Authors would like to thank Charisse Montgomery for her editing service. A. Alomran&#8217;s work partially fulfills the requirements for a master&#8217;s degree in Pharmacology.This work is funded by The University of Toledo&#8217;s intramural startup fund for W.A.A and NIH grant (DK080640) for S.M.N.

Les procédures pour l&#39;utilisation des animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation (IACUC) de l&#39;Université de Toledo, conformément aux directives du Comité soin et l&#39;utilisation institutionnelle animal aux National Institutes of Health et le Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. 1. Extraction du cerveau, le sectionnement et de tissus Préparation <ol><li> Sacrifiez-souche de type sauvage de la souris C57BL / 6 par euthanasie profondément avec le CO 2 asphyxie pendant 5 min. Assurer la mort par dislocation cervicale. </li><li> Nettoyez la tête de souris avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Effectuer craniectomy l&#39;aide de ciseaux et des pinces stériles d&#39;abord en tirant la peau de, en commençant par le haut de la tête pour exposer le crâne. </li><li> Puis, quand le crâne est exposé, éliminer le crâne par pelage la pièce par pièce osseuse, à partir du côté postérieur et se déplaçant vers le côté antérieur. Soyez prudent de ne pas détruire les ventricules du cerveau. </li><li>Recueillir l&#39;ensemble du cerveau. </li><li> Placer le cerveau dans une boîte de 100 mm de Pétri contenant du milieu DMEM / haut-glucose supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et une solution de pénicilline / streptomycine 1% contenant 10 000 unités / ml de pénicilline et 10 000 ug / ml de streptomycine et préchauffé à 37 ° C. </li><li> Trancher le cerveau sur le plan sagittal médian à la main avec une lame tranchante, et d&#39;obtenir la première section de 100-200 mm de chaque moitié en utilisant un vibratome. </li><li> Rincer le tissu cérébral avec une solution saline tamponnée au phosphate C (1x PBS) préchauffé à 37 °. </li><li> Placer immédiatement la section du cerveau dans du DMEM / media Haute-Glucose préchauffé à 37 ° C. </li></ol> 2. Configuration d&#39;imagerie en direct et configuration <ol><li> Placez les coupes de tissus du cerveau dans des boîtes de culture à fond de verre de 30 mm contenant 1 ml de DMEM / médias haute-glucose. Réglez l&#39;environnement de la chambre fermée de microscope à 37 ° C, 95% / 5% de O 2 / CO 2 contenu (Figure 1 </strong&gt;). </li><li> En utilisant un objectif 60X lentille à immersion d&#39;huile, de recueillir les cellules épendymaires / images de cils en plaçant d&#39;abord une goutte d&#39;huile sur la 60X objectif et se concentrant sur les cellules avec régulière DIC lumière transmise. </li><li> Ensuite, suivez la direction du mouvement de la bulle DMEM comme un guide pour l&#39;emplacement des cils épendymaire mobiles comme les coups ciliaires créent une sorte de mouvement de bulle dans la zone. Choisissez une zone contenant des cellules saines de cils mobiles dans le ventricule latéral du cerveau en utilisant le filtre DIC. Une fois les cils épendymaire sont trouvés, ajuster la lumière et de se concentrer pour obtenir une image satisfaisante. </li><li> Définissez les paramètres d&#39;imagerie en direct selon un but précis en utilisant un logiciel d&#39;imagerie Metamorph. Dans la présente démonstration, d&#39;acquérir vingt-quatre bits images avec la caméra binning mis à 1 x 1 combiné avec 60X objective et 5-10 ms temps d&#39;exposition. </li><li> Recueillir les images DIC en ouvrant l&#39;ouverture de microscope à un niveau optimal afin d&#39;avoir une exp minimumOsure temps. Respecter les flux des images en direct à la caméra pour permettre l&#39;acquisition d&#39;image rapide et immédiate sans délai. Calculer la vitesse de battement des cils sur la base de l&#39;exigence des temps d&#39;exposition minimum pour obtenir un contraste d&#39;image suffisante. </li></ol> 3. Visualisation et analyse de données <ol><li> Calculer le nombre de coups de cils en comptant le nombre de coups en 1 min. Pour ce faire, en diminuant la vitesse de la vidéo et de compter le nombre de battements en utilisant un compteur de cellules ou un outil similaire. </li><li> Pour calculer la fréquence des passages à tabac, multiplier le temps d&#39;exposition au cours de laquelle la vidéo est enregistrée par le nombre de cadres ou d&#39;images time-lapse acquis pour obtenir le nombre de sec. (Exemple: temps d&#39;exposition 5 ms 200 images = 1,000 ms ou 1 sec). </li><li> Calculer le nombre de coups par seconde pour obtenir la fréquence qui est exprimée par le nombre de coups par un sec. Pour ce faire, en divisant le nombre de coups de cils plus d&#39;une seconde entre tempsval (Exemple: cils bat 50 fois dans une vidéo de 200 images enregistrées au temps d&#39;exposition de 5 ms soit 5 ms x 200 images = 1 sec; désormais diviser 50 battements par 1 sec = 50 Hz). </li><li> Calculer l&#39;angle ciliaire battant en évaluant le chemin emprunté par les cils épendymaire pendant les deux coups de puissance et de récupération. Effectuez cette selon une méthode décrite précédemment, avec des modifications mineures 11. La précision du mouvement des cils individu est observée au cours du cycle complet de battement. </li><li> Sur une feuille d&#39;acétate placé sur le moniteur, tracez une ligne horizontale le long du bord épendymaire et une ligne verticale à travers la position médiane des cils au début de la course de puissance. </li><li> Tracer la position précise du cadre de cil par image comme il se déplace vers l&#39;avant pendant la course de puissance. D&#39;une manière similaire, tracer le mouvement des cils lors de la course de récupération. </li><li> Calculer l&#39;angle ciliaire raclée de la déviation maximale du cil de la ligne médiane lors de til course de puissance ainsi que la course de récupération. </li></ol> 4. Calcium enregistrement d&#39;un signal <ol><li> Après trancher le cerveau, rincer rapidement la tranche de cerveau avec 1x PBS ou du PBS de Dulbecco (pH 7,0). Préparer une solution fraîche Fluo-2 pour éviter l&#39;extinction de fluorescence et d&#39;obtenir un bon rapport signal-sur-bruit. </li><li> Préparer mM solution 1 de Fluo-2 solution dans le diméthylsulfoxyde (DMSO), mélanger et vortex la solution pendant au moins 5 minutes afin de garantir Fluo-2 est homogène dissous dans du DMSO. </li><li> Diluer la solution mère de Fluo-2 dans 500 ml de DMEM / haut-glucose supplémenté avec 2% de B27 préchauffée à 37 ° C jusqu&#39;à une concentration finale de 20 mg / ml. NOTE: B-27 est un supplément gratuit de sérum optimisé contenant de la vitamine A, cocktail antioxydant et de l&#39;insuline utilisé pour soutenir la viabilité à court ou à long terme de l&#39;hippocampe et d&#39;autres neurones du SNC. </li><li> Incuber immédiatement la tranche de cerveau avec 20 mg / ml Fluo-2 pendant 30 min à 37 ° C dans une plaque à fond de verre. </li><li> Pour déterminer la concentration de charge optimal de fluorophore de calcium Fluo-2 et pour éviter la toxicité de cellules de colorant de calcium, les cellules de provocation avec de l&#39;ATP, et de vérifier la viabilité des cellules en déterminant le déroulement dans le temps et l&#39;amplitude de crête de signaux de calcium en réponse à l&#39;ATP. </li><li> Noter la vidéo pour l&#39;oscillation de calcium à un taux de capture de 5 ms pour un minimum de 1 seconde (200 images par seconde), avec des longueurs d&#39;onde d&#39;excitation et d&#39;émission de 488 nm et 515 nm, respectivement (film 2). </li><li> Pour distinguer le signal Fluo-2 de calcium autofluorescence ou mouvement artefacts, veiller à ce que les intensités émises à 515 nm sont surveillés séparément. REMARQUE: Fluo-2 ne soit pas la fluoremetric de calcium apte à quantifier calcium intracellulaire. Cependant, il est d&#39;une excellente dynamique colorant de calcium pour détecter des changements rapides de calcium, tels que les oscillations de calcium. Pour la quantification de calcium plus précis, Fura-2 est recommandé. Cependant, les changements dynamiques de Fura-2 sont limitées par son ratiométriquenature du colorant. </li><li> Suivez les formules fournies par le fabricant pour calculer les valeurs de calcium intracellulaires libres exactes. Exemple [Ca 2+] = K d × (R - R min) / (R max - R). Où Kd est la constante de dissociation du colorant libéré à partir du calcium, R est la fluorescence mesurée à 488, et R et R min max sont les rapports de fluorescence à minimum et maximum de concentration 12 ionique. </li></ol> 5. immunofluorescence Microscopie <ol><li> Fixer les coupes de cerveau avec une solution saline tamponnée au phosphate contenant 4% de paraformaldehyde (PFA) et 2% de saccharose pendant 10 min. Alternativement, fixer l&#39;ensemble du cerveau à l&#39;article PFA, puis 4% en sections de 50 mm en utilisant un cryostat. </li><li> Laver le tissu trois fois avec PBS 1x pendant 5 minutes à chaque fois. </li><li> Incuber la tranche de cerveau avec une solutià 0,1% de Triton-X dans 1 x PBS pendant 5 minutes, puis rincer trois fois avec du 1 x PBS pendant 5 min à chaque fois. </li><li> Incuber la tranche de cerveau avec un anticorps primaire de souris, antiacetylated a-tubuline, utilisé à une dilution de 1: 5000 dans 10% de FBS dans du PBS 1x pendant une heure à température ambiante (TA) ou une nuit à 4 ° C. </li><li> Laver le tissu trois fois avec PBS 1x pendant 5 minutes à chaque fois. </li><li> Incuber la tranche de cerveau dans un anticorps secondaire anti-IgG de souris fluorescéine à une dilution de 1: 500 dans 10% de FBS dans du PBS 1x solution pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Avant d&#39;observation sous un microscope à fluorescence, contre-coloration avec la section 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 5 minutes pour colorer le noyau (ou ADN) 13. Pour minimiser photoblanchiment, l&#39;image des sections immédiatement avec un minimum de temps possible de l&#39;exposition. </li></ol>

<ol>
	<li>AbouAlaiwi, W. A., Lo, S. T., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia:+Highly+sophisticated+biological+sensors.">Primary cilia: Highly sophisticated biological sensors.</a> Sensors. 9 (9), 7003-7020 (2009).</li><li>Nonaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomization+of+left-right+asymmetry+due+to+loss+of+nodal+cilia+generating+leftward+flow+of+extraembryonic+fluid+in+mice+lacking+kif3b+motor+protein.">Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking kif3b motor protein.</a> Cell. 95 (6), 829-837 (1998).</li><li>Satir, P., Christensen, S. 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Ependymal cells along the lateral ventricle express functional p2x(7) receptors.</a> Purinergic signalling. 5 (3), 299-307 (2009).</li><li>Appelbe, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+mouse+jhy+gene+causes+abnormal+ciliary+microtubule+patterning+and+juvenile+hydrocephalus.">Disruption of the mouse jhy gene causes abnormal ciliary microtubule patterning and juvenile hydrocephalus.</a> Developmental biology. 382 (1), 172-185 (2013).</li><li>Sawamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+neurons+follow+the+flow+of+cerebrospinal+fluid+in+the+adult+brain+(New+York,+N.Y.).">New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain (New York, N.Y.).</a> Science. 311 (5761), 629-632 (2006).</li><li>Banizs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+cilia+lead+to+altered+ependyma+and+choroid+plexus+function,+and+result+in+the+formation+of+hydrocephalus.">Dysfunctional cilia lead to altered ependyma and choroid plexus function, and result in the formation of hydrocephalus.</a> Development. 132 (23), 5329-5339 (2005).</li><li>Kawanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilostazol+prevents+endothelin-induced+smooth+muscle+constriction+and+proliferation.">Cilostazol prevents endothelin-induced smooth muscle constriction and proliferation.</a> PloS one. 7 (9), e44476 (2012).</li><li>Liu, T., Jin, X., Prasad, R. M., Sari, Y., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+types+of+ependymal+cells+with+intracellular+calcium+oscillation+are+characterized+by+distinct+cilia+beating+properties.">Three types of ependymal cells with intracellular calcium oscillation are characterized by distinct cilia beating properties.</a> J Neurosci Res. 92 (9), 1199-1204 (2014).</li><li>Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+ciliary+beat+pattern+and+beat+frequency+using+digital+high+speed+imaging:+Comparison+with+the+photomultiplier+and+photodiode+methods.">Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: Comparison with the photomultiplier and photodiode methods.</a> Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).</li><li>Nauli, S. M., Jin, X., AbouAlaiwi, W. A., El-Jouni, W., Su, X., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-motile+primary+cilia+as+fluid+shear+stress+mechanosensors.">Non-motile primary cilia as fluid shear stress mechanosensors.</a> Methods in enzymology. 525, 1-20 (2013).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survivin-induced+abnormal+ploidy+contributes+to+cystic+kidney+and+aneurysm+formation.">Survivin-induced abnormal ploidy contributes to cystic kidney and aneurysm formation.</a> Circulation. 129 (6), 660-672 (2014).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+polycystin-2+is+a+mechanosensitive+calcium+channel+involved+in+nitric+oxide+signaling+cascades.">Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades.</a> Circulation research. 104 (7), 860-869 (2009).</li><li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilioplasm+is+a+cellular+compartment+for+calcium+signaling+in+response+to+mechanical+and+chemical+stimuli.">Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (11), 2165-2178 (2014).</li><li>Praetorius, H. A., Spring, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bending+the+mdck+cell+primary+cilium+increases+intracellular+calcium.">Bending the mdck cell primary cilium increases intracellular calcium.</a> The Journal of membrane biology. 184 (1), 71-79 (2001).</li><li>Smith, C. M., Radhakrishnan, P., Sikand, K., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+ethanol+and+acetaldehyde+on+brain+ependymal+and+respiratory+ciliary+beat+frequency.">The effect of ethanol and acetaldehyde on brain ependymal and respiratory ciliary beat frequency.</a> Cilia. 2 (1), 5 (2013).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

On décrit ici est un protocole de préparation de tissu de cerveau de souris à la fois pour l&#39;imagerie en temps réel, et la microscopie de fluorescence qui fournit une observation attentive rapide et sensible des cils épendymaire dans les ventricules du cerveau. Cette technique ne se limite pas au seul ventricule latéral; il pourrait être utilisé pour observer les franges dans une autre ventricules du cerveau. Cette technique d&#39;imagerie fournit un flux en direct qui ressemble le mouvement de la CSF par ba...

Les cils sont des organites à base de microtubules sensoriels qui se prolongent à partir de la surface cellulaire dans l&#39;environnement extracellulaire. Selon leur organisation des microtubules, les cils peuvent être classés en deux types - &quot;9 + 0» ou «9 + 2&quot;. Sur le plan fonctionnel, en fonction de leur mobilité, elles peuvent être classées comme mobiles ou non mobiles cils 1. Cils primaires est un terme couramment utilisé pour désigner «9 + 0&quot; cils non mobiles. Celles-ci ont neuf microtubules doublets parallèles (désignés par &#39;9&#39;) et une paire centrale de microtubules est absent à l&#39;intérieur de la gaine centrale (notée &quot;0&quot;). Toutefois, certains «9 + 0&quot; cils, comme cils nodale, qui règlent l&#39;embryon latéralité sont mobiles 2. D&#39;autre part, les cils mobiles sont caractérisés, en plus des neuf doublets de microtubules parallèles, par une paire de doublets central supplémentaire des microtubules et associé à des protéines motrices de la dynéine pour faciliter la motilité. En outre, certains &quot;9+2 &quot;Cils tels que les cils olfactifs sont non mobiles 3. Cellules épendymaires bordant les ventricules cérébraux et le canal central de la moelle épinière sont caractérisés par ce que les franges sont mobiles à propulser le liquide céphalo-rachidien (LCR) le long des quatre ventricules du cerveau. L&#39;objectif global de cette méthode est de faciliter l&#39;étude de la dynamique des cils mobiles et des anomalies structurelles. La santé et le développement du cerveau dépendent fortement sur la circulation efficace des CSF dans les ventricules cérébraux. Par exemple, les flux de CSF normale et l&#39;équilibre des fluides exigent battement normal et cils épendymaire fonctionnelle 5,6, qui à son tour jouer un rôle critique dans la régulation du mouvement directionnel des cellules neuronales et la migration des cellules souches 7. En tant que tel, la fonction des cils épendymaire anormale ou une structure peut conduire à l&#39;écoulement de CSF anormale, qui est associé à une hydrocéphalie, une condition médicale dans laquelle il ya une accumulation anormale de CSF dans les ventricules du bpluie. Cela peut par conséquent entraîner une augmentation de la pression intracrânienne et l&#39;élargissement progressif de la tête, convulsions, vision en tunnel, et la déficience mentale 8. Les avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu&#39;il a permis pour la première fois de signaler trois types de cellules épendymaires distinctes: I, II, et III, en fonction de leur fréquence ciliaire battant unique et angle de battre. Ces cellules épendymaires sont localisées à l&#39;intérieur de certaines régions dans les ventricules du cerveau. En outre, les effets de l&#39;âge et des agents pharmacologiques tels que l&#39;alcool et cilostazol sur la modification des types de cellules épendymaires ou leurs localisations peuvent être démontrés, ce qui était impossible avant cette classification des cellules épendymaires. Le cilostazol est un inhibiteur de la phosphodiestérase-3, une enzyme qui métabolise l&#39;AMPc en AMP et il régule également calcium intracellulaire 9. En utilisant l&#39;analyse de l&#39;imagerie de fluorescence à haute vitesse permet l&#39;imagerie et à la quantification de l&#39;intracellulaire uniquespropriétés d&#39;oscillation de calcium des cellules épendymaires. Par exemple, l&#39;alcool et cilostazol modifiées de manière significative la fréquence ciliaire épendymaire battant ainsi que les oscillations de calcium intracellulaire propriétés qui, à son tour, pourrait conduire à un changement dans le volume de remplacement liquide céphalo-rachidien par cils épendymaire 10. En résumé, cette technique a été la clé pour fournir la première preuve de trois types distincts de cellules épendymaires avec différentes propriétés d&#39;oscillation de calcium. Dans la section suivante, un aperçu détaillé étape par étape de la procédure est prévue, en accordant une attention particulière à la préparation des tissus et de la manutention.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/HIGH GLUCOSE</td>
			<td>Cellgro Mediatech Inc.</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30088-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30256-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-2395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-2&#160;</td>
			<td>TEF Labs</td>
			<td>#0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetylated a-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7451&#160;</td>
			<td>clone 6-11B1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Anti-mouse antibody</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>FI-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture plate</td>
			<td>VWR Vista Vision</td>
			<td>30-2041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip (18x18)</td>
			<td>VWR Vista Vision</td>
			<td>16004.326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica CM1860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>Nikon TE2000</td>
			<td>60X oil&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass 24x60mm</td>
			<td>VWR Vista Vision</td>
			<td>16004-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI filter cube</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of the ependymal cilia in the lateral ventricles of the mouse brain

Cellules épendymaires multiciliées bordent les ventricules dans le cerveau adulte. La fonction anormale ou de la structure des cils épendymaire est associé à divers déficits neurologiques. Le courant ex vivo l&#39;imagerie en direct de la technique de cils épendymaire mobiles permet une étude détaillée de la dynamique ciliaires suit plusieurs étapes. Ces mesures comprennent: l&#39;euthanasie des souris avec du dioxyde de carbone selon les protocoles de l&#39;Université du institutionnels de protection des animaux et l&#39;utilisation Comité (IACUC) de Tolède; craniectomy suivie de l&#39;élimination du cerveau et sagittale dissection du cerveau avec un vibratome ou lame tranchante pour obtenir sections très minces à travers les ventricules latéraux du cerveau, où les cils épendymaire peuvent être visualisées. L&#39;incubation des tranches du cerveau dans une plaque à fond de verre personnalisé contenant milieu de Eagle modifié (DMEM) / Haut-glucose de Dulbecco à 37 ° C en présence de 95% / 5% O / CO 2 mélange 2 est essentiel de garder le tissu vivant pendantl&#39;expérience. Une vidéo du battement de cils est alors enregistrée en utilisant une haute résolution contraste d&#39;interférence différentiel microscope. La vidéo est ensuite analysé image par image pour calculer la fréquence ciliaire battant. Cela permet la classification distincte des cellules épendymaires en trois catégories ou types en fonction de leur fréquence ciliaire battant et l&#39;angle. En outre, cette technique permet l&#39;utilisation de l&#39;analyse d&#39;imagerie de fluorescence à grande vitesse pour caractériser les propriétés uniques intracellulaires d&#39;oscillation de calcium de cellules épendymaires, ainsi que l&#39;effet des agents pharmacologiques sur les oscillations de calcium et la fréquence ciliaire battant. De plus, cette technique est adaptée pour l&#39;imagerie par immunofluorescence pour des études de structure de protéine ciliaire ciliaire et localisation. Ceci est particulièrement important dans les études de diagnostic et de phénotype maladie. La principale limitation de la technique est attribuée à la diminution de la circulation en direct de cils mobiles comme les tissus du cerveau commence à mourir.

Mesure de la fonction des cils épendymaire dans le cerveau de souris en direct La méthode décrite dans ce protocole est utilisé pour surveiller la fonction des cils épendymaire et de la structure dans le tissu frais disséqué à partir du cerveau de la souris ainsi que pour surveiller et étudier cils fréquence de battement. Les étapes suivies pour réaliser une expérience complète sont représentés sur un diagramme schématique (figure 1). Il est fortement recomm...

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Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Utilisation de haute résolution contraste d&#39;interférence différentiel (DIC) microscopie, un ex vivo observation du battement des cils épendymaire mobiles situés dans les ventricules du cerveau de souris est démontrée par live-imagerie. La technique permet un enregistrement de l&#39;unique fréquence ciliaire battant et l&#39;angle battant ainsi que leurs propriétés calcium intracellulaire oscillation de stimulation.

Imagerie en direct de la épendymaire Cilia dans les ventricules latéraux du cerveau de souris

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K vues.  University of Toledo, College of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences.  Utilisation de haute résolution contraste d'interférence différentiel (DIC) microscopie, un ex vivo observation du battement des cils épendymaire mobiles situés dans les ventricules du cerveau de souris est démontrée par live-imagerie. La technique permet un enregistrement de l'unique fréquence ciliaire battant et l'angle battant ainsi que leurs propriétés calcium intracellulaire oscillation de stimulation. 

Vidéo: Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

Neuromodulation et mitochondriale de transport: Live in Imaging neurones de l&#39;hippocampe sur des durées longues

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Recherche

Neurosciences

Manual Drainage of the Zebrafish Embryonic Brain Ventricles

Cerebrospinal fluid (CSF) is a protein rich fluid contained within the brain ventricles. It is present during early vertebrate embryonic development and persists throughout life. Adult CSF is thought to cushion the brain, remove waste, and carry secreted molecules1,2. In the adult and older embryo, the majority of CSF is made by the choroid plexus, a series of highly vascularized secretory regions located adjacent to the brain ventricles3-5. In zebrafish, the choroid plexus is fully formed at 144 hours post fertilization (hpf)6. Prior to this, in both zebrafish and other vertebrate embryos including mouse, a significant amount of embryonic CSF (eCSF) is present . These data and studies in chick suggest that the neuroepithelium is secretory early in development and may be the major source of eCSF prior to choroid plexus development7.
eCSF contains about three times more protein than adult CSF, suggesting that it may have an important role during development8,9. Studies in chick and mouse demonstrate that secreted factors in the eCSF, fluid pressure, or a combination of these, are important for neurogenesis, gene expression, cell proliferation, and cell survival in the neuroepithelium10-20. Proteomic analyses of human, rat, mouse, and chick eCSF have identified many proteins that may be necessary for CSF function. These include extracellular matrix components, apolipoproteins, osmotic pressure regulating proteins, and proteins involved in cell death and proliferation21-24. However, the complex functions of the eCSF are largely unknown.
We have developed a method for removing eCSF from zebrafish brain ventricles, thus allowing for identification of eCSF components and for analysis of the eCSF requirement during development. Although more eCSF can be collected from other vertebrate systems with larger embryos, eCSF can be collected from the earliest stages of zebrafish development, and under genetic or environmental conditions that lead to abnormal brain ventricle volume or morphology. Removal and collection of eCSF allows for mass spectrometric analysis, investigation of eCSF function, and reintroduction of select factors into the ventricles to assay their function. Thus the accessibility of the early zebrafish embryo allows for detailed analysis of eCSF function during development.

We present a method to collect cerebrospinal fluid (CSF) and to create a system which lacks CSF within the embryonic zebrafish brain ventricular system. This allows for further examination of CSF composition and its requirement during embryonic brain development.

Drainage Manuel des ventricules cérébraux embryonnaires de poisson-zèbre

Cerebrospinal fluid  (CSF) is a protein rich fluid contained within the brain ventricles. It is  present during early vertebrate embryonic development and ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Imagerie en direct de la mitose dans les développement Cortex souris embryonnaires

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and lifespan. In addition, telomerase protects the mitochondria from oxidative stress and confers resistance to apoptosis, suggesting its possible importance for the surviving of non-mitotic, highly active cells such as neurons. We previously demonstrated the ability of novel telomerase activators to increase telomerase activity and expression in the various mouse brain regions and to protect motor neurons cells from oxidative stress. These results strengthen the notion that telomerase is involved in the protection of neurons from various lesions. To underline the role of telomerase in the brain, we here compare the activity of telomerase in male and female mouse brain and its dependence on age. TRAP assay is a standard method for detecting telomerase activity in various tissues or cell lines. Here we demonstrate the analysis of telomerase activity in three regions of the mouse brain by non-denaturing protein extraction using CHAPS lysis buffer followed by modification of the standard TRAP assay.
In this 2-step assay, endogenous telomerase elongates a specific telomerase substrate (TS primer) by adding TTAGGG 6 bp repeats (telomerase reaction). The telomerase reaction products are amplified by PCR reaction creating a DNA ladder of 6 bp increments. The analysis of the DNA ladder is made by 4.5% high resolution agarose gel electrophoresis followed by staining with highly sensitive nucleic acid stain.
Compared to the traditional TRAP assay that utilize 32P labeled radioactive dCTP&#39;s for DNA detection and polyacrylamide gel electrophoresis for resolving the DNA ladder, this protocol offers a non-toxic time saving TRAP assay for evaluating telomerase activity in the mouse brain, demonstrating the ability to detect differences in telomerase activity in the various female and male mouse brain region.

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.

Activité de la télomérase dans les différentes régions du cerveau de souris: la télomérase non-radioactifs Répétition protocole d&#39;amplification (TRAP) Dosage

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

3D Modeling of the Lateral Ventricles and Histological Characterization of Periventricular Tissue in Humans and Mouse

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional units of the ventricles are ciliated epithelial cells termed ependymal cells, which line the ventricles and through ciliary action are capable of generating laminar flow of CSF at the ventricle surface. This monolayer of ependymal cells also provides barrier and filtration functions that promote exchange between brain interstitial fluids (ISF) and circulating CSF. Biochemical changes in the brain are thereby reflected in the composition of the CSF and destruction of the ependyma can disrupt the delicate balance of CSF and ISF exchange. In humans there is a strong correlation between lateral ventricle expansion and aging. Age-associated ventriculomegaly can occur even in the absence of dementia or obstruction of CSF flow. The exact cause and progression of ventriculomegaly is often unknown; however, enlarged ventricles can show regional and, often, extensive loss of ependymal cell coverage with ventricle surface astrogliosis and associated periventricular edema replacing the functional ependymal cell monolayer. Using MRI scans together with postmortem human brain tissue, we describe how to prepare, image and compile 3D renderings of lateral ventricle volumes, calculate lateral ventricle volumes, and characterize periventricular tissue through immunohistochemical analysis of en face lateral ventricle wall tissue preparations. Corresponding analyses of mouse brain tissue are also presented supporting the use of mouse models as a means to evaluate changes to the lateral ventricles and periventricular tissue found in human aging and disease. Together, these protocols allow investigations into the cause and effect of ventriculomegaly and highlight techniques to study ventricular system health and its important barrier and filtration functions within the brain.

Using MRI scans (human), 3D imaging software, and immunohistological analysis, we document changes to the brain&#8217;s lateral ventricles. Longitudinal 3D mapping of lateral ventricle volume changes and characterization of periventricular cellular changes that occur in the human brain due to aging or disease are then modeled in mice.

Modélisation 3D de la ventricules latéraux et histologique Caractérisation des tissus périventriculaire chez les humains et les souris

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

Imagerie fibres sérotoninergiques dans la moelle épinière de souris Utilisation du CLARITY / Technique CUBIC

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Enregistrement de la plasticité synaptique dans des tranches d’hippocampe aiguës maintenues dans un petit volume recyclage - Perfusion- et système de chambre de Submersion-type

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Imagerie des cellules du Cortex cérébral primaire à l’aide d’un système de Culture 2D en direct

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Exploring Deep Space - Uncovering the Anatomy of Periventricular Structures to Reveal the Lateral Ventricles of the Human Brain

Anatomy students are typically provided with two-dimensional (2D) sections and images when studying cerebral ventricular anatomy and students find this challenging. Because the ventricles are negative spaces located deep within the brain, the only way to understand their anatomy is by appreciating their boundaries formed by related structures. Looking at a 2D representation of these spaces, in any of the cardinal planes, will not enable visualisation of all of the structures that form the boundaries of the ventricles. Thus, using 2D sections alone requires students to compute their own mental image of the 3D ventricular spaces. The aim of this study was to develop a reproducible method for dissecting the human brain to create an educational resource to enhance student understanding of the intricate relationships between the ventricles and periventricular structures. To achieve this, we created a video resource that features a step-by-step guide using a fiber dissection method to reveal the lateral and third ventricles together with the closely related limbic system and basal ganglia structures. One of the advantages of this method is that it enables delineation of the white matter tracts that are difficult to distinguish using other dissection techniques. This video is accompanied by a written protocol that provides a systematic description of the process to aid in the reproduction of the brain dissection. This package offers a valuable anatomy teaching resource for educators and students alike. By following these instructions educators can create teaching resources and students can be guided to produce their own brain dissection as a hands-on practical activity. We recommend that this video guide be incorporated into neuroanatomy teaching to enhance student understanding of the morphology and clinical relevance of the ventricles.

This paper demonstrates the effective use of a fiber dissection method to reveal the superficial white matter tracts and periventricular structures of the human brain, in three-dimensional space, to aid student comprehension of ventricular morphology.

Explorer l’espace lointain - découvrir l’anatomie des Structures périventriculaire de révéler les ventricules latéraux du cerveau humain

Anatomy students are typically provided with two-dimensional (2D) sections and images when studying cerebral ventricular anatomy and students find this ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.