Hé, les gars, je m’appelle Wang Yangdong, et je suis du laboratoire de bio-ingénierie moléculaire Dr.Kiryl Piatkevich à l’Université Westlake. Aujourd’hui, je vais vous montrer la procédure d’imagerie des activités neuronales de l’hippocampe chez la souris, in vivo. Allumez la machine à souder et chauffez-la à la température requise.
Ajustez la position de la canule d’imagerie et de la canule d’injection à l’aide de mains secourables, comme le montre la figure. À l’aide de la seringue avec l’aiguille, appliquez une petite quantité de flux approprié sur les points de connexion entre l’imagerie et l’injection de canule pendant cinq secondes, puis retirez la gouttelette. Montez l’étain de soudure et appliquez-le sur le point de connexion traité avec le flux.
Évitez l’excès d’étain de soudure car il faudra un plus grand crânien inutile à faire pendant la chirurgie. Attendez que l’étain à souder refroidisse. Habituellement, cela prend plusieurs secondes.
Confirmer que la canule d’injection n’est pas bloquée en insérant la canule factice des deux côtés. Appliquez un adhésif optique à séchage UV sur la face inférieure de la canule d’imagerie à l’aide d’un cure-dent ou d’une aiguille de seringue de calibre 26. Utilisez une pince à épiler fine pour placer soigneusement un verre de couverture de la taille correspondante à la canule d’imagerie.
Durcir l’adhésif pendant au moins une heure par un éclairage UV à partir d’une lampe UV portable standard. Anesthésier la souris avec de l’isoflurane selon la procédure approuvée par l’IACUC. Placez la souris dans un cadre stéréotaxique sur un coussin chauffant chirurgical.
Fixez la tête avec des barres d’oreille. Poussez légèrement la tête dans toutes les directions pour vous assurer que la tête est fermement fixée. Appliquez une pommade pour les yeux pour empêcher les yeux de l’animal de se dessécher pendant la chirurgie.
Utilisez une tondeuse ou une crème dépilatoire pour enlever la fourrure de l’arrière du cou jusqu’aux yeux. Stériliser le site chirurgical avec de la bétadine suivie d’éthanol de 70% trois fois avant de faire une incision. Retirez la peau sur le dessus du crâne, en commençant par la coupe horizontale tout autour de la base de la tête, suivie de deux coupes dans le sens rostral, atteignant presque les paupières.
Puis deux coupes obliques qui convergent vers la ligne médiane. Avec deux cotons-tiges stériles, rétractez le tissu conjonctif, ainsi que la musculature de l’arrière du cou jusqu’aux bords du crâne. Appliquez une goutte de solution de lidocaïne à la surface du périoste pendant deux minutes pour éviter une douleur excessive.
Grattez doucement toute la zone exposée du crâne avec un scalpel pour créer une surface sèche et rugueuse. Placez la pointe de l’aiguille sur le Lambda pour voir si la coordonnée AP est égale à zéro pour confirmer que la position de la tête est verticale, ainsi que si la coordonnée ML est nulle, pour confirmer que la tête est positionnée horizontalement. Si ce n’est pas le cas, ajustez les boutons correspondants sur la station stéréotaxique jusqu’à ce que les coordonnées AP et ML soient toutes deux à moins de 0,1 millimètre.
Déplacez le bout de l’aiguille pour trouver les points correspondants pour la craniotomie et marquer leurs positions sur le crâne, à l’aide d’un marqueur fin. Dessinez un cercle basé sur quatre points marqués, ainsi que le contour de la zone de canule d’injection sur le côté canule du cercle. Utilisez une perceuse pneumatique à la vitesse de 10 000 coups par minute pour percer doucement le long du contour marqué sur le crâne.
Percez le crâne jusqu’à ce qu’il reste une très fine couche d’os, qui commence généralement à trembler sous un toucher doux au centre. Appliquer une goutte de PBS stérile au centre de la craniotomie. Soulevez le lambeau d’os du crâne avec une pince à pointe très fine ou deux aiguilles de calibre 26 qui s’approchent de lui par les côtés opposés.
Appliquez du PBS suivi d’aspirations douces, à travers une aiguille émoussée de calibre 26 plusieurs fois pour nettoyer la surface de la dura. Appliquez une aspiration douce pour abréger le cortex ainsi que le corps calleux au-dessus de l’hippocampe. Le cortex est souvent plus jaune que le corps calleux.
Et le Corpus Callosum est généralement plus large que l’hippocampe. En outre, le Corpus Callosum est vraiment facile à distinguer par des fibres neuronales allant dans les directions verticale et horizontale lorsqu’il est observé du haut. Le saignement à ce stade affectera la visibilité du tissu cérébral dans la craniotomie.
Appliquez du PBS, suivi d’une aspiration douce, pendant que vous aspirez le cortex pour vous débarrasser du sang, le corpus calleux peut être reconnu par la direction des fibres blanches comme indiqué schématiquement dans le diagramme. Retirez les fibres de corpus calleux couche par couche en appliquant une aspiration douce dans un mouvement circulaire. Pbs est constamment appliqué pour se débarrasser du sang qui s’accumule au-dessus du tissu cérébral exposé.
Insérez doucement l’implant dans la craniotomie. Appuyez fermement sur le dessus de l’implant avec l’aiguille en forme de L pour positionner la fenêtre optique de l’implant aussi près que possible de la surface exposée de l’hippocampe. Appliquez à plusieurs reprises du PBS sur la cicatrice autour de l’implant, suivi d’une aspiration pour enlever le sang autant que possible lors de l’insertion de l’implant.
Appliquez une fine couche d’étanchéité rapide entre l’implant et le crâne pour empêcher le ciment dentaire de pénétrer sous le crâne. Une fois que le joint rapide est durci, appliquez la super liaison uniformément sur la surface du crâne, la surface du joint rapide et la surface de l’implant. Une fois que la super liaison est guérie, appliquez la résine de base de prothèse au-dessus de la super liaison, ainsi que la peau autour de l’incision faite au début de la chirurgie.
Une fois la résine de base de prothèse dentaire durcie, placez la plaque de tête sur la résine autour de l’implant et concentrez-la avec la canule d’imagerie. Appliquez plus de résine de base de prothèse autour et au-dessus de la plaque de tête pour fixer sa position. Laissez-le guérir pendant plusieurs minutes.
Évitez de construire une épaisse couche de ciment autour de la canule pour assurer un meilleur accès à la fenêtre d’imagerie est la lentille de l’objectif. Diluer la résine de base de prothèse pour diminuer sa viscosité, lui permettant ainsi de remplir les cavités difficiles à atteindre avec un applicateur. Placez délicatement un ruban adhésif isolé au-dessus de la fenêtre pour protéger la fenêtre d’une éventuelle contamination par des bandes d’animaux.
Ajoutez la solution mère de colorant Fast Green à la solution virale, diluez-la au titre souhaité dans le rapport de un à neuf, dans un tube PCR. Retirez 600 nano litres de la solution virale, retirez la canule factice et insérez la canule interne pour la connecter à la seringue d’injection dans la canule guide. Infuser le virus à la vitesse de 15 nano litres par minute, pendant 10 minutes au total.
Gardez la canule interne connectée pendant 10 minutes pour permettre au virus de se propager sous la fenêtre. Retirez doucement la canule interne de la canule de guidage et récapitulez-la avec la canule factice. Induisez la souris avec 4% d’isoflurane pendant quelques minutes.
Fixez sa plaque de tête à la fourche de tête, puis fixez la fourche de tête sur le tapis roulant. Utilisez une lentille d’objectif à faible grossissement pour trouver la meilleure vue de filtre pour l’imagerie fonctionnelle. Ensuite, passez à une lentille objective supérieure pour enregistrer les activités neuronales à la résolution d’une seule cellule.
Pour l’imagerie du calcium, le fluorescent vert a été excité par une LED de 470 nanomètres disponible dans le commerce à l’aide d’un sens de filtre GFP standard. Pour obtenir des traces fluorescentes, les régions d’intérêt, correspondant à la masse cellulaire neuronale ont été segmentées manuellement et analysées par le logiciel ImageJ. Pour l’imagerie de tension à l’aide d’une lentille de 40 X, des enregistrements de tension optique ont été effectués dans le canal proche infrarouge à des taux d’acquisition de 830 Hertz.
L’enregistrement neuronal spontané d’activité a duré sans interruption jusqu’à 25.000 images. Ici, nous décrivons une méthode pour l’imagerie à long terme de l’hippocampe en tant que région A1 chez les souris se comportant. La méthode est basée sur l’implantation chronique.
Maintenant, la fenêtre d’imagerie sur mesure, qui permet également l’administration ciblée de virus ou de médicaments directement aux neurones d’intérêt. Nous croyons que le protocole décrit facilitera les études qui visent à étudier l’activité neuronale avec la résolution temporelle spatiale élevée dans l’hippocampe des souris se comportant utilisant des dispositifs simples et abordables d’imagerie de 1-photon.
