Nous remercions le Dr Toshio Terashima de l&#39;Université de Kobe, au Japon, pour l&#39;enseignement de la technique de la chirurgie du larynx, et le Dr Lynn Enquist de l&#39;Université de Princeton pour fournir PRV-Bartha. Recherche a été soutenue par le NIH prix pionnier DP1 OD000448 Erich D. Jarvis et un prix NSF Graduate Research Fellowship à Gustavo Arriaga. Les chiffres de travail précédente de manière appropriée crédités sont utilisés dans le cadre du libre accès PLoS ONE licence Creative Commons (CC-BY) en conformité avec les politiques éditoriales de la revue.

NOTE: Toutes les procédures d&#39;animaux ont été examinés et approuvés par le Comité institutionnel de protection et d&#39;utilisation des animaux de l&#39;Université Duke. 1. Enregistrement des virus de la pseudo <ol><li> Nous obtenons virus vivant (PRV152) du laboratoire du Dr Lynn Enquist à l&#39;Université de Princeton à un titre de 1 x 10 9 pfu / m. Le protocole pour générer le virus a été publiée deux. </li><li> Aliquoter le virus à 20 pi par tube à l&#39;intérieur d&#39;une armoire et un magasin BSL-2 biosécurité à -80 ° C dans des conditions de biosécurité appropriées. </li><li> Décongeler une aliquote de PRV immédiatement avant injection. </li></ol> 2. Préparation chirurgicale pour injections dans le muscle <ol><li> Induire une anesthésie générale par injection intramusculaire de kétamine-xylazine (100 mg / kg de kétamine, 10 mg / kg de xylazine) et maintenir un plan anesthésique approprié en utilisant isofluorane. </li><li> Protéger les cornées avec une pommade ophtalmique. </li><li> Préparer til site chirurgical selon la technique aseptique en coupant les cheveux et la désinfection du site chirurgical avec gommages alternées de Bétadine et 70% d&#39;alcool (minimum de 3 cycles). Veillez à utiliser des champs stériles pour couvrir les zones chirurgicales. Assurez-vous d&#39;adhérer à des techniques stériles tout au long des procédures. </li><li> Faire une incision de la peau et de révéler le muscle d&#39;intérêt. Par exemple, pour accéder au muscle laryngé cricothyroïdienne il est nécessaire d&#39;enlever d&#39;abord la partie recouvrant le muscle sterno de. </li><li> Sceller toutes les muscles sectionnés avec colle tissulaire Vetbond. </li></ol> 3. Injection de PRV dans le muscle <ol><li> Charger le système d&#39;microseringue Nanofil de 10 pi avec une solution de PRV fraîchement décongelé, fixer une aiguille en acier inoxydable de 34 G, et monter avec précaution sur l&#39;appareil stéréotaxique. </li><li> Lentement effacer l&#39;espace mort et vérifiez que la solution quitte la pointe microseringue. Jeter fluide comme un déchet bioharzard. </li><li> Utilisation d&#39;un microP stéréotaxiqueDispositif OSITIONNEMENT placer soigneusement la pointe de la microseringue dans le muscle d&#39;intérêt et remplir lentement le muscle jusqu&#39;à ce qu&#39;une légère enflure est visible. La vitesse d&#39;injection varie en fonction de la taille du muscle et le volume à injecter. Par exemple, cinq injections de 200 nl (1 pi totale) à un taux de 4 nl / s devraient être faites 1 min part sur le même site pour remplir le muscle cricothyroïdienne. Déplacez la seringue à la prochaine musculaire d&#39;intérêt (le crico-aryténoïdienne latéral dans ce cas) et répétez la procédure d&#39;injection. Seulement une fois perforer chaque muscle. </li><li> Rétracter la microseringue après cinq minutes. </li><li> Sceller la rupture de l&#39;aponévrose en utilisant un adhésif de tissu Vetbond. </li><li> Après toutes les injections ont été réalisées, fermer la plaie avec de la colle tissulaire Vetbond. Selon vos INSTITUTIONNEL directives d&#39;utilisation des animaux locaux, des sutures ou des clips plaie peut être utilisé. </li><li> Surveiller l&#39;animal jusqu&#39;à décubitus sternal et de fournir l&#39;analgésie, de la nourriture, de l&#39;eau, et aux soins requis par ynos institutionnels directives d&#39;utilisation des animaux. </li><li> Après le temps de survie déterminée expérimentalement (dans ce cas, 90 h à l&#39;étiquette d&#39;ordre 2 neurones corticaux), sacrifier l&#39;animal par une overdose de pentobarbital et perfuser transcardiaque avec saline à 0,9% suivi par 4% de formaldéhyde dans 0,1 M de PBS. </li><li> Retirez et post-fixer le cerveau de 4% de formaldéhyde pendant 24 heures. </li><li> Cryoprotect du cerveau dans du tampon phosphate contenant 30% de saccharose pendant au moins 48 heures. </li></ol> 4. immunochimique Détection de eGFP <ol><li> Couper des sections à 40 um sur un microtome à glissière et économisez sections flottantes dans 0,1 M PBS. Sections plus minces, par exemple de 30 um, peuvent être utilisés lorsque la coloration sections montées. </li><li> Étancher sections pendant 30 min dans 0,3% H 2 O 2 dans PBS protégées de la lumière. </li><li> Bloquer antigènes non spécifiques dans les sections pendant 30 min dans du PBS contenant 0,3% de Tween 20 avec du sérum de chèvre normal à partir du Kit VECTASTAIN Elite (VE kit). </li><li&gt; Incuber sections bloqué pendant 3,5 heures chez le lapin anti-eGFP (1: 1 000) à température ambiante. </li><li> Lavez sections trois fois dans PBS pendant 5 min, puis les incuber pendant 1 heure dans un anticorps secondaire de chèvre anti-lapin de la VE kit à température ambiante. </li><li> Préparer la solution du kit ABC VE selon les instructions du fabricant. </li><li> Lavez sections trois fois dans PBS pendant 5 min, en les ensuite réagir pendant 1 heure dans une solution ABC de la VE kit à température ambiante. </li><li> Laver les sections trois fois dans du tampon phosphate pendant 10 minutes, et développer pendant 8 min dans un tampon phosphate, pH 7,4, contenant 0,05% de DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidine) et 0,015% de H 2 O 2. </li><li> Sections de montage sur des lames Superfrost Plus et les déshydrater à travers une série d&#39;alcool graduée (70%, 95%, 100% et 100% pendant 5 minutes chacun). </li><li> Désactivez les sections à travers deux lavages xylène (5 minutes chacun) et les diapositives avec lamelle Permount milieu de montage. </li><li> Image les sections montées sur un microscope. Le produit de réaction DAB inside les cellules doivent apparaître brun. Les images numérisées peuvent être de couleur inversé pour mettre en évidence les processus fines. </li></ol> 5. Préparation chirurgicale pour injection de traceurs dans les régions cérébrales Découvert par PRV Tracing <ol><li> Induire une anesthésie générale par injection intramusculaire de kétamine-xylazine (100 mg / kg de kétamine, 10 mg / kg de xylazine) et maintenir un plan anesthésique approprié en utilisant isofluorane. </li><li> Protéger les cornées avec une pommade ophtalmique. </li><li> Fixer la tête dans un cadre stéréotaxique appropriée. </li><li> Préparer le site chirurgical selon une technique aseptique en coupant les cheveux et la désinfection du site avec des gommages alternées de Bétadine et 70% d&#39;alcool (minimum de 3 cycles). </li><li> Faire une incision du cuir chevelu et se rétracter la peau sur la région du cerveau d&#39;intérêt. </li><li> Effectuer une petite craniotomie les coordonnées stéréotaxiques appropriées. Par exemple, les coordonnées de laryngeally relié cortex moteur identifié par un PRV en traçantn souris adulte sont de 1,2 mm et 0,2 mm latérale rostrale à Bregma. </li></ol> 6. L&#39;injection de dextrane Amines biotinylés en réflexion <ol><li> Préparer 7,5% Amines dextran biotinylé (BDA) en dissolvant 25 mg de BDA (10.000 MW) dans 333 ul de solution saline stérile. </li><li> Charger le système d&#39;micropipette Nanoject II avec une solution BDA suffisante pour les injections prévues. </li><li> Lentement effacer l&#39;espace mort et vérifier que la solution est de quitter la pointe de la micropipette. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un dispositif de micropositionnement stéréotaxique abaisser soigneusement la pointe de la micropipette dans la région du cerveau d&#39;intérêt et injecter lentement BDA. Ajuster le débit d&#39;injection en fonction de la taille de la zone à marquer. Par exemple, 12 injections de 4,6 nl devraient être faites à quatre endroits différents de 0,2 mm de distance (direction rostro-caudale) pour couvrir le cortex moteur laryngeally connecté chez la souris adulte. Le volume d&#39;injection final doit être ajustée en fonction de la taille de la région du cerveau d&#39;intérêt, En gardant à l&#39;esprit que l&#39;étiquette peut se propager à partir du noyau d&#39;injection par diffusion à travers les tissus du cerveau et le long des processus de neurones marqués. </li><li> Sceller le craniotomie utilisant ciment dentaire, et de fermer la plaie du cuir chevelu avec de la colle tissulaire Vetbond. </li><li> Surveiller l&#39;animal jusqu&#39;à décubitus sternal et de fournir l&#39;analgésie, de la nourriture, de l&#39;eau, et aux soins requis par vos directives institutionnelles de l&#39;utilisation des animaux. </li></ol> 7. L&#39;injection de toxine cholérique Subunit b dans le muscle <ol><li> Préparer une sous-unité de choléra% toxine B (CTB) en dissolvant 1 mg de CTB dans 100 ul de solution saline stérile. </li><li> Six jours après l&#39;injection dans le cerveau BDA, effectuer la préparation chirurgicale décrite ci-dessus pour les injections dans le muscle PRV. </li><li> Charger le système d&#39;microseringue Nanofil de 10 pi avec une solution CTb, fixer une aiguille en acier inoxydable de 34 G, et soigneusement le monter sur le dispositif stéréotaxique. </li><li> Effectuez les micro-injections dans le muscle (s) d&#39;intérêt comme précédemment déprescrite pour PRV. </li><li> Surveiller l&#39;animal jusqu&#39;à décubitus sternal et de fournir l&#39;analgésie, de la nourriture, de l&#39;eau, et aux soins requis par vos directives institutionnelles de l&#39;utilisation des animaux. </li><li> Trois jours après l&#39;injection CTb, sacrifier l&#39;animal par une overdose de pentobarbital et perfuser transcardiaque avec saline à 0,9% suivi par 4% de formaldéhyde dans 0,1 M de PBS. </li><li> Retirez et post-fixer le cerveau de 4% de formaldéhyde pendant 24 heures. </li><li> Cryoprotect du cerveau dans du tampon phosphate contenant 30% de saccharose pendant au moins 48 heures. </li></ol> 8. Détection de BDA et la CTB dans les mêmes sections <ol><li> Couper des sections à 40 um sur un microtome et économisez sections flottantes dans 0,1 M PBS. </li><li> Étancher sections pendant 30 min dans 0,3% H 2 O 2 dans PBS protégées de la lumière. </li><li> Préparer la solution du kit ABC VE selon les instructions du fabricant. </li><li> Lavez sections trois fois dans du PBS pendant 5 min, puis leur réagir pendant 1 heure dans une solution ABC à TA. </li&gt; <li> Laver les sections trois fois dans du tampon phosphate pendant 10 minutes, et développer pendant 8 min dans un tampon phosphate, pH 7,4, contenant 0,05% de DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidine), 0,015% de H 2 O 2, et 0,05% de chlorure de nickel. Le produit de la réaction DAB à l&#39;intérieur des cellules devrait apparaître en noir. </li><li> Sections de bloc pendant 30 minutes dans du PBS contenant 0,3% de Tween 20 avec du sérum de lapin normal à partir du Kit VECTASTAIN Elite. </li><li> Incuber sections bloqué pendant 2 heures dans de chèvre anti-CTB (1: 10,000) à la température ambiante. </li><li> Lavez sections trois fois dans du PBS pendant 5 min, puis les incuber pendant 1 heure dans un anticorps secondaire de lapin anti-chèvre de la VE kit à température ambiante. </li><li> Préparer la solution du kit ABC VE selon les instructions du fabricant. </li><li> Lavez sections trois fois dans du PBS pendant 5 min, puis leur réagir pendant 30 min dans une solution ABC à TA. </li><li> Laver les sections trois fois dans du tampon phosphate pendant 10 minutes, et pour développer jusqu&#39;à 8 min dans un tampon phosphate, pH 7,4, contenant 0,05% de DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidine) et 0,015% de H 2 O 2. Le produit de la réaction DAB à l&#39;intérieur des cellules devrait apparaître brun. </li><li> Sections de montage sur des lames Superfrost Plus et les déshydrater à travers une série d&#39;alcool graduée (70%, 95%, 100% et 100% pendant 5 minutes chacun). </li><li> Désactivez les sections à travers deux lavages xylène (5 minutes chacun) et les diapositives avec lamelle Permount milieu de montage. </li><li> Image les sections montées sur un microscope. </li></ol>

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No conflicts of interest declared.

Il ya un certain nombre de questions qui doivent être prises en considération lors de la planification d&#39;une expérience utilisant PRV152 4,21. Plus important encore, virus de la pseudorage est létale. Comme mentionné précédemment, les grands singes, dont les humains ne sont pas sensibles à l&#39;infection, mais des soins appropriés doivent être exercés pour protéger les autres animaux. Les souris adultes survivent généralement de cinq à sept jours après l&#39;inoculation avec la souche att...

Le traçage transsynaptique est devenu un outil puissant utilisé pour analyser efferents centrales qui régulent cibles périphériques par le biais des circuits multi-synaptiques. Cette approche a été le plus largement utilisé dans le cerveau de rongeurs en utilisant le virus de la pseudo pathogènes porcine (PRV), en particulier la souche atténuée PRV-Bartha décrite pour la première en 1961 12. Ici, nous présentons un protocole pour identifier la représentation corticale motrice des muscles spécifiques ou groupes de muscles à l&#39;aide d&#39;une souche de virus de la pseudorage recombinant (PRV152) exprimant la protéine de renforcement fluorescente verte (EGFP) gène rapporteur 2. La méthode décrite exploite le comportement des virus neurotropes, qui produisent une descendance infectieuse que les synapses croisées pour infecter d&#39;autres neurones dans un circuit fonctionnel 3,4,13. PRV152, qui est isogénique avec PRV-Bartha, seule traverse synapses rétrograde à travers la séquence hiérarchique des connexions synaptiques en dehors du site d&#39;infection 3,5 &lt;/ sup&gt;. En contrôlant avec précision le site de l&#39;infection périphérique, il est possible de limiter la pénétration du virus dans le cerveau à travers un sous-ensemble spécifique des motoneurones. Comme le virus infecte de manière séquentielle de chaînes de neurones connectés, le motif de signal de eGFP dans le cerveau résultant sera alors de résoudre le réseau de neurones qui sont reliés aux cellules infectées initialement. Un avantage supplémentaire de l&#39;utilisation de virus pour le traçage de neurones est l&#39;amplification de la protéine rapporteur (eGFP dans ce cas) dans les cellules infectées. Cette amplification de signal fournit un niveau de sensibilité qui permet la détection des projections même clairsemés. Par exemple, une projection creuse de vibrisses de cortex moteur aux neurones moteurs faciaux contrôlant les whiskers a été trouvé chez les rats en utilisant viralement exprimé la protéine fluorescente verte 14; études précédentes ont échoué à trouver cette projection utilisant des traceurs classiques sans amplification du gène rapporteur 11,15. Malheureusement, De nombreux vecteurs de traçage virales, comme celui utilisé dans l&#39;étude citée, ne traversent pas les synapses, ce qui limite leur utilisation pour le traçage des circuits multi-synaptiques. Bien que présentant des avantages distincts pour identifier le réseau de cellules participant à un circuit de moteur, la nature distribuée transsynaptique de traçage avec PRV-152 rend l&#39;interprétation de liaisons spécifiques dans le circuit difficile. Par conséquent, nous présentons une méthode simple pour valider les connexions spécifiques au sein de circuits identifiés en utilisant PRV-152 par double marquage utilisant des amines biotinylés dextran (BDA) et la sous-unité B de la toxine cholérique (CTB). L&#39;utilisation combinée de BDA et la CTB est une approche bien établie pour tracer des liens entre des ensembles spécifiques de neurones 6-8,11. Lorsqu&#39;ils sont utilisés ensemble, ces deux traceurs peuvent être visualisées dans la même section en utilisant un DAB à deux couleurs (3, 3 &#39;diaminobenzidine) procédure 16. Haut poids moléculaire BDA (BDA10kDa) a été choisi pour ce protocole parce qu&#39;il yOMAINES étiquetage détaillé des processus neuronaux 6,7,9. Des avantages supplémentaires de BDA10kDa sont les suivants: il est de préférence transporté dans le sens antérograde 6-8; il peut être livré par iontophorèse ou l&#39;injection de pression 6-8; il peut être visualisée par une simple avidine-HRP biotinylé de (ABC) 17 procédure; et il peut être imagée par microscopie optique ou électronique 6,7,18. La détection immunochimique de la CTB à la peroxydase et DAB a été choisi pour marquage rétrograde des motoneurones parce qu&#39;il est efficace à révéler les processus cellulaires, y compris les dendrites distales 10,19. Nous avons récemment utilisé cette approche pour identifier la voie de moteur vocal chez la souris et de révéler une connexion clairsemée du cortex moteur primaire des neurones moteurs du larynx, qui était auparavant supposées être absent 20.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoFil Microinjection System</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>IO-Kit</td>
			<td>34 gauge option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II Auto-Nanoliter Injector</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sliding microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SM2010 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VetBond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane (Forane)</td>
			<td>Baxter&#160;</td>
			<td>1001936060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine Swab Stick</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>2130-01</td>
			<td>200 count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated dextran amines</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D-1956</td>
			<td>10,000 MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudorabies virus</td>
			<td>Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University)</td>
			<td>PRV152</td>
			<td>Titer &#62; 1 x 107</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat)</td>
			<td>List Biological Laboratories</td>
			<td>703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin B Subunit</td>
			<td>List Biological Laboratories</td>
			<td>103B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-eGFP</td>
			<td>Open Biosystems</td>
			<td>ABS4528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3, 3&#39;-diaminobenzidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5905</td>
			<td>10 mg tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>Dilute to 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3410</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl &#38; Xylazine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K4138</td>
			<td>80 mg/mL &#38; 6 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3619</td>
			<td>1.0 M; pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>10X; pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pentobarbital</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3761</td>
			<td>50 mg/mL dose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td>Histological grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN Elite ABC Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optixcare opthalmic ointment</td>
			<td>Vet Depot</td>
			<td>1017992</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transsynaptic tracing from peripheral targets with pseudorabies virus followed by cholera toxin and biotinylated dextran amines double labeling

Le traçage transsynaptique est devenu un outil puissant utilisé pour analyser efferents centrales qui régulent cibles périphériques par le biais des circuits multi-synaptiques. Cette approche a été le plus largement utilisé dans le cerveau en utilisant le virus de la pseudorage porcine pathogène (PRV) 1. PRV ne pas infecter les grands singes, dont les humains, il est le plus souvent utilisé dans les études sur les petits mammifères, en particulier les rongeurs. La souche de la pseudorage PRV152 exprime la protéine fluorescente (eGFP) gène rapporteur verte améliorée et que traverse synapses fonctionnelles manière rétrograde à travers la séquence hiérarchique des connexions synaptiques de distance à partir du site d&#39;infection de 2,3. D&#39;autres souches de PRV ont des propriétés distinctes et microbiologiques peuvent être transportés dans les deux directions (PRV-Becker et Kaplan-PRV) 4,5. Ce protocole traitera exclusivement avec PRV152. En fournissant le virus à un site périphérique, par exemple muscle, il est possible de limiter l&#39;entrée du virus dans til cerveau à travers un ensemble spécifique de neurones. Le motif de signal de eGFP résultant dans tout le cerveau résout alors les neurones qui sont reliés aux cellules infectées initialement. Comme la nature distribuée de traçage transsynaptique par le virus de la pseudo rend l&#39;interprétation des connexions spécifiques au sein d&#39;un réseau identifié difficile, nous présentons une méthode sensible et fiable utilisant des amines biotinylés dextran (BDA) et la toxine du choléra sous-unité B (CTB) pour confirmer les connexions entre les cellules identifiées à l&#39;aide PRV152. La détection immunochimique de BDA et la CTB à la peroxydase et DAB (3, 3 &#39;diaminobenzidine) a été choisi parce qu&#39;ils sont efficaces à révéler les processus cellulaires, y compris les dendrites distales 6-11.

Coloration pour eGFP devrait commencer à montrer des signaux faibles dans les neurones moteurs primaires d&#39;environ 72 heures après l&#39;injection dans le muscle PRV152. La réplication et de transport transsynaptique du virus sont titer- et dépendante du temps 4. Environ 90 heures après l&#39;injection, eGFP coloration va révéler signal fort dans les cellules infectées par ordre 2 e. Prolongement de la durée de survie révéleront 3 ème et cellules d&#39;ordre supérieur ma...

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Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling

Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.

Transsynaptique Tracing de cibles périphériques avec virus de la pseudo Suivi par la toxine cholérique et biotinylé Dextran Amines double marquage

Transsynaptic tracing has become a powerful tool used to analyze central efferents that regulate peripheral targets through multi-synaptic circuits. This ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.6K vues.  Duke University Medical Center. Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.

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In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

In utero électroporation suivie par la culture neuronale primaire pour étudier la fonction des gènes dans un sous-ensemble des neurones corticaux

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Recherche

Neurosciences

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Marquage rétrograde des cellules ganglionnaires de la rétine à l&#39;âge adulte de poisson zèbre avec des colorants fluorescents

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge in the field of virology; in particular for nuclear-replicating persistent DNA viruses that involve animal models for their study. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. Latent virus serves as reservoir, from which it reactivates and induces a new herpetic episode. The cell biology of HSV-1 latency remains poorly understood, in part due to the lack of methods to detect HSV-1 genomes in situ in animal models. We describe a DNA-fluorescent in situ hybridization (FISH) approach efficiently detecting low-copy viral genomes within sections of neuronal tissues from infected animal models. The method relies on heat-based antigen unmasking, and directly labeled home-made DNA probes, or commercially available probes. We developed a triple staining approach, combining DNA-FISH with RNA-FISH&#160;and immunofluorescence, using peroxidase based signal amplification to accommodate each staining requirement. A major improvement is the ability to obtain, within 10 &#181;m tissue sections, low-background signals that can be imaged at high resolution by confocal microscopy and wide-field conventional epifluorescence. Additionally, the triple staining worked with a wide range of antibodies directed against cellular and viral proteins. The complete protocol takes 2.5 days to accommodate antibody and probe penetration within the tissue.

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

We established a fluorescent in situ hybridization protocol for the detection of a persistent DNA virus genome within tissue sections of animal models. This protocol enables studying infection process by codetection of the viral genome, its RNA products, and viral or cellular proteins within single cells.

Détection du génome et des transcriptions d&#39;un virus à ADN persistant dans neuronaux tissus par fluorescence In situ L&#39;hybridation combinée avec immunocoloration

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis of primary cultures of neurons. We describe a set of procedures for: labeling newborn mice to be genotyped, rapid genotyping, and establishing low-density cultures of brain neurons from these mice. Individual mice are labeled by tattooing, which allows for long-term identification lasting into adulthood. Genotyping by the described protocol is fast and efficient, and allows for automated extraction of nucleic acid with good reliability. This is useful under circumstances where sufficient time for conventional genotyping is not available, e.g., in mice that suffer from neonatal lethality. Primary neuronal cultures are generated at low density, which enables imaging experiments at high spatial resolution. This culture method requires the preparation of glial feeder layers prior to neuronal plating. The protocol is applied in its entirety to a mouse model of the movement disorder DYT1 dystonia (&#916;E-torsinA knock-in mice), and neuronal cultures are prepared from the hippocampus, cerebral cortex and striatum of these mice. This protocol can be applied to mice with other genetic mutations, as well as to animals of other species. Furthermore, individual components of the protocol can be used for isolated sub-projects. Thus this protocol will have wide applications, not only in neuroscience but also in other fields of biological and medical sciences.

We describe procedures for labeling and genotyping newborn mice and generating primary neuronal cultures from them. The genotyping is rapid, efficient and reliable, and allows for automated nucleic-acid extraction. This is especially useful for neonatally lethal mice and their cultures that require prior completion of genotyping.

Rapid génotypage des animaux Suivi par Établir des cultures primaires de neurones du cerveau

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

Transsynaptique génétique conditionnelle traçage dans le cerveau embryonnaire de souris

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly committed intermediate progenitor subtypes. Each of these subtypes expresses a set of specific molecular markers that, together with specific morphological criteria, can be used for their identification. Typically, immunofluorescent techniques are applied involving subtype-specific antibodies in combination with exo- or endogenous proliferation markers. We herein describe immunolabeling methods for the detection and quantification of all stages of adult hippocampal neurogenesis. These comprise the application of thymidine analogs, transcardial perfusion, tissue processing, heat-induced epitope retrieval, ABC immunohistochemistry, multiple indirect immunofluorescence, confocal microscopy and cell quantification. Furthermore we present&#160;a sequential multiple immunofluorescence protocol which circumvents problems usually arising from the need of using primary antibodies raised in the same host species. It allows an accurate identification of all hippocampal progenitor subtypes together with a proliferation marker within a single section. These techniques are a powerful tool to study the regulation of different progenitor subtypes in parallel, their involvement in brain pathologies and their role in specific brain functions.

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

Immunohistochimie et d&#39;étiquetage multiple avec des anticorps de l&#39;espèce hôte mêmes pour l&#39;étude des adultes hippocampe neurogenèse

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake through electroporation in brain explants with targeted laser illumination and matching filter goggles during the procedure. The described technique of in vitro electroporation by itself yields relatively good visual control for targetting certain areas of the brain. By combining it with laser excitation of fluorescent genetic markers and their read-out through band-passing filter goggles, which can pick up the emissions of the genetically labeled cells/nuclei and the fluorescent tracing dye, a researcher can substantially increase the accuracy of injections by finding the area of interest and controlling for the dye-spread/uptake in the injection area much more efficiently. In addition, the laser illumination technique allows to study the functionality of a given neurocircuit by providing information about the type of neurons projecting to a certain area in cases where the GFP expression is linked to the type of transmitter expressed by a subpopulation of neurons.

We describe a technique to label neurons and their processes via anterograde or retrograde tracer injections into brain nuclei using an in vitro preparation. We modified an existing method of in vitro tracer electroporation by taking advantage of fluorescently labeled mouse mutants and basic optical equipment in order to increase labeling accuracy.

Neuronal Tracing dans des explants de cerveau à guidage laser

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Improving the Application of High Molecular Weight Biotinylated Dextran Amine for Thalamocortical Projection Tracing in the Rat

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of its labeling was affected by various factors, here, we provide a refined protocol for the application of high molecular weight BDA for studying optimal neural labeling in the central nervous system. After stereotactic injection of BDA into the ventral posteromedial nucleus (VPM) of the thalamus in the rat through a delicate glass pipette, BDA was stained with fluorescent streptavidin-Alexa (AF) 594 and counterstained with fluorescent Nissl stain AF500/525. On the background of green Nissl staining, the red BDA labeling, including neuronal cell bodies and axonal terminals, was more distinctly demonstrated in the somatosensory cortex. Furthermore, double fluorescent staining for BDA and the calcium-binding protein parvalbumin (PV) was carried out to observe the correlation of BDA labeling and PV-positive interneurons in the cortical target, providing the opportunity to study the local neural circuits and their chemical characteristics. Thus, this refined method is not only suitable for visualizing high quality neural labeling with the high molecular weight BDA through reciprocal neural pathways between the thalamus and cerebral cortex, but also will permit the simultaneous demonstration of other neural markers with fluorescent histochemistry or immunochemistry.

Here, we present a refined protocol to effectively reveal biotinylated dextran amine (BDA) labeling with a fluorescent staining method through a reciprocal neural pathway. It is suitable for analyzing the fine structure of BDA labeling and distinguishing it from other neural elements under a confocal laser scanning microscope.

Amélioration de l’Application de poids moléculaire élevé biotinylé Dextran Amine pour la Projection de Thalamocortical suivi chez le Rat

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of ...

Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate decisions, will be crucial to design therapeutic strategies for many diseases affecting the nervous system. Current methods to track cell populations rely on their final outcomes in still images and they generally fail to provide sufficient temporal resolution to identify behavioral features in single cells. Moreover, variations in cell death, behavioral heterogeneity within a cell population, dilution, spreading, or the low efficiency of the markers used to analyze cells are all important handicaps that will lead to incomplete or incorrect read-outs of the results. Conversely, performing live imaging and single cell tracking under appropriate conditions represents a powerful tool to monitor each of these events. Here, a time-lapse video-microscopy protocol, followed by post-processing, is described to track neural populations with single cell resolution, employing specific software. The methods described enable researchers to address essential questions regarding the cell biology and lineage progression of distinct neural populations.

A robust protocol to monitor neural populations by time-lapse video-microscopy followed by software-based post-processing is described. This method represents a powerful tool to identify biological events in a selected population during live imaging experiments.

Vivre l’imagerie suivie d’une cellule unique de suivi pour surveiller la biologie cellulaire et la Progression de la lignée de plusieurs Populations de neurones

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate ...

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. Additionally, epigenetic chromatin modifications, like histone methylation, have an important role for establishing and maintaining specific cell fates within this process. The vast majority of histone methylation occurs on the flexible histone tail, which is accessible to histone modifiers, erasers, and histone reader proteins. In contrast, H3K79 methylation is located in the globular domain of histone 3 and is implicated in different developmental functions. H3K79 methylation is evolutionarily conserved and can be found in a wide range of species from Homo sapiens to Saccharomyces cerevisiae. The modification occurs in different cell populations within organisms, including neural progenitors. The location of H3K79 methylation in the globular domain of histone 3 makes it difficult to assess. Here, we present methods to isolate and culture cortical progenitor cells (CPCs) from embryonic cortical brain tissue (E11.5-E14.5) or cerebellar granular neuron progenitors (CGNPs) from postnatal tissue (P5-P7), and to efficiently immunoprecipitate H3K79me2 for quantitative PCR (qPCR) and genome-wide sequencing.

We present an effective and reproducible method to isolate and culture neural progenitor cells from embryonic and postnatal brain tissue for chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - a histone mark located within the globular domain of histone 3.

Isolement et culture des progéniteurs neurones suivie par immunoprécipitation de la chromatine de marque d’Histone 3 Lysine 79 MBD

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...