Ce travail a été soutenu par un Centre national de recherche en santé et médecine (NHMRC) subvention de projet à RM

Toutes les procédures expérimentales décrites ici respectées les soins et du Comité d&#39;éthique animale de l&#39;UNSW Australie et ont été effectuées en conformité avec le Medical Research Council de l&#39;Australie règlements pour l&#39;expérimentation animale Santé nationale et du. Toutes les procédures décrites dans ce protocole doivent être effectués en conformité avec l&#39;exigence de la commission de protection des animaux et de l&#39;éthique pertinents. 1. acétylcholinestérase histochimique coloration <ol><li> Préparer le mélange de réaction de l&#39;acétylcholinestérase <ol><li> Ajouter 290 mg de iodure d&#39;acétylthiocholine 200 ml de 0,1 M de tampon de phosphate (PB). Mélanger avec un agitateur magnétique à 900 tours par minute. </li><li> Ajouter 600 mg de glycine sous agitation continue. </li><li> Ajouter lentement 420 mg de sulfate de cuivre au mélange réactionnel sous agitation continue jusqu&#39;à ce que le produit soit complètement dissous. </li></ol></li><li> Retirer la peau sur la carcasse de l&#39;animal (obtenu par le partage de tissu) en faisant des incisionsdans la peau d&#39;un rat ou une souris perfusé, saisir la peau de la région du cou et en la tirant passé ses pieds. Assurez-vous que le fascia couvrant chaque muscle est soit supprimé ou sensiblement perforé pour assurer suffisamment l&#39;exposition des fibres musculaires à la solution de réaction. </li><li> Immerger le corps entier ou d&#39;un membre d&#39;intérêt dans le mélange de réaction et incuber O / N à 4 ° C. </li><li> Laver la carcasse pendant 2 min dans de l&#39;eau distillée. Remarque: A ce stade, les muscles présentent une coloration bleue et les plaques d&#39;extrémité du moteur (MEPs) peuvent être considérés comme des points blancs. </li><li> Exposer la carcasse à une solution à 10% de sulfure d&#39;ammonium à 5/3 sec. Remarque: Les fibres musculaires vont rapidement brunissent et les députés seront observables comme des points noirs tachetés. Si la réaction se produit trop rapidement, et les fibres musculaires sont colorées trop sombre pour distinguer entre les députés européens et les fibres musculaires essayez d&#39;utiliser des concentrations plus faibles de solution de sulfure d&#39;ammonium (par exemple, 5%). Le temps de réaction pour obtenir lecontraste optimal entre les députés européens et les fibres musculaires varie d&#39;un échantillon à l&#39;autre. Il est donc difficile de définir la durée d&#39;exposition exacte de réactif. La réaction doit être étroitement surveillée et arrêtée lorsque le contraste est jugé adéquat. </li><li> Laver la carcasse deux fois, avec une agitation dans de l&#39;eau distillée et tapotez doucement la carcasse sèche. </li><li> Photo à la fois les aspects latéral et médial de la jambe, en assurant que les députés de tous les muscles d&#39;intérêt sont capturées. </li></ol> 2. injections intramusculaires au niveau des plaques motrices de fin <ol><li> Tirez micropipettes de verre avec un extracteur micropipette (l&#39;utilisation de micro-pipettes graduées avec des plongeurs est recommandé). Avec l&#39;aide d&#39;un microscope à dissection, briser les pointes des micropipettes avec une paire de forceps de telle sorte que le diamètre interne de la lumière de la micropipette est d&#39;environ 0,5 mm. </li><li> Veiller à ce que tous les instruments chirurgicaux utilisés sont fraîchement autoclave et eà la zone chirurgicale est stérile. </li><li> Remplissez les micropipettes avec Fluoro-Gold (5% dans de l&#39;eau distillée). </li><li> Induire chez l&#39;animal anesthésier dans une chambre d&#39;induction avec isofluorane (4% O 2). Vérifiez réflexe de redressement et d&#39;assurer son absence avant de le retirer de la chambre d&#39;induction. Fixer un cône de nez sur le museau du rat et de livrer isofluorane (2% en O 2) pour l&#39;entretien de l&#39;anesthésie. Pincez les orteils de l&#39;animal et toucher doucement l&#39;œil de l&#39;animal afin d&#39;assurer que les deux le retrait de la pédale et les réflexes cornéens sont absents. Note: Un mélange de kétamine et xylazil peut également être utilisé (80 et 10 mg / kg, respectivement, livré par voie intrapéritonéale). La kétamine est un annexe 8 (&quot;Contrôle&quot;) médicaments et les protocoles nécessaires liés à l&#39;achat, l&#39;utilisation, le stockage et l&#39;élimination de la drogue devront être respectées. </li><li> Appliquer un lubrifiant oculaire pour éviter le dessèchement des yeux au cours de la procédure. </li><li> Raser les tmembre argeted et l&#39;utilisation de la gaze pour essuyer la zone rasée avec trois gommages alternées de chlorhexidine et 70% d&#39;alcool. Transfert à l&#39;animal de la zone chirurgicale. </li><li> Placez l&#39;animal sur un underpad propre et le positionner de manière appropriée pour assurer un bon accès au muscle (s) ciblé. </li><li> Utilisez une paire de pinces avec des poignées de dents pour soulever la peau sur le muscle ciblé loin de la musculature sous-jacente et faire une incision dans la peau avec des ciseaux chirurgicaux. Assurez-vous que l&#39;incision est suffisamment grande pour exposer complètement le muscle (s) d&#39;intérêt. Assurez-vous qu&#39;il ya une perturbation minimale de l&#39;aponévrose. </li><li> Utilisez les photographies MEP de transposer mentalement l&#39;emplacement et la forme de la région MEP sur le muscle (s). Remarque: Un marqueur de feutre amende pourrait aider à reproduire la région député européen de la photographie sur le muscle (s) d&#39;intérêt. </li><li> Effectuer des injections multiples sur toute la longueur de la région, MdPE (pour Fluoro-Gold, 3 à 4 injections de 1-2 ul chaque sHould être suffisant). Essuyez doucement le muscle (s) pour enlever toute infiltration. </li><li> Apportez les deux extrémités de la peau incisée étroite collaboration avec le forceps émoussé et fermer la plaie avec des pinces chirurgicales. Infiltrez 0,1 ml de bupivacaïne (0,5% dans l&#39;eau) (ou d&#39;autres anesthésiques locaux) sur toute la durée de la plaie. </li><li> Mettez la machine hors d&#39;anesthésie et surveiller l&#39;animal jusqu&#39;à ce qu&#39;il a est complètement remis de l&#39;anesthésie. </li><li> Attendre 14 jours entre l&#39;administration d&#39;injections intra-musculaires et la perfusion des animaux. </li></ol> 3. perfusions <ol><li> Administrer une dose létale de solution de pentobarbital de sodium (par exemple Lethabarb; 150 mg / kg) à l&#39;animal par injection intrapéritonéale. <ol><li> Surveiller de près l&#39;animal jusqu&#39;à un niveau profond de l&#39;anesthésie est atteint, comme l&#39;a confirmé l&#39;absence de retrait de la pédale et les réflexes cornéens. </li></ol></li><li> Placez l&#39;animal sur son dos sur une planche de dissection placé sur un perfusion évier. </li><li> Utilisez une paire de pinces avec des poignées de dents pour soulever la peau recouvrant la base du sternum. Faire une petite incision de la peau avec une paire de ciseaux chirurgicaux fortes immédiatement au-dessous du sternum et ensuite utiliser la pince pour saisir le cartilage xiphoïde du sternum. Tout en maintenant le cartilage xiphoïde, agrandir l&#39;incision des deux côtés de la cage thoracique, à partir du sternum au niveau des aisselles. </li><li> Couper la membrane pour exposer le coeur. <ol><li> Injecter de l&#39;héparine 0.ml directement dans l&#39;apex du coeur pour empêcher la coagulation du sang. </li><li> Couper le sommet pour permettre l&#39;insertion d&#39;une canule dans le ventricule gauche, et serrer ensuite rapidement la canule en place à l&#39;aide d&#39;une pince hémostatique. </li><li> Faire une incision dans l&#39;oreillette droite avec une paire de ciseaux fins et commencer immédiatement la pompe péristaltique. Perfuser avec 0,1 M de PB jusqu&#39;à ce que le liquide qui sort de l&#39;oreillette est pratiquement exempt de sang et la couleur du foie devient brun clair. Ensuite, perfuser avec une solution de paraformaldéhyde (4% dans 0,1 M de PB) jusqu&#39;à ce que l&#39;ensemble du corps de l&#39;animal devient rigide. </li></ol></li></ol> 4. col de l&#39;utérus et de la moelle épinière Dissection Préparation pour l&#39;histologie <ol><li> Poser la carcasse de l&#39;animal sur son abdomen. </li><li> Découper la peau à la ligne médiane du corps avec un scalpel et la réfléchir à partir de la base du crâne au niveau de l&#39;os iliaque. </li><li> Couper à travers et refléter les muscles paravertébraux pour exposer la face dorsale de la colonne vertébrale. </li><li> Identifier l&#39;apophyse épineuse osseuse de l&#39;Atlas, le deuxième segment cervical (c.-à-C2), et retirez-la avec une paire de pinces chirurgicales rongeurs ou de localiser la racine dorsale sous-jacents correspondants. <ol><li> Identifier la racine C2 droit par la coloration avec un feutre permanent. </li><li> Retirer la prochaine vertèbres un par un et marquer les racines dorsales droite avec des couleurs alternées (c.-à-C2, C4, C6, C8 et peut être coloré en vert et C3, C5, C7, T1 peut être colORed en bleu). </li></ol></li><li> Utilisez une petite aiguille chirurgicale (par exemple, 30 G d&#39;aiguille de la jauge) pour doucement percer la dure recouvrant l&#39;extrémité inférieure de la moelle épinière. Avec le biseau de l&#39;aiguille vers le haut, soulever la dure-mère loin de la corde tout en déplaçant l&#39;aiguille rostralement de faire une fente longitudinale. <ol><li> Refléter la dure-mère. </li></ol></li><li> Couper le transversalement de la moelle épinière en blocs d&#39;une ou deux segments avec une nouvelle lame de scalpel. <ol><li> Laissez les segments de la moelle épinière in situ et, pour chaque bloc, faire soigneusement une petite marque de repère sur le côté gauche de chaque bloc avec le mi-chemin de la lame de bistouri entre deux racines adjacentes. Assurez-vous que le repère de référence est assez profond à travers le tissu à être visible de la face ventrale des blocs. Faire le repère de référence à un angle d&#39;environ 45 °, pointant soit avant ou en arrière par rapport à l&#39;anatomie animale, pour aider à l&#39;orientation du segment de tissu suivante dissection. </li></ol></li><li> Recueillir les blocs individuels dans de petites bouteilles, clairement étiquetés contenant une solution de paraformaldéhyde (4% dans 0,1 M de PB) et de laisser à la température ambiante O / N. </li><li> Transférez les blocs dans des bouteilles propres, clairement étiquetés contenant une solution de saccharose (30% dans 0,1 M de PB) et de garder à 4 ° C pendant au moins deux jours. </li><li> Placez les segments en cryo-moules et les couverts avec le milieu de congélation de tissu. Pour la préparation histologique longitudinale, orienter les blocs avec la face dorsale vers le haut et d&#39;utiliser la marque de repère pour orienter le bloc dans les cryo-moules. </li><li> Geler les cryo-moules à -20 ° C et couper avec un cryostat dans 50 sections um d&#39;épaisseur. Remarque: Les sections peuvent être montées directement sur des lames de microscope l&#39;adhérence et à sécher O / N. Alternativement, les sections peuvent être flottaient dans des plaques à 48 puits remplis avec 0,1 M de PB et montés par la suite en utilisant le repère de référence pour orienter les coupes de tissus sur les lames. </li></ol> 5. lombaire Coe Dissection et préparation pour l&#39;histologie <ol><li> Poser la carcasse de l&#39;animal sur son dos. </li><li> Effectuer une incision médiane le long de l&#39;abdomen de l&#39;animal et enlever les viscères. On dissèque les muscles de la paroi abdominale postérieure pour exposer la face ventrale de la colonne vertébrale. </li><li> Localisez la nervure caudale plus court et sa attenant T13 vertèbre où le T13 racine ventrale quitte l&#39;os. <ol><li> Consécutivement retirer un par un l&#39;rostrale deux ou trois vertèbres T13 (c.-à-T12, T11 et, si nécessaire, T10) avec rongeurs chirurgicales fines pour suivre le T13 racine ventrale jusqu&#39;à son point d&#39;entrée dans la face ventrale du cordon ventral et la marquer avec un feutre permanent. </li><li> De ce point, répétez la même procédure pour identifier l&#39;emplacement des points d&#39;entrée des racines ventrales pour L1, L2, L3, L4, L5, L6 et S1, les colorer avec des couleurs alternées. </li></ol></li><li> Suivre la même procédure que celle décrite dans la section 4.5 au 4.10 pour lumbar moelle dissection du cordon. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrentes.

Ciblage intramusculaire et le transfert rétrograde ultérieure de transgènes thérapeutiques pour les motoneurones α correspondant pour le traitement expérimental de l&#39;état neuromusculaire est pas une nouvelle stratégie. Par exemple, ce mode de livraison a été utilisée pour retarder la dégénérescence neuromusculaire à différents stades de la progression de la SLA chez les souris et les rats SOD1 1,9-12 ainsi que chez les souris avec 13 SMA. Bien que prometteur, l&#39;efficacité d...

La perte de contrôle du mouvement volontaire qui résulte de troubles neurologiques comme la maladie du motoneurone et spinal- ainsi que l&#39;atrophie musculaire de Duchenne est une maladie débilitante qui a un impact élevée et durable sur la vie quotidienne des personnes touchées. Au cours de la dernière décennie, les efforts de recherche visant à arrêter ou au moins retarder les effets délétères de ces maladies neuromusculaires a été une priorité pour de nombreux cliniciens et les scientifiques du monde entier. À cet égard, la dernière génération de modèles animaux qui imitent ces maladies neuromusculaires a joué un rôle dans l&#39;obtention de connaissances fondamentales sur les mécanismes physiologiques qui sous-tendent le développement et la progression de ces conditions de 1 à 13. Le traitement de ces maladies neuromusculaires exige un accès direct à la moelle épinière et peut être obtenu par des injections de la moelle épinière 14,15. Les progrès récents dans la thérapie génique ont également ciblé les muscles striés de la partie supérieure etmembres inférieurs à gènes thérapeutiques de navette vers les motoneurones α correspondants qui sont situés dans la corne ventrale de la moelle épinière 1,9-13. Cependant, cette stratégie une fois prometteuse n&#39;a pas réussi à améliorer le résultat de ces conditions neurologiques. Alors qu&#39;il est juste de conclure que ces piètres résultats pourraient être, au moins en partie, être attribuable à la faible efficacité de ces gènes protecteurs, on ne peut exclure la faible efficacité de ces méthodes de transfert de gènes. plaques d&#39;extrémité du moteur (MEPs) sont des régions spécialisées des fibres musculaires squelettiques qui sont en retrait par les terminaisons axonales des grandes fibres motrices périphériques provenant α neurones moteurs. Ensemble, les terminaisons de fibres nerveuses périphériques et les députés forment la jonction neuromusculaire, à savoir, le site où l&#39;influx synaptique sont déclenchées par la libération du neurotransmetteur antérograde, l&#39;acétylcholine. Surtout, la relation entre les fibres nerveuses périphériques et les députés est bi-directional, bien que différents moteurs sont responsables pour le transport des molécules et des organites vers ainsi que l&#39;écart du neurone Somata 16-18. À la lumière de ces considérations anatomiques, les députés semblent être des cibles de choix pour la livraison et le transport rétrograde ultérieure de matériel génétique pour les neurones moteurs correspondants. Dans ce contexte, il est peu surprenant que le succès de neurone moteur transduction dépend fortement de la distance entre l&#39;injection intramusculaire de vecteurs viraux et les députés de la musculaires 19-20. Curieusement, cependant, l&#39;emplacement exact des zones de MEP sur les fibres musculaires du rat de laboratoire et de la souris, les deux espèces de choix pour modéliser les maladies neuromusculaires, ne étaient pas disponibles jusqu&#39;à récemment. Nous avons produit des cartes détaillées de la région MEP pour plusieurs muscles des membres antérieurs chez le rat et la souris 21-22. Plus récemment, nous avons montré les détails de l&#39;organisation de la MEP région pour plusieurs muscles de la patte arrière de la souris 23 et nous sommes en train d&#39;analyser les caractéristiques des députés de la patte arrière de rat. Dans nos mains, des injections intramusculaires de traceurs rétrogrades dirigés vers les zones MEP entières dans ces muscles ont donné lieu à des neurones moteurs plus marqués qui sont Spanning segments de la moelle épinière plus que rapporté précédemment. Ici, nous présentons le protocole qui a été développé au cours des dernières années pour révéler l&#39;emplacement des députés sur la surface externe ainsi que toute la profondeur de la patte arrière et patte avant muscles de la souris et le rat.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gold</td>
			<td>Fluorochrome, LLC</td>
			<td>Nil</td>
			<td>Diluted to 5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond PCR Micropipets 1-10&#181;l</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>5-000-1001-X10</td>
			<td>accompanied with plungers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylthiocholine Iodide</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A5751-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) Sulfate Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>61230-500G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T Compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>1083-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D-3312</td>
			<td>Diliuted in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Provet</td>
			<td>ISOF00</td>
			<td>1000mg/g Isoflurane inhalation vapour</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip 9mm Wound Clips</td>
			<td>Texas Scientific Instruments, LLC</td>
			<td align="right">205016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lethabarb Enthanasia Injection</td>
			<td>Virbac (Australia) Pty Ltd.</td>
			<td>LETHA450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Solution</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>A809-2.5L PL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus glass slides</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulphide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1952</td>
			<td>Diluted to 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride)</td>
			<td>Astrazenca</td>
			<td></td>
			<td>Diluted to 0.25%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intramuscular injections along the motor end plates: a minimally invasive approach to shuttle tracers directly into motor neurons

Les maladies affectant l&#39;intégrité des neurones moteurs de la moelle épinière sont parmi les troubles neurologiques les plus débilitantes. Au cours des dernières décennies, le développement de plusieurs modèles animaux de ces maladies neuromusculaires a fourni à la communauté scientifique avec différents scénarios thérapeutiques visant à retarder ou inverser la progression de ces conditions. En tirant parti de la machinerie rétrograde de neurones, une de ces approches a été de cibler les muscles squelettiques afin de gènes thérapeutiques de la navette dans les neurones moteurs de la moelle épinière correspondant. Même si une fois prometteur, le succès de l&#39;approche de livraison tels génique a été entravée par le nombre de sous-optimale des neurones moteurs transduites il a montré jusqu&#39;ici de céder. plaques d&#39;extrémité du moteur (MEPs) sont des régions très spécialisées sur les muscles squelettiques qui sont en contact synaptique direct à la moelle épinière α neurones moteurs. À cet égard, il est important de noter que, jusqu&#39;à présent, les efforts de manière rétrogradetransférer des gènes dans les neurones moteurs ont été faites sans référence à l&#39;emplacement de la région MEP dans les muscles ciblés. Ici, nous décrivons un protocole simple 1) pour révéler l&#39;emplacement exact des députés sur la surface des muscles squelettiques et 2) d&#39;utiliser cette information pour guider la prestation intramusculaire et transport rétrograde optimale ultérieure des traceurs rétrogrades dans les neurones moteurs. Nous espérons que d&#39;utiliser les résultats de ces expériences de traçage dans d&#39;autres études dans l&#39;enquête sur le transport rétrograde de gènes thérapeutiques aux neurones moteurs de la moelle épinière à travers le ciblage des députés.

Acetylcholinesterase coloration histochimique révèle l&#39;emplacement des plaques d&#39;extrémité du moteur sur toute la largeur des muscles. La figure 1 illustre les résultats d&#39;une telle coloration effectuée sur un ensemble des membres antérieurs du rat. Il est recommandé d&#39;optimiser la concentration de la solution de sulfure d&#39;ammonium (par ex., De 5 à 7% au lieu de 10%) ainsi que le moment où le spécimen est immergé dans la solution si la coloration de fond non-spé...

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Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

Les injections intramusculaires le long des plaques motrices de fin: une approche minimalement invasive à la navette Tracers Directement dans motoneurones

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

intramuscular-injections-along-motor-end-plates-minimally-invasive

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.5K vues.  University of New South Wales. The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

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Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Identifier les motoneurones extracellulaire d&#39;un Motor Pool musculaire dans<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Recherche

Neurosciences

Minimally-invasive Technique for Injection into Rat Optic Nerve

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central nervous system in a minimally-invasive surgery without bone removal. This technique describes an approach to visualization and direct injection of the optic nerve following minor fascial dissection from the orbital ridge, using a conjunctival traction suture to gently pull the eye down and out. Representative examples of an injected optic nerve show successful injection of dyed beads.

Direct injection into the rat optic nerve is useful for regenerative research. We demonstrate a minimally-invasive technique for direct injection into a rat optic nerve that does not involve opening the skull. Using this method, surgical complications are minimized and recovery is more rapid.

Technique mini-invasive pour injection dans Rat Optic Nerve

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

Pourquoi Quantification Matters: Caractérisation des phénotypes au<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvaire jonction neuromusculaire

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

Visualisation du modèle de projection axonale des neurones du moteur embryonnaire dans<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Endoscopic Endonasal Trans-sphenoidal Approach: Minimally Invasive Surgery for Pituitary Adenomas

Endoscopic endonasal trans-sphenoidal surgery has become the gold standard for the surgical treatment of pituitary adenomas and many other pituitary lesions. Refinements in surgical techniques, technological advancements, and incorporation of neuronavigation have rendered this surgery minimally invasive. The complication rates of this surgery are very low while excellent results are consistently obtained through this approach.
This paper focuses on the step-by-step surgical approach to pituitary adenomas, which is based on personal experience, and details the results obtained with this minimally invasive surgery.

The aim of this paper is to describe the different steps of the endoscopic endonasal approach to the sella turcica.

Approche endoscopique Endonasal Trans-sphénoïdal : Chirurgie mini-Invasive pour les adénomes de l’hypophyse

Endoscopic endonasal trans-sphenoidal surgery has become the gold standard for the surgical treatment of pituitary adenomas and many other pituitary ...

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic nerves innervating the respiratory diaphragm. In spinal cord slices, phrenic motor neurons cannot be identified from other motor neurons on morphological or biochemical criteria. We provide the description of procedures for visualizing phrenic motor neuron cell bodies in mice, following intrapleural injections of cholera toxin subunit beta (CTB) conjugated to a fluorophore. This fluorescent neuroanatomical tracer has the ability to be caught up at the diaphragm neuromuscular junction, be carried retrogradely along the phrenic axons and reach the phrenic cell bodies. Two methodological approaches of intrapleural CTB delivery are compared: transdiaphragmatic versus transthoracic injections. Both approaches are successful and result in similar number of CTB-labeled phrenic motor neurons. In conclusion, these techniques can be applied to visualize or quantify the phrenic motor neurons in various experimental studies such as those focused on the diaphragm-phrenic circuitry.

Here, we describe a protocol for identifying phrenic motor neurons in mice after intrapleural delivery of fluorophore conjugated cholera toxin subunit beta. Two techniques are compared to inject the pleural cavity: transdiaphragmatic versus transthoracic approaches.

Traçage neuroanatomique rétrograde des motoneurones phréniques chez la souris

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

Conversion de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPSCs) en neurones moteurs spinaux et crânien fonctionnels utilisant des vecteurs PiggyBac

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Non-Invasive Modulation and Robotic Mapping of Motor Cortex in the Developing Brain

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries unique challenges in children. Similarly, transcranial direct current stimulation (tDCS) can improve motor learning in adults but has only recently been applied to children. The use of tDCS and emerging techniques like high&#8211;definition tDCS (HD-tDCS) require special methodological considerations in the developing brain. Robotic TMS motor mapping may confer unique advantages for mapping, particularly in the developing brain. Here, we aim to provide a practical, standardized approach for two integrated methods capable of simultaneously exploring motor cortex modulation and motor maps in children. First, we describe a protocol for robotic TMS motor mapping. Individualized, MRI-navigated 12x12 grids centered on the motor cortex guide a robot to administer single-pulse TMS. Mean motor evoked potential (MEP) amplitudes per grid point are used to generate 3D motor maps of individual hand muscles with outcomes including map area, volume, and center of gravity. Tools to measure safety and tolerability of both methods are also included. Second, we describe the application of both tDCS and HD-tDCS to modulate the motor cortex and motor learning. An experimental training paradigm and sample results are described. These methods will advance the application of non-invasive brain stimulation in children.

We demonstrate protocols for the modulation (tDCS, HD-tDCS) and mapping (robotic TMS) of the motor cortex in children.

Modulation non invasive et cartographie robotique du cortex moteur dans le cerveau en développement

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Analyse cinématique 3D pour l’évaluation fonctionnelle dans le modèle de rat de la blessure d’écrasement de nerf sciatique

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and neurodegenerative diseases. Although numerous studies of axons have been conducted, our understanding of formation and dysfunction of axon fascicles is still limited due to the lack of robust three-dimensional in vitro models. Here, we describe a step-by-step protocol for the rapid generation of a motor nerve organoid (MNO) from human induced pluripotent stem (iPS) cells in a microfluidic-based tissue culture chip. First, fabrication of chips used for the method is described. From human iPS cells, a motor neuron spheroid (MNS) is formed. Next, the differentiated MNS is transferred into the chip. Thereafter, axons spontaneously grow out of the spheroid and assemble into a fascicle within a microchannel equipped in the chip, which generates an MNO tissue carrying a bundle of axons extended from the spheroid. For the downstream analysis, MNOs can be taken out of the chip to be fixed for morphological analyses or dissected for biochemical analyses, as well as calcium imaging and multi-electrode array recordings. MNOs generated with this protocol can facilitate drug testing and screening and can contribute to understanding of mechanisms underlying development and diseases of axon fascicles.

This protocol provides a comprehensive procedure to fabricate human iPS cell-derived motor nerve organoid through spontaneous assembly of a robust bundle of axons extended from a spheroid in a tissue culture chip.

Génération organoïde tridimensionnelle de nerf moteur

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...