Soutenu par NIH / NIDCD R01 DC expériences 011582. d&#39;imagerie ont été effectuées à l&#39;Université du Colorado Anschutz médicale Campus avancée microscopie optique minimale prise en charge en partie par NIH / NCRR Colorado CTSI Grant Nombre UL1 RR025780 et les troubles Rocky Mountain Neurlogical Core Center Grant NIH P30NS048154. Dr Sascha du Lac de l&#39;Institut Salk nous a fourni les souris GlyT2-GFP.

1. Génotypage optique 1. optique génotypage des chiots souris <ol><li> Arrivée à l&#39;expression du marqueur fluorescent respectif au moyen d&#39;un pointeur laser de la longueur d&#39;onde d&#39;excitation appropriée (405 nm dans les expériences décrites ici) et des lunettes de filtre de blocage de la longueur d&#39;onde d&#39;excitation correspondant, mais en passant la longueur d&#39;onde d&#39;émission (450 - 700 nm dans les expériences décrites ici) . Dirigez le pointeur laser à l&#39;arrière de la tête ou de la moelle épinière du chiot de la souris (voir la figure 1). Évitez de diriger le laser dans les yeux et une longue exposition de la peau à la lumière laser. </li></ol> 2. optique génotypage des animaux âgés <ol><li> Profondément anesthésier la souris (p14 ans à p138 dans les expériences décrites ici) avec un surdosage de pentobarbital par une injection intrapéritonéale (120 mg / kg de poids corporel). Confirmez anesthésie appropriée en cochant les réflexes de l&#39;animal (pincer brièvement la pointe du ee oreille ou l&#39;une des pattes arrière pour susciter le réflexe de retrait de la patte ou oreille). </li><li> Remarque: Malgré l&#39;utilisation d&#39;un surdosage de pentobarbital (120 mg / kg de poids corporel) nous nous référons à la procédure d&#39;injection comme «anesthésie profonde&quot; à la place de l&#39;euthanasie, parce que l&#39;animal est idéalement encore vivant (ie son cœur bat encore), lorsque le la chirurgie et la perfusion ne commencent. Ceci assure une perfusion plus efficace des organes internes, y compris le cerveau. </li><li> Une fois que l&#39;animal ne présente pas de réflexe, retirez soigneusement la peau recouvrant le crâne (figure 2A) en faisant une incision dans la peau qui recouvre l&#39;arrière de la tête et à l&#39;abdomen coupe du crâne. Exposer le crâne découvert à la lumière laser et d&#39;observer la fluorescence à travers les lunettes de filtres comme décrit ci-dessus. Si un signal de GFP positive est observée, passez à l&#39;étape 2, sinon, sacrifier l&#39;animal par décapitation (deuxième / assurant forme d&#39;euthanasie suite à notreRèglements IACUC). </li></ol> Note: Chez la souris, même plus âgés (&gt; 1 mois) la fluorescence peut être observée à travers les yeux de l&#39;animal. 2. Transcardial Perfusion et préparation cerveau <ol><li> Perfuser transcardiaque avec glacée tampon phosphate salin (PBS; NaCl: 137 mM, KCl: 2,7 mM, KH 2 PO 4: 1,76 mM, Na 2 HPO 4: 10 mm) à l&#39;aide d&#39;une aiguille de seringue de 30 G pour éliminer en grande partie le sang l&#39;animal. <ol><li> Tout d&#39;abord, ouvrir avec précaution la cage thoracique avec des ciseaux pointus, puis pousser l&#39;aiguille dans le ventricule gauche du cœur. Commencez le pompage du PBS dans le cœur et l&#39;aorte et immédiatement après cette étape ouvre l&#39;oreillette droite du cœur avec les ciseaux pour permettre au sang de quitter le corps. Remarque: La perfusion prend de 5 à 10 min selon la taille de l&#39;animal. </li></ol></li><li> Après exsanguination par perfusion, décapiter l&#39;animal, assurer sa tête avec la broche needles (ou 30 g aiguilles de seringues) en les perçant à travers les orbites dans un plat de préparation et retirer le cerveau du crâne. <ol><li> Tout d&#39;abord, utiliser des ciseaux bien aiguisés pour couper la peau recouvrant le crâne: faire une petite incision dans le dos de la tête, puis couper le long de la ligne médiane sur la face dorsale de la tête, couper les côtés juste caudale des yeux de l&#39;animal et la coupe enfin dans la direction caudale pour supprimer complètement les volets de la peau à l&#39;arrière de la tête. </li><li> Ensuite, répéter le même schéma de coupe pour le crâne lui-même, assurez-vous de retirer les deux cochlées dans le processus, parce que cela va simplifier considérablement le retrait du tronc cérébral à la fin. Après cette procédure, la moitié caudale du cerveau devrait se situer complètement exposé. </li><li> Dans l&#39;étape suivante, utiliser une lame de rasoir ou un scalpel pour couper à travers l&#39;ensemble du cerveau antérieur à un angle d&#39;environ 45 ° et environ 2 mm rostrale du cervelet. Scoop sur la moitié avant séparée du cerveau avec abspatule ent. </li><li> Utilisez la spatule pour élever la moitié caudale du cerveau à son extrémité rostrale et couper ensuite à travers les nerfs crâniens qui sont encore connectés à la tige du cerveau sur sa face ventrale. Comme un résultat final, la moitié caudale du cerveau, y compris du tronc cérébral doit tomber librement hors du reste de la tête préparés pour animaux. </li><li> Retournez la moitié caudale retiré du cerveau pour exposer son côté ventral et une coupe le long du plan coronal juste rostrale (pour les injections de antérograde) ou tout simplement caudale (pour les injections rétrogrades) des &quot;ampoules&quot; ventre situés contenant le corps de trapèze (voir l&#39;étape 2.3). <ol><li> Toujours utiliser une lame de rasoir ou un scalpel pour la procédure de coupe pour minimiser la mort cellulaire provoquée par le stress mécanique excessive sur le tissu. En tant que résultat final, un explant de cerveau couvrant environ 1 cm de longueur et contenant le complexe olivaire supérieur le long de toutes les autres régions du cerveau aurait été obtenue. </li></ol></li></ol> &lt;/ li&gt; </ol> Remarque: Ce protocole illustre la procédure pour une injection de traceur dans le corps de trapèze située dans le tronc cérébral. Adapter l&#39;emplacement et l&#39;orientation des plans de coupe et les sites d&#39;injection selon les besoins. Si les régions du cerveau fluorescence d&#39;intérêt se trouvent assez près de la surface du cerveau, de sorte qu&#39;ils puissent être identifiés et injectés sans couper le cerveau (voir Figure 2B), puis l&#39;étape de coupe coronale peut être omis. <ol start="3"><li> Identifier le corps de trapèze comme deux &quot;ampoules&quot; éminents ventraux contenant le noyau ventral du corps de trapèze (VNTB). </li></ol> Remarque: Pour plus de renseignements concernant l&#39;emplacement anatomique stéréotaxique approximative de ces plans de coupe, voir Franklin &amp; Paxinos, 2008. 78 du Groupe spécial de l&#39;atlas, Bregma ~ -5,7 mm montre le noyau médial du corps de trapèze (= MNTB) étiqueté comme &quot;Tz ». Panneau 69 montre le noyau ventral de la bo de trapèzedy (VNTB) étiqueté comme &quot;MVPO&quot; (de noyau periolivary medioventral) 19. 3. antérograde / rétrograde Tracing Remarque: Effectuer toutes les procédures suivantes à la température ambiante (25 ° C). <ol><li> Après la coupe, placer l&#39;expiant du tronc cérébral dans un plat de préparation contenant oxygéné (95% O 2, CO 2 5%) dissection solution (NaCl: 125 mM, KCl: 2,5 mM, MgCl 2: 1 mM, CaCl 2: 0,1 mM, glucose : 25 mM, NaH 2 PO 4: 1,25 mM, NaHCO 3: 25 mM, de l&#39;acide ascorbique: 0,4 mM, myo-inositol: 3 mM, acide pyruvique: 2 mM), en le fixant avec 30 g aiguilles de seringue. Assurez-vous que la zone d&#39;injection est orientée vers le haut. </li><li> Tirer pipettes d&#39;injection à partir de verre de borosilicate et de les remplir avec l&#39;une des trois solutions suivantes: a) une solution à 1,0 mg / ml de toxine cholérique sous-unité b conjugué à un fluorophore Alexa 555 dans du PBS 12 à 13 (principalement utilisé pour le transport rétrograde), b ) une -d 1%ilution salée à 0,9% de dextran tétraméthylrhodamine 555 (3.000 MW, principalement utilisé pour le transport rétrograde) ou c) une dilution à 1% dans une solution saline à 0,9% de 10.000 MW dextran-TRITC 555 (principalement utilisé pour le transport antérograde). <ol><li> Veiller à ce que des résistances gamme de pipettes d&#39;injection entre 2,5 et 3,5 MOhm et qu&#39;ils sont fabriqués dans 3 - 4 cycles de traction. Pour les expériences décrites ici, faire cela par un algorithme tirant pré-programmé sur l&#39;extracteur de la pipette. </li></ol></li><li> Eclairer l&#39;explantation de cerveau à l&#39;aide d&#39;un pointeur laser monté statiquement de la longueur d&#39;onde appropriée (point n ° 2 sur la figure 3A; 405 nm de longueur d&#39;onde dans les expériences décrites ici). Utiliser le pointeur laser en tant que guide pour les injections, et diriger le faisceau laser au niveau du noyau du cerveau marqué par fluorescence ou des cellules d&#39;intérêt qui sera injecté. </li><li> Trouvez et observer la zone de cible éclairée par le biais d&#39;un microscope binoculaire, tout en portant les lunettes de filtres compatibles (450 - 700 nm filtre passe-bande dans les expériences décrites ici). Insérez l&#39;électrode d&#39;injection par l&#39;intermédiaire du micromanipulateur dans la zone d&#39;intérêt. </li><li> Injecter la substance de traceur. Les injections se composent de 2 - 10 impulsions de pression à 15 psi pendant 50 ms chacune, au moyen d&#39;un dispositif d&#39;injection sous pression, dirigé perpendiculairement à la région d&#39;intérêt (ROI) dans la même section du cerveau. Administrer chaque impulsion de pression à des intervalles de 10 à 15 secondes pour permettre au colorant de se propager. </li><li> Dans le cas des injections de tétraméthylrhodamine (TRITC), stimuler électriquement en outre à améliorer l&#39;absorption du colorant par électroporation avec l&#39;électrode placée dans la zone d&#39;intérêt de cerveau (MNTB VNTB et dans les expériences décrites ici). <ol><li> Utilisation 8 impulsions TTL de 8 Volts pendant 50 ms à 50 ms, des intervalles interimpulsions entraînés par un stimulateur et amplifiés à 55 V avec une unité d&#39;isolation de stimulation (éléments de n ° 7 et 9 sur la figure 3B). Utilisez 10 - 20 répétitions de ce protocole, adminisnominatives sur plusieurs minutes 7,8. Assurez-vous à la masse l&#39;électrode correctement - le fil de mise à la terre doit être connecté à la solution de bain! </li></ol></li><li> Vérifiez pour le succès de l&#39;injection. Depuis un traceur fluorescent à une longueur d&#39;onde d&#39;émission plus longue est également émettre un signal fluorescent lors de l&#39;excitation de laser avec des longueurs d&#39;onde plus courtes, vérifier visuellement pour l&#39;absorption de colorant / propager dans la zone cible injecté tout en éclairant la surface avec le laser et l&#39;observation à travers des lunettes filtrantes. </li></ol> 4. Incubation <ol><li> Après l&#39;injection, incuber les tronc cérébral dans le liquide céphalo-rachidien artificiel oxygénée (ACSF; NaCl: 125 mM, KCl: 2,5 mM, MgCl 2: 1 mM, CaCl 2: 2 mM, glucose: 25 mM, NaH 2 PO 4: 1,25 mM, NaHCO 3: 25 mM, de l&#39;acide ascorbique: 0,4 mM, myo-inositol: 3 mM, acide pyruvique: 2 mM, barbotage avec 95% de O 2 - 5% CO 2) à température ambiante (TA, 25 ° C) pendant 1 - 4 h, tandis quele colorant est transporté. Bubble la solution au cours de la période d&#39;incubation entier. </li><li> Par la suite, les transférer tronc cérébral dans du paraformaldéhyde 4% (PFA) dissous dans du PBS (environ 100 ml;. PH 7 pour le mélange PFA / PBS) et incuber à 4 ° C pour permettre post-fixation pendant une nuit (O / N). </li></ol> 5. tissus tranchage et de montage <ol><li> Le lendemain, laver le tronc cérébral trois fois dans du PBS (5 min pour chaque étape de lavage), le couvrir de 4% de gélose, puis les couper en 50 - 80 um d&#39;épaisses tranches sur une vibratome. Tranches de montage en utilisant un milieu de montage sur une lame de verre, et lamelle. </li><li> Eventuellement, étiqueter les sections avec Nissl fluorescente pendant 25 min (par exemple bleu Nissl à une dilution de 1: 100 dans AB médias). <ol><li> Pour préparer AB médias, mélanger 250 ml de 0,2 M de tampon phosphate (PB; 51 mM de KH 2 PO 4, 150 mM de Na 2 HPO 4), 15 ml de NaCl 5 M, 15 ml 10% de Triton-X, 220 ml ddH 2 O et 5 g d&#39;albumine de sérum bovin. </li><li> Preceet de réussir l&#39;étape de marquage par Nissl 3 étapes de lavage dans du PBS (10 minutes chacun). </li></ol></li></ol> Remarque: Dans les cas où des sections plus épaisses doivent être montés et analysé (dans les expériences décrites ici ces tranches étaient 100 - 500 microns d&#39;épaisseur pour préserver connexions axonales plus grandes distances), la technique peut être combiné avec compensation de tissu. Nous avons trouvé le ClearT2 12 à 20 soit un succès. Quand une étape de compensation de tissu est inclus, l&#39;exécuter avant de monter les sections.

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Am. 59 (5), 1222-1226 (1976).</li><li>Zwicker, E., Fastl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Psychoacoustics Facts and Models. , (1990).</li><li>Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+for+the+efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+DNA.">Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA.</a> Nucleic Acids Res. 15 (3), 1311-1326 (1987).</li><li>Klenchin, V. A., Sukharev, S. I., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrically+induced+DNA+uptake+by+cells+is+a+fast+process+involving+DNA+electrophoresis.">Electrically induced DNA uptake by cells is a fast process involving DNA electrophoresis.</a> Biophys J. 60 (4), 804-811 (1991).</li><li>Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+Slice+Culture+of+E18+Rat+Brains.">Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains.</a> J. Vis. Exp. (6), e235 (2007).</li><li>G&#228;hwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue.">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li><li>Tallini, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+transgenic+mice+express+enhanced+green+fluorescent+protein+in+central+and+peripheral+cholinergic+neurons.">BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons.</a> Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).</li></ol>

Nous avons rien à révéler.

A force générale in vitro traceur électroporation, par opposition aux études in vivo de traçage, est qu&#39;il donne aux chercheurs un meilleur accès à la zone du cerveau d&#39;intérêt et, par conséquent, ne comporte pas stéréotaxique coûteuse (et souvent électrophysiologique) équipement. En outre, la période de survie requis pour les explants de cerveau couvre seulement quelques heures (1 - 4) au lieu des jours, voire des semaines dans le cas d&#39;in vivo injections de traceu...

Afin de définir un certain neuronale (micro) circuit, il faut commencer par trouver les différents acteurs de ce circuit, et leur mode de connexion. Depuis la publication de Waller propos neurofiber traçage travers lesioning 1 une grande variété de techniques de traçage neuroanatomiques a été établi. Certaines de ces techniques peuvent être appliquées dans les tissus post-mortem 2-4 fixe, d&#39;autres comptent sur ​​le transport actif du colorant dans les neurones vivants, comme l&#39;a découvert en 1971 5-6. Celui-ci peuvent être subdivisés en deux groupes de discrimination entre les méthodes qui prennent avantage de rétrograde active (à partir de la zone injectée à la source d&#39;une projection donnée, ie. Le soma des neurones qui sont saillie vers ladite zone) et antérograde active (de la injecté zone à la cible d&#39;une projection donnée, ie. les projections axonales et les terminaisons axonales des neurones marqués) transport. En outre, dans certains cas, tramatériel de CER est injecté dans les animaux vivants qui a ensuite survivent à l&#39;injection de plusieurs jours ou semaines (en injections de traceurs in vivo), tandis que dans d&#39;autres cas cerveaux explantées sont injectés et incuber pendant plusieurs heures après l&#39;injection dans le liquide céphalo-rachidien artificiel (in vitro injections de traceurs) . Dans ce protocole, nous avons modifié un existant in vitro technique d&#39;électroporation 7-8 à étiqueter soma et les processus neuronale dans antérograde et rétrograde traçage des expériences utilisant dextran choleratoxine la sous-unité B et tétraméthylrhodamine que les substances de traçage. L&#39;objectif global de ce protocole est de fournir des neuroscientifiques un outil efficace de suivre les modèles de connectivité neuronale entre les différents noyaux du cerveau, tout en profitant des lignées de souris transgéniques et des équipements disponibles optique de base afin d&#39;augmenter la précision de ciblage lors des injections de traceurs. Bien que la méthode de traçage antérograde et rétrograde en utilisanttoxine cholérique et amine dextrane et leurs conjugués marqués par fluorescence respectifs sont pas nouvelles 9-13 (ce qui est la méthode de l&#39;électroporation, par exemple. Haas et al. 14), la combinaison d&#39;injections traçantes avec une électroporation dans une préparation in vitro impliquant des blocs de tissu de cerveau est un développement plus récent 7. Son principal avantage par rapport aux techniques de traçage de neurones en utilisant le même type de colorants traceurs dans les animaux vivants est l&#39;intensité de marquage accru, en raison de la plus grande efficacité avec laquelle le colorant est une électroporation repris par les neurones. Un avantage supplémentaire est la période d&#39;incubation de raccourci (obligatoire pour le transport de colorant) et de sa précision accrue cible lors de l&#39;injection du traceur, parce que l&#39;expérimentateur a le contrôle visuel sur la zone cible de l&#39;injection. Ce dernier signifie aussi qu&#39;aucun équipement stéréotaxique coûteux est nécessaire de trouver le noyau ou le cerveau zone d&#39;intérêt. Pour Addilement augmenter la précision du ciblage, nous avons profité d&#39;une lignée de souris transgénique qui exprime la GFP dans son sous-population glycinergique de neurones 15 et l&#39;équipement optique de base consistant en un pointeur de 405 nm lunettes de filtrage passe-bande de longueur d&#39;onde et l&#39;appariement laser à main (450 - 700 nm). Ainsi, nous avons réalisé une nouvelle augmentation significative dans le ciblage de précision en identifiant la zone d&#39;injection au travers de son signal fluorescent et en fournissant un moyen plus fin pour contrôler la propagation du colorant dans la zone d&#39;injection à travers l&#39;observation de l&#39;interaction entre le signal de la GFP indigène et le traceur fluorescence. Notre technique permet également de découvrir la fonctionnalité d&#39;un circuit en même temps que sa connectivité en identifiant les neurones inhibiteurs GFP-positives (ou d&#39;autres excitateurs dans des lignées de souris) qui ont été remplis avec le traceur. En résumé, nous avons amélioré un outil puissant pour étudier neuroscientifique le connectome du cerveau des vertébrés et évaluer til différentes fonctions neuro-anatomiques d&#39;un neurocircuit donné. En utilisant des souris transgéniques avec l&#39;équipement optique peu coûteux et largement disponible, nous avons réussi à augmenter significativement la précision de ciblage de nos injections. En outre, les souris transgéniques nous a permis d&#39;identifier le type de connexions tracées, ce qui a permis la découverte de la fonctionnalité d&#39;un microcircuit inhibitrice dans le tronc cérébral.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride&#160;</td>
			<td></td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td></td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate di-basic</td>
			<td></td>
			<td>S907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td></td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td></td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td></td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td>I5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td></td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine</td>
			<td></td>
			<td>A2153</td>
			<td>optional, for additional (immuno)histochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td></td>
			<td>X100</td>
			<td>optional, for additional (immuno)histochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol), 8000 MW</td>
			<td></td>
			<td>P2139</td>
			<td>optional, for brain clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F84</td>
			<td>optional, for brain clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choleratoxin subunit-b</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C-34776 (Alexa 555)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrane tetramethyl-rhodamine</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>D-7162 (Alexa 555)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Nissl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>N-21479 (blue)</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbi-tal</td>
			<td>Vortech Pharmaceuticals</td>
			<td>Fatal-Plus&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass filaments</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>G150F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Zeitz Instruments, Germany</td>
			<td>DMZ Universal Puller</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion setup</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser pointer&#160;</td>
			<td>laserpointerpro.com, Hong Kong</td>
			<td>HK-88007294 (405 nm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter/safety goggles</td>
			<td>Dragon Lasers, China</td>
			<td>LSG09 (band-pass 450-700 nm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bionocular microscope&#160;</td>
			<td>Wild Heerbrugg, Switzerland</td>
			<td>Wild M3</td>
			<td>Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer</td>
			<td>Parker Instruments</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC with installed MC Stimulus software</td>
			<td>Multi Channel Sys-tems, Germany (software)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-channel stimulator</td>
			<td>Multi Channel Sys-tems, Germany</td>
			<td>STG-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulation isolation unit</td>
			<td>A.M.P.I., Israel</td>
			<td>Iso-Flex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige, Japan</td>
			<td>YOU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica, Germany</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-guided neuronal tracing in brain explants

Nous présentons une technique qui combine un protocole vitro traceur dans d&#39;injection, qui utilise une série d&#39;impulsions électriques et de pression pour augmenter l&#39;absorption du colorant par électroporation dans des explants de cerveau avec un éclairage laser ciblée et correspondant à des lunettes filtrantes pendant la procédure. La technique décrite de l&#39;électroporation in vitro par lui-même des rendements relativement bon contrôle visuel pour ciblant certaines zones du cerveau. En combinant avec excitation laser de marqueurs génétiques fluorescentes et leur lecture à travers des lunettes de filtre bande-passe, qui peut ramasser les émissions des cellules / noyaux génétiquement marqués et le colorant de traçage fluorescent, un chercheur peut augmenter considérablement la précision des injections en trouvant la zone d&#39;intérêt et contrôle de la propagation de colorant / absorption dans la zone d&#39;injection beaucoup plus efficacement. En outre, la technique d&#39;éclairage au laser permet d&#39;étudier la fonctionnalité d&#39;une neurocircuit donnée par provIding informations sur le type de neurones se projetant dans une certaine zone dans les cas où l&#39;expression de la GFP est liée au type d&#39;émetteur exprimé par un sous-population de neurones.

Figures 1 et 2 montrent comment le pointeur laser et lunettes laser peuvent être utilisés pour le génotypage rapide et peu coûteuse GFP animaux positifs d&#39;une portée. Dans les cas de jeunes souriceaux, la technique peut être utilisée pour identifier de manière non invasive l&#39;étiquette de la GFP dans le cerveau de l&#39;animal à travers le crâne et la peau sus-jacente (figure 1A - D). Fluorescence émise peut être vu à travers la peau et le crâne des souriceaux au m...

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Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

Nous décrivons une technique d&#39;étiqueter les neurones et leurs processus via antérograde ou rétrograde traceurs injections dans les noyaux du cerveau en utilisant une préparation in vitro. Nous avons modifié une méthode existante de i n vitro traceur électroporation en profitant de marqué par fluorescence mutants de souris et de l&#39;équipement optique de base afin d&#39;augmenter la précision de l&#39;étiquetage.

Neuronal Tracing dans des explants de cerveau à guidage laser

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K vues.  University of Colorado School of Medicine.  Nous décrivons une technique d'étiqueter les neurones et leurs processus via antérograde ou rétrograde traceurs injections dans les noyaux du cerveau en utilisant une préparation in vitro. Nous avons modifié une méthode existante de i n vitro traceur électroporation en profitant de marqué par fluorescence mutants de souris et de l'équipement optique de base afin d'augmenter la précision de l'étiquetage. 

Vidéo: Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

Étiquetage DiOLISTIC des neurones à partir de rongeurs et non-humains tranches de cerveau des primates

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Recherche

Neurosciences

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Enregistrements tableau multi-électrodes des Avalanches neuronale dans des cultures organotypiques

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Rapide Micro-iontophorèse de glutamate et le GABA: un outil utile d&#39;étudier l&#39;intégration synaptique

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulation génétique des neurones du cervelet granules<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em&gt; À étudier neuronale Morphologie et migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Induire la plasticité de Astrocytic récepteurs neuronaux par manipulation des taux de combustion

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Injection virale intracérébro du cerveau de souris nouveau-né pour la transduction neuronale persistante et généralisée

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation of a given stimulus might be dependent on context and history. If this is actually the case, bi-directional interactions between the brain (or if need be a reduced model of it) and sensory-motor system can shed a light on how encoding and decoding of information is performed. Here an experimental system is introduced and described in which the activity of a neuronal element (i.e., a network of neurons extracted from embryonic mammalian hippocampi) is given context and used to control the movement of an artificial agent, while environmental information is fed back to the culture as a sequence of electrical stimuli. This architecture allows a quick selection of diverse encoding, decoding, and learning algorithms to test different hypotheses on the computational properties of neuronal networks.

In this paper, an experimental framework to perform closed-loop experiments is presented, in which information processing (i.e., coding and decoding) and learning of neuronal assemblies are studied during the continuous interaction with a robotic body.

En boucle fermée expériences neuro-robotique l&#39;analyse des propriétés de calcul de réseaux neuronaux

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

Transsynaptique génétique conditionnelle traçage dans le cerveau embryonnaire de souris

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imagerie biphotonique Calcium en Dendrites neuronales dans des tranches de cerveau

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively thin to properly visualize and access neurons for patch-clamping or imaging, and in vitro examination of brain circuitry is limited to only what is physically present in the acute slice. To maintain the benefits of in vitro slice experimentation while preserving a larger portion of presynaptic nuclei, we developed a novel slice preparation. This &#8220;wedge slice&#8221; was designed for patch-clamp electrophysiology recordings to characterize the diverse monaural, sound-driven inputs to medial olivocochlear (MOC) neurons in the brainstem. These neurons receive their primary afferent excitatory and inhibitory inputs from neurons activated by stimuli in the contralateral ear and corresponding cochlear nucleus (CN). An asymmetrical brain slice was designed which is thickest in the rostro-caudal domain at the lateral edge of one hemisphere and then thins towards the lateral edge of the opposite hemisphere. This slice contains, on the thick side, the auditory nerve root conveying information about auditory stimuli to the brain, the intrinsic CN circuitry, and both the disynaptic excitatory and trisynaptic inhibitory afferent pathways that converge on contralateral MOC neurons. Recording is performed from MOC neurons on the thin side of the slice, where they are visualized using DIC optics for typical patch-clamp experiments. Direct stimulation of the auditory nerve is performed as it enters the auditory brainstem, allowing for intrinsic CN circuit activity and synaptic plasticity to occur at synapses upstream of MOC neurons. With this technique, one can mimic in vivo circuit activation as closely as possible within the slice. This wedge slice preparation is applicable to other brain circuits where circuit analyses would benefit from preservation of upstream connectivity and long-range inputs, in combination with the technical advantages of in vitro slice physiology.

Integration of diverse synaptic inputs to neurons is best measured in a preparation that preserves all pre-synaptic nuclei for natural timing and circuit plasticity, but brain slices typically sever many connections. We developed a modified brain slice to mimic in vivo circuit activity while maintaining in vitro experimentation capability.

Préparation in vitro en tranches compensées pour imiter la connectivité du circuit neuronal In Vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...