevé afin de limiter la présence de sels dans l’échantillon afin d’éviter toute interférence avec l’analyse du SGRH. Congeler immédiatement les cellules isolées en plaçant le flacon d’échantillon sur de la glace sèche ou de l’azote liquide.
Conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius jusqu’à l’analyse par spectrométrie de masse. Pour le traitement d’échantillons unicellulaires par CE, dénaturez les protéines en chauffant l’échantillon à 60 degrés Celsius pendant environ 15 minutes. Ensuite, équilibrez l’échantillon à température ambiante pendant cinq minutes et ajoutez de la trypsine aux échantillons pour la digestion.
Pour l’analyse par NanoLC, lyser jusqu’à cinq tissus disséqués dans 50 microlitres de tampon de lyse. Faciliter le processus en pipetant l’échantillon de haut en bas. Pour traiter les tissus disséqués, incuber le lysat à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.
Ensuite, enduisez les débris cellulaires et les plaquettes vitellines à quatre degrés Celsius par centrification à 4 500 RCF. Transférer le surnageant dans un flacon de microcentrifugation propre et ajouter 10% de SDS pour obtenir une concentration finale de 1% SDS dans le lysat. Pour les tissus, ajouter 0,5 molaire de dithiothréitol au lysat pour obtenir une concentration finale d’environ 25 millimolaires.
Ensuite, incuber le lysat pendant 30 minutes à 60 degrés Celsius pour réduire chimiquement les liaisons disulfure dans les protéines. Ajouter 0,5 molaire d’iodoacétamide pour obtenir la concentration finale d’environ 75 millimolaires dans le lysat et incuber le mélange pendant 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Ajouter 0,5 molaire de dithiothréitol identique au volume initial pour éteindre les réactifs restants de la réaction d’alkylation.
Précipiter les protéines dans l’acétone pendant la nuit comme décrit dans le protocole texte et se reconstituer dans 0,5 molaire de bicarbonate d’ammonium. Ajouter la trypsine pour la digestion des échantillons et incuber les flacons à 37 degrés Celsius. Pour séparer les peptides à l’aide de CE, reconstituer la protéine digérée dans un à deux microlitres de l’échantillon de solvant.
Vortex de l’échantillon mixte et centrifusion à 10 000 RCF pendant deux minutes à quatre degrés Celsius pour injecter les débris cellulaires. Initialisez l’instrument CE-ESI en rinçant le capillaire CE avec le BGE. Placer un microlitre d’échantillon dans le flacon d’échantillon et injecter un à 10 nanolitres de l’échantillon dans le capillaire de séparation CE par injection hydrodynamique.
Transférer l’extrémité d’entrée du capillaire de séparation CE dans le BGE. Commencez la séparation électrophorétique en augmentant progressivement la tension de séparation CE à partir de la terre. Des potentiels de 20 à 28 kilovolts avec un courant inférieur à 10 microampères assurent des performances instrumentales stables et reproductibles pour l’analyse.
Pour séparer à l’aide de Nano LC, remettre en suspension l’échantillon peptidique en phase mobile A.La concentration et le volume d’injection de l’échantillon dépendent du système LC et de la colonne disponibles. Transférer l’échantillon dans un flacon LC. Charger environ 200 nanogrammes à deux microgrammes d’échantillon de peptide dans la colonne analytique C18 et séparer les peptides à un débit de 300 nanolitres par minute en utilisant l’élution de gradient comme décrit dans le manuscrit du texte.
À l’aide d’une caméra, vérifiez le débit de liquide à travers l’émetteur de pulvérisation électrique et inspectez visuellement l’installation pour détecter d’éventuelles fuites. Acquérir des événements de spectrométrie de masse et séquencer les peptides comme décrit dans le manuscrit textuel. Des différences génétiques translationnelles ont été détectées entre des cellules D11 disséquées à partir de différents embryons à l’aide de CE-ESI-HRMS.
Des clones cellulaires disséqués marqués par lignée ont été analysés par LC-HRMS. L’analyse de la voie des protéines a montré une translation des protéines régulée à la hausse et un métabolisme énergétique dans l’organisateur de Spemann avec le neuroectoderme. Le neuroectoderme prodeum a été enrichi en protéines associées au transport nucléaire de la cargaison de protéines dans la cellule, indiquant probablement des événements en aval suivant la signalisation.
L’analyse d’enrichissement des fonctions moléculaires a indiqué une régulation positive dans l’initiation de la traduction, la liaison à l’ARN et la liaison du complexe protéasome, suggérant un rôle pour le renouvellement dynamique des protéines développant l’organisateur de Spemann. Ne sélectionner que des embryons stéréotypés pour ce protocole afin d’améliorer la reproductibilité et l’interprétation des résultats. Les tissus disséqués doivent être transférés dans un flacon et immédiatement congelés contenant le plus minimum de tampon possible pour minimiser la contamination par les sels tampons.
Cette approche nous a permis d’étudier la dynamique des protéines dans les cellules identifiées et les lignées cellulaires dans les embryons vivants. Les nouvelles informations que nous avons obtenues sur la production temporelle spatiale de protéines importantes dans les tissus en développement nous ont permis de concevoir des expériences ciblées pour évaluer leur fonction biologique.
