We thank Benjamin Knowles, Yan Wei Lim, Andreas Haas, and members of the Viral Dark Matter consortium for their help and constructive input on this manuscript. This research is funded by the National Science Foundation (DEB-1046413) and is part of the Dimensions: Shedding Light on Viral Dark Matter project.

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The authors have nothing to disclose.

Ici, nous présentons les approches Phenomic pour la caractérisation fonctionnelle des gènes de phages putatifs. Les techniques comprennent développé un dosage capable de métabolisme anabolique de l&#39;hôte de contrôle, les plaques multi-phénotype dosage (MAP), en plus de la méthode établie de la métabolomique, capable d&#39;effets de métabolisme catabolique de mesure. Nous avons fourni des outils supplémentaires pour gérer les grands ensembles de données résultant de ces technologies, qui permet un traitement à haut débit et de l&#39;analyse 24. Enfin, à travers la comparaison d&#39;une protéine annotée de capside de phage, phage thiorédoxine, deux gènes de phages métaboliques putatives, et la réponse expérimentale moyenne, nous proposons diverses stratégies pour interpréter les deux ensembles de données et classes de gènes, en mettant l&#39;accent sur l&#39;identification des tendances phénotypiques et l&#39;identification des valeurs aberrantes. Comme mentionné, les deux approches mesurer quantitativement la moitié seulement du métabolisme de l&#39;hôte. Pour interpréter la fonction relative de l&#39;un desnouvelles protéines visées par l&#39;enquête, les données des deux méthodes est nécessaire de fournir des preuves de la fonction. Bien que ce soit pas un objet de notre manuscrit actuel, sorties de données de chaque méthode Phenomic est mis à travers des analyses combinatoires qui se concentrent sur des techniques de clustering comme la forêt aléatoire et analyse en composantes principales. En outre, les hypothèses résultant de l&#39;analyse combinée doivent ensuite être validés par des méthodes génétiques traditionnelles. Enfin, les méthodes présentées sont fortement influencées par la physiologie bactérienne et donc suivre les mêmes normes. Lors de la réalisation ou l&#39;autre méthode, des considérations doivent être prises pour assurer, des groupes de clones indépendants sont expérimenté; contamination est évitée; une seule variable est testé; et les contrôles appropriés sont tournent simultanément. Le défaut de tenir compte de ces points se traduira par des résultats peu claires, semblables à tout dosage physiologique. Multi-phénotype Assay Plaques(MAP) Le développement des cartes fournit un haut débit et le dosage adaptable par rapport aux technologies actuellement disponibles (figure 5A et tables 1,2). Le test utilise des consommables, l&#39;équipement et les techniques fondamentales disponibles dans tous les laboratoires de microbiologie. L&#39;incorporation d&#39;un pipeline de calcul, PMAnalyzer 24, pour le traitement et l&#39;analyse subséquente des données assure l&#39;interprétation rapide des données. En outre, les deux aspects expérimentaux et analytiques de l&#39;approche peuvent être facilement réglés ou réglés à des fins personnalisés. Par exemple, si une grande partie des données ne parvient pas à passer le filtrage dans la section 4, on peut tamiser manuellement à travers les courbes de croissance pour identifier les problèmes. Si le problème se pose en raison de paramètres de filtrage strictes, des ajustements au script peuvent être faites. Alternativement, si les problèmes sont associés à la démarche expérimentale (c.-à condensation prolongée; le transfert abusif des cel bactériennels, etc.), puis répétitions supplémentaires peuvent être facilement répétés. Comme décrit dans Cuevas et al. 24, l&#39;PMAnalyzer est un programme bash single écrit comme un script qui exécute les scripts d&#39;analyse et d&#39;analyse comme une cohésion, d&#39;un pipeline automatisé. Tous les scripts sont librement accessibles à partir d&#39;un dépôt Git à 25 en prenant la valeur médiane pour chaque point de temps à travers les données de trois exemplaires, et paramétrise ensuite la courbe logistique pour obtenir le temps de latence, taux de croissance maximum, asymptote, et un terme roman, Niveau croissance. La valeur médiane a été choisie sur la moyenne dans notre étude pour réduire l&#39;effet de grandes valeurs aberrantes, cependant, le script peut être facilement adapté pour calculer la moyenne des données répliquées. En raison de la variation réduite (SE) vu à travers les données répliquées (figure 2A) nous avons maintenu l&#39;utilisation de la médiane dans la PMAnalyzer pour ajuster une courbe logistique. En outre, le coupé de la croissance dans cette étude (GL ≥ 0,4) était determined en comparant comment les données séparées pour Niveau de croissance et le taux de croissance maximal (figure 1A, B). Selon le modèle instruments et système utilisé ce terme peut varier, ce qui nécessite une redéfinition de ce coupé valeur. Un avantage majeur de notre analyse est la capacité de comparer les phénotypes en utilisant un seul paramètre caractérisant la croissance microbienne dans l&#39;ensemble, que nous définissons comme niveau de croissance (GL). GL est une moyenne harmonique, et par conséquent atténue les effets de grandes valeurs aberrantes dans les données. L&#39;utilisation d&#39;une moyenne harmonique avec des valeurs de logistique équipée décalés de fournir un résumé de la croissance en est arrivé à par essai et erreur. D&#39;autres procédés ont tenté de différencier croissance contient: temps nécessaire pour accéder à des paramètres spécifiques de la courbe (de moitié μ max, μ max, et la capacité de transport), le coefficient de détermination (R 2), et des combinaisons de R 2, multiplié par des paramètres spécifiques de la courbe. L&#39;utilisation d&#39;une moyenne harmonique avec décalévaleurs logistique-fit pour le GL à condition que la plus grande gamme dans l&#39;évaluation de la croissance, donc il est devenu la méthode de choix. Une considération à noter est que les modèles dynamiques de la courbe de croissance ont le potentiel d&#39;être perdu lors de l&#39;utilisation d&#39;un seul paramètre ou d&#39;un modèle ajusté. Par exemple, les paramètres de la courbe individuels de la courbe logistique et GL sont incapables d&#39;en croissance biphasique. Dans un environnement de carbone unique, cet effet sur la croissance implique la médiation de la protéine virale de chaque conversion du substrat ou de décalage de l&#39;utilisation du substrat. D&#39;autres effets potentiellement perdus lors ne pas considérer les paramètres de croissance multiples comprennent: temps de latence prolongée, proposant une charge accrue de machines ou produits virale; accélération rapide phase exponentielle, suggérant protéines virales couplés à accueillir les filières de production d&#39;énergie; ou des niveaux plus élevés de formation de la biomasse, ce qui implique support viral dans l&#39;absorption des nutriments de l&#39;hôte et l&#39;anabolisme (données non présentées). Ainsi, le traçage des courbes de croissance naissantes ( <strong&gt; Figure 2A, B) fournit des informations sur les tendances au fil du temps alors que le GL prend en compte les principales variables du modèle logistique, en fournissant un certain nombre quantitative unique pour représenter le succès global d&#39;un clone. Lorsque l&#39;on considère les différentes réponses apportées par les gènes structurels et métaboliques dans les cartes, il est observé que les différentes classes de substrat en question fournissent la plus grande preuve de la fonction des protéines. Par exemple, les protéines métaboliques sont souvent associés à l&#39;acquisition de nutriments limitants, qui sont non spécifiques à l&#39;hôte métabolisme central 16,32. Expériences de carte préliminaire révèle que les clones hébergeant des gènes de phages métaboliques putatifs ont une phase de latence accrue lorsqu&#39;il est cultivé sur des sources métabolisme de carbone centraux (figure 2A). Inversement, des clones portant des gènes putatifs structurelles, qui nécessitent de grandes proportions de l&#39;énergie de l&#39;hôte et dNTP piscines, entraînent une réponse faux positif sur la croissance pour centmétabolisme des substrats natu- carbone et d&#39;acides aminés. Cela est probablement dû à l&#39;accumulation de protéines insolubles dans filamentation résultant d&#39;accueil et / ou des corps d&#39;inclusion, comme observé par microscopie (figure 2A et données non présentées). Alors une analyse plus approfondie est nécessaire pour valider ces résultats préliminaires, les cartes sont capables de récupérer réponses phénotypiques qui se rapportent à l&#39;hypothèse fonctions de classes spécifiques de gènes de phage. En plus de l&#39;élucidation de protéines virales inconnues, les cartes sont un roman ressources pour enquêter sur la diversité fonctionnelle et métabolique d&#39;une bactérie individu ou une communauté de bactéries. les composantes du PAM sont conçus pour la modification facile de soutenir la croissance d&#39;une gamme de bactéries; y compris maritime, auxotrophe, et les microbes anaérobies. Pour faciliter ces efforts, la base et pré-croissance milieux définis exigent espèces chimiques supplémentaires ou réglés devant un genre bactérien différent peut être pris en charge dans les cartes.Une note dans cette utilisation des cartes est de maintenir des milieux définis, interdisant l&#39;utilisation d&#39;ingrédients tels que la tryptone, extrait de levure et de peptone. Métabolomique Le domaine de la métabolomique dépend de bases de données, qui comprennent des metabolites métabolites isolés identifiés par spectrométrie de masse. L&#39;installation de base choisie ici a une des plus grandes bases de données de la métabolomique. Fait intéressant, plus de la moitié des métabolites résultant de nos expérimentations étaient non identifiables (~ 65%), tandis que d&#39;autres avaient jamais été enregistrée dans notre hôte, Escherichia coli (des exemples comprennent: indole 3 acide acétique 33, l&#39;acide salicylique 34, et de l&#39;acide dihydroabiétique 35). Ce fait peut être attribué soit à une forte polarisation de la base de données vers métabolites végétaux, ou les protéines spécifiques visés par l&#39;enquête. Peu importe, le résultat est un nombre limité de métabolites connus disponibles pour la représentation et l&#39;analyse des données. Dans le future, de multiples méthodes de métabolomique utilisant diverses bases de données permettrait une plus grande couverture de métabolite. Actuellement, à la fois connus et inconnus métabolites sont utilisés lorsque l&#39;on compare et contraste nos nouvelles protéines virales. En utilisant cette approche, nous faisons l&#39;hypothèse que les clones hébergeant protéines fonctionnellement similaires se partageront une similitude augmenté dans leur profil métabolomique complète. Analyse de la métabolomique préliminaire a révélé que, bien que des gènes de structure et ne se séparent pas métaboliques clairement les uns des autres, les gènes présentant des effets similaires sur l&#39;hôte lorsque surexprimé ne corréler (Figure 6). Par exemple, les groupes de gènes de capside annotés en étroite collaboration avec les gènes métaboliques putatives mis en évidence dans cette étude, EDT2440 et EDT2441. Investigations en utilisant un programme de prédiction transmembranaire de la topologie et la disposition du public peptide signal ont montré des preuves que les deux gènes putatifs métaboliques abritent un seul domaine transmembranaire. Il est intéressant de 5 èmee 9 clones dans le premier groupe de cluster (plus partie du dendrogramme de gauche) ont prédit domaines transmembranaires utilisant le même programme de topologie. D&#39;autres études sont nécessaires, toutefois, il est probable que les métabolites présents au cours de la surexpression de ces clones sont associés à la réponse au stress cellulaire résultant de membrane ou les charges structurelles. Ces données confirment que, bien que les données de métabolomique possède une quantité accrue de bruit, la méthode est capable de mettre en évidence des signaux qui différencient effets généraux de gènes, tant au sein d&#39;une classe de gènes. Pour déterminer si le procédé est capable d&#39;extraire des informations spécifiques de la fonction des gènes, les métabolites ont été regroupés dans des voies métaboliques spécifiques. L&#39;hypothèse étant, si un clone affecte métabolites spécifiques à une seule voie, alors le gène surexprimé est actif dans cette voie. Avant la création de notre pipeline d&#39;assurance de la qualité de la métabolomique, les données préliminaires ont révélé que sur uned métabolites étaient généralement sous-représentés &quot;inconnu&quot;, fournissant peu d&#39;information sur les voies auxquelles ils sont associés (données non présentées). Données de métabolomique prétraités, cependant, révèle que la majorité des profils de métabolites sont similaires et seul un nombre restreint d&#39;abondances de métabolites connus et inconnus varient selon les clones, par exemple putrescine et l&#39;uracile (figure 6). Pour assurer une plus grande résolution de protéines efforts de fonction sont en cours pour comparer expérimentalement les nouveaux gènes de phages contre les gènes de phages connus, qui peuvent être utilisés pour combler les «trous» de métabolite base caractérisation fonctionnelle. En utilisant cette technique, la fonction assignée de gènes viraux connus fournit une référence pour la fonction de gènes inconnus. Néanmoins, le facteur limitant de l&#39;analyse métabolomique est la taille et la pertinence de la base de données. Pour pallier à ces limites, les bases de données métabolomique relatable à cette recherche doivent être élaborés; telcomme une base de données de métabolites et de leurs abondances spécifiques à la collecte de ASKA E. coli clones dans lesquels un seul ORF 36 est surexprimé. Preuve de la nécessité de ces bases de données a été fournie en 2013, lorsque des chercheurs de l&#39;Lawerence Berkeley National Laboratory compilées la première base de données complète des métabolites spécifiques pour bibliothèques entières mutantes de bactéries modèles 37. Cette recherche a fourni un nouvel aperçu gènes nécessaires à l&#39;utilisation des métabolites spécifiques, révélant le lien évident entre génotype et phénotype. Lorsque l&#39;on considère la métabolomique comme un outil, il est important de définir le régime de traitement suivi à l&#39;installation de base. Un artefact de la plupart des procédures expérimentales est la variance au jour le jour, associée à des instruments d&#39;utilisation. A ce jour toutes les analyses GC-MS implémente l&#39;utilisation de normes internes qui sont inclus dans chaque série d&#39;analyses; Cependant, plus d&#39;échantillons internes spécifiques du projet &lt;/ Em&gt; a couru chaque jour de l&#39;expérimentation supprime variance additionnelle. Ces considérations doivent être abordées tôt pour éviter les problèmes de normalisation et les préjugés. Une autre solution consiste à traiter tous les échantillons dans une installation de base sur la même machine et en un seul lot, une option disponible à toute installation de base. Les différents outils à la fois introduites et ré-exploré dans ce manuscrit fournir de nouveaux moyens pour dépister et caractériser les gènes de phages fonctionnellement inconnus. La simplicité et l&#39;adaptabilité des techniques expérimentales avec l&#39;utilisation de rationaliser des pipelines de calcul assure ces méthodes sont applicables à un large éventail d&#39;activités et des champs de recherche. Notre objectif est que les approches Phenomic présentés ici aideront d&#39;autres enquêtes de nouvelles protéines de phage en plus des systèmes qui sont tout aussi fonctionnellement définie.

Les virus qui infectent les bactéries (aka bactériophage ou phage) sont estimés à exister à plus de 10 31 pseudo particules virales (VLP) à l&#39;échelle mondiale et plus nombreux que tous les autres organismes dans un environnement 1,2. La première étude métagénomique enquêter sur les communautés virales associées aux environnements marins concentre sur la quantification de la diversité au sein de la fraction vu virale 3. En outre, Breitbart et ses collègues ont constaté que plus de 65% des séquences virales communautaires partagé aucune homologie avec des séquences disponibles dans les bases de données publiques. Des études ultérieures ont trouvé des preuves de métagénomique similaire: métagénomes de sédiments marins à San Diego, en Californie contiennent 75% de séquences virales inconnues 4; métagénomes des lacs hypersalines de la Salton Sea contiennent 98% de séquences virales inconnues 5; et métagénomes coralliens associée contiennent 95 à 98% de séquences virales inconnues 6. Cette accumulation d&#39;informations non annoté a donné lieu àphage matériel génétique étant «la matière noire de l&#39;univers biologique&quot; 7. Caractérisation génomique du phage repose sur l&#39;identification de la similarité de séquence par comparaison des bases de données existantes nucléiques de protéines et acides. Parce que l&#39;information génétique codée phage est essentiellement inconnue, les méthodes reposant sur l&#39;homologie sont inefficaces. Au sein de leur génome, phages codent généralement trois types principaux de gènes: les gènes de transcription et de réplication, les gènes métaboliques, et des gènes de structure. La transcription et la réplication des gènes (classe I / II gènes 8) comprennent polymérases, primases, endo / exo-nucléases, et kinases. Ces gènes sont hautement conservées en raison de leur importance dans l&#39;infection par le phage, la transcription et la replication du matériel génétique du phage. polymérases de phages sont facilement identifiés en utilisant des méthodes d&#39;homologie de séquence traditionnels en raison de leur conservation mondiale et 9 ont été montré pour servir de marqueurs phylogénétiques efficaces 10.En revanche, phage métabolique et gènes de structure (classe de gènes II / III 8) sont de plus en plus divergentes et souvent annoté gènes hypothétiques. gènes métaboliques de phages affectent la capacité métabolique de l&#39;hôte et ne sont pas nécessairement requises pour la réplication virale. Ces gènes, souvent appelés gènes métaboliques comme auxiliaires 11 (AMG), semblent moduler le métabolisme de l&#39;hôte et de permettre la progression optimale de l&#39;infection et le succès de la maturation des virions. AMG ont été associés à l&#39;utilisation et l&#39;absorption des nutriments limitant ou dans les voies de production d&#39;énergie. Quelques exemples incluent les gènes de photosystèmes trouvés dans les génomes de différents cyanophage 12-16, gènes reliés à et réglementés par le métabolisme du phosphate 17,18, et l&#39;utilisation de la voie des pentoses phosphates pour le phage dNTP biosynthèse 18,19. En comparaison, les gènes de structure sont parmi les milieu à la fin des gènes produites au cours de l&#39;infection et varient selon les différents phage-hosystèmes st. La production de protéines structurelles sont tributaires de la disponibilité de dNTP virale, et les piscines de l&#39;énergie pour leur transcription, la traduction et l&#39;assemblage 8. Les protéines de la capside et la queue fibres structurelles sont considérées comme étant les plus divergents de l&#39;ensemble des gènes codant pour des protéines virales et sont nécessaires pour le succès de la production de virion. Leur divergence est généralement attribué au rôle actif qu&#39;ils jouent dans la coévolution virus-hôte 20. Protéines divergentes, indépendamment de la classe de gènes, sont facilement négligés lors de l&#39;utilisation des techniques d&#39;homologie de séquence et d&#39;alignement traditionnelles. Un effort pour corriger les limites observés avec des comparaisons de séquences strictes a abouti à outils bioinformatiques capables d&#39;utiliser les caractéristiques de séquence pour déterminer association, tels que les réseaux de neurones artificiels 21. Les réseaux de neurones artificiels (RNA) de permettre la prédiction de gènes structurels et métaboliques, cependant, nécessite une validation expérimentale aval à caractériser directementla fonction des gènes. L&#39;objectif de ce manuscrit est de fournir les protocoles de Phenomic capables de contrôler à la fois le métabolisme catabolique et anabolique d&#39;une bactérie hôte lors de l&#39;expression d&#39;un gène de phage roman, prédit fonctionnellement par RNA. Le domaine de la phénomique, la biologie associée à des phénotypes cellulaires, est bien établi dans la biologie des systèmes pour aider à l&#39;enquête de protéines de fonction inconnue ou pléiotropique. Phenomic outils sont utilisés pour relier l&#39;information phénotypique à l&#39;information génotypique. Nous émettons l&#39;hypothèse de gènes de phages putatifs que leur fonction (s) peut être déterminé par observation accueil effets physiologiques au cours de l&#39;expression du gène de phage. Pour vérifier cette hypothèse, deux méthodes quantitatives ont été choisis. Multi-phénotype Assay Plates (MAP) ont été utilisés pour surveiller l&#39;utilisation de l&#39;hôte substrat et la formation subséquente de la biomasse pendant la métabolomique mesurées diversité des métabolites de l&#39;hôte et l&#39;abondance relative pendant la croissance dans des environnements spécifiquesconditions mentales. Les protéines structurales et métaboliques putatifs ont été surexprimés dans Escherichia coli et des résultats représentatifs de deux expériences sont comparés. De nombreuses techniques visuelles et haut débit pipelines de traitement sont présentés pour faciliter la reproduction expérimentale. Enfin, la reproductibilité et la précision des méthodes présentées sont examinées dans le contexte des effets physiologiques prévus pour une protéine de capside et annoté phage protéine métabolique, la thiorédoxine, ainsi que deux AMG putatifs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m Sterivex Filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SVGP01050</td>
			<td>Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m Millex Filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m SteriCap Filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SCGPS02RE</td>
			<td>Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Omnipore membrane filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>JHWP02500</td>
			<td>Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well micro-titer plates&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-764</td>
			<td>Standard F-Bottom 96 well Microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL 96 well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Seal Plate Film</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z369667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Nalgene square bottles</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>T-06040-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 mL Nalgene square bottles</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>T-06040-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4inch Panel Mount Lock Nut, black nylon&#160;</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45509-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Luer Thread Style Panel Mount to 200 Series Barb&#160; 1/16inch&#160;</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45500-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Luer Thread Style Panel Mount to 200 Series Barb, 1/8inch</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45500-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer Integral Lock Ring to 500 Series Barb, 1/16inch ID tubing</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45505-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>T-45508-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barbed Bulkhead Fittings 1/4inch OD&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6149-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanipure Tubing 1/16inch ID x 1/8inch OD&#160;</td>
			<td>SaniPure</td>
			<td>AR400002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanipure Tubing 1/4inch OD x 1/8inch ID&#160;</td>
			<td>SaniPure</td>
			<td>AR400007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable Flow Mini Pump (Peristaltic pump)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-876-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer</td>
			<td>Velp Scientifica</td>
			<td>F203A0160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-512-141</td>
			<td>&#160;Millipore* Filter Forceps&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-plate spectrophotometer plate reader</td>
			<td>Molecular Devices Analyst GT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter manifold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;XX10 025 02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python version 2.7.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.python.org/">http://www.python.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyLab module</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://wiki.scipy.org/PyLab">http://wiki.scipy.org/PyLab</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 3.0.1&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reshape2 library</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://had.co.nz/reshape">http://had.co.nz/reshape</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ggplot2 library</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://ggplot2.org/">http://ggplot2.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Composer</td>
			<td>PSI Tech Portal</td>
			<td></td>
			<td>http://www.genecomposer.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Services:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>West Coast Metabolomics Center</td>
			<td>UC Davis</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://metabolomics.ucdavis.edu/">http://metabolomics.ucdavis.edu</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA 2.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.dna20.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phage phenomics: physiological approaches to characterize novel viral proteins

Les enquêtes actuelles sur les interactions hôte-phage sont tributaires de l&#39;extrapolation de la connaissance (méta) génomes. Fait intéressant, 60 - 95% de toutes les séquences de phage part aucune homologie avec des protéines annotées actuelles. En conséquence, une grande partie des gènes de phage annotés comme hypothétique. Cette réalité affecte lourdement l&#39;annotation des deux gènes métaboliques structurelles et auxiliaires. Ici, nous présentons les méthodes Phenomic conçus pour capturer la réponse (s) physiologique d&#39;un hôte sélectionné pendant l&#39;expression de l&#39;un de ces gènes de phages inconnus. Multi-phénotype Assay Plates (MAP) sont utilisés pour surveiller l&#39;utilisation de la diversité de substrat d&#39;accueil et la formation subséquente de la biomasse, alors que la métabolomique fournit une analyse bi-produit en surveillant l&#39;abondance et la diversité des métabolites. Ces deux outils sont utilisés simultanément pour fournir un profil phénotypique associée à l&#39;expression d&#39;un cadre de lecture ouvert de phage putative unique (ORF). Les résultats représentatifs pour les deux méthodes sont comparées, highlighting profil différences phénotypiques d&#39;un hôte portant soit des gènes de structure ou métaboliques putatives phages. En outre, les techniques de visualisation et haut débit pipelines de calcul qui ont facilité l&#39;analyse expérimentale sont présentés.

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Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Phenomics de phages: approches physiologiques à caractériser de nouvelles protéines virales

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

phage-phenomics-physiological-approaches-to-characterize-novel-viral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.0K vues.  San Diego State University. Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

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Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

En utilisant un dosage Microarray pan-virale (Virochip) pour cribler des échantillons cliniques pour les pathogènes viraux

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Recherche

Immunologie et infection

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

Utilisation de l&#39;interféron γ-enzymatique de dosage immunoenzymatique pour caractériser les nouveaux épitopes de lymphocytes T de virus du papillome humain

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

L&#39;établissement d&#39;une culture liquide recouvert de Airway humaines épithéliales polarisées cellules Calu-3 pour étudier la réponse cellulaire aux agents pathogènes respiratoires hôte<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its intractability to experimental transformation with recombinant DNA. We developed an approach to perform genetic analysis in C. trachomatis&#160;despite the lack of molecular genetic tools. Our method involves: i.) chemical mutagenesis to rapidly generate comprehensive libraries of genetically-defined mutants with distinct phenotypes; ii.) whole-genome sequencing (WGS) to map the underlying genetic lesions and to find associations between mutated gene(s) and a common phenotype; iii.) generation of recombinant strains through co-infection of mammalian cells with mutant and wild type bacteria. Accordingly, we were able to establish causal relationships between genotypes and phenotypes. The coupling of chemically-induced gene variation and WGS to establish correlative genotype&#8211;phenotype associations should be broadly applicable to the large list of medically and environmentally important microorganisms currently intractable to genetic analysis.

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

We describe a methodology to perform genetic analysis in Chlamydia based on chemical mutagenesis and whole genome sequencing. In addition, a system for DNA exchange within infected cells is described that can be used for genetic mapping. This method may be broadly applicable to microbial systems lacking transformation systems and molecular genetic tools.

Approches avant génétiques dans<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Détermination de la concentration virale par Plaque Essais: Systèmes calque à l&#39;aide traditionnels et nouveaux

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

Matériaux biomimétiques à caractériser les interactions bactéries-hôtes

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Le développement de lyophilisé boucle médiées isothermes Amplification Réactifs pour la détection des<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Mesure de la grippe neuraminidase Inhibition Titres d&#39;anticorps par-enzymatique lectine Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

Dépistage des essais pour caractériser les nouveaux régulateurs endothéliales impliqués dans la réponse inflammatoire

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.