Les auteurs tiennent à remercier le Dr John Harbell pour son soutien et le temps scientifique dédiée au projet IET. Les auteurs tiennent également à remercier Beiersdorf AG (Allemagne), IIVS (USA), Mary Kay Inc. (USA), Avon Products Inc. (USA), Procter &amp; Gamble / Cosmital (Suisse), Laboratoire Pierre Fabre (France), Harlan Laboratories (Royaume-Uni), et LVMH Parfums (France) pour la participation au Multi-centre international de pré-validation et de validation des études du test d&#39;irritation des yeux 15.

<ol>
	<li>National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Request+for+Ocular+Irritancy+Test+Data+From+Human,+Rabbit,+and+In+Vitro+Studies+Using+Standardized+Testing+Methods.">Request for Ocular Irritancy Test Data From Human, Rabbit, and In Vitro Studies Using Standardized Testing Methods.</a> Federal Register. 72 (109), 31582-31583 (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+(EC)+No+1907/2006+of+the+European+Parliament+and+of+the+Council+of+18+December+2006+concerning+the+Registration,+Evaluation,+Authorisation+and+Restriction+of+Chemicals+(REACH),+establishing+a+European+Chemicals+Agency,+amending+Directive+1999/45/EC+and+repealing+Council+Regulation+(EEC)+No+793/93+and+Commission+Regulation+(EC)+No+1488/94+as+well+as+Council+Directive+76/769/EEC+and+Commission+Directives+91/155/EEC,+93/67/EEC,+93/105/EC+and+2000/21/EC.">Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), establishing a European Chemicals Agency, amending Directive 1999/45/EC and repealing Council Regulation (EEC) No 793/93 and Commission Regulation (EC) No 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC.</a> OJ. L396 (49), 1-849 (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). , (2013).</li><li>Draize, J. H., Woodard, G., Calvery, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+Study+of+Irritation+and+Toxicity+of+Substances+Applied+Topically+to+the+Skin+and+Mucous+Membranes.">Methods for the Study of Irritation and Toxicity of Substances Applied Topically to the Skin and Mucous Membranes.</a> J Pharmacol Exp Ther November. 82, 377-390 (1944).</li><li>Adriaens, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+analysis+of+the+Draize+test+for+serious+eye+damage/eye+irritation:+importance+of+understanding+the+in+vivo+endpoints+under+UN+GHS/EU+CLP+for+the+development+and+evaluation+of+in+vitro+test+methods.">Retrospective analysis of the Draize test for serious eye damage/eye irritation: importance of understanding the in vivo endpoints under UN GHS/EU CLP for the development and evaluation of in vitro test methods.</a> Arch tox. 88, 701-723 (2014).</li><li>Balls, M., Botham, P. A., Bruner, L. H., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EC/HO+international+validation+study+on+alternatives+to+the+Draize+eye+irritation+test.">The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test.</a> Toxicol in Vitro. 9, 871-929 (1995).</li><li>Curren, R. D., Harbell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+safety:+a+silent+(in+vitro)+success+story.">Ocular safety: a silent (in vitro) success story.</a> Altern Lab Anim. 30, 69-74 (2002).</li><li>Wilhelmus, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Draize+Eye+Test.">The Draize Eye Test.</a> Survey of Ophthalmology. 45, 493-515 (2001).</li><li>Curren, R. D., Harbell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+alternatives+for+ocular+irritation.">In vitro alternatives for ocular irritation.</a> Environ health persp. 106, 485-492 (1998).</li><li>McCain, N. E., Binetti, R. R., Gettings, S. D., Jones, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+ocular+irritation+ranges+of+market-leading+cosmetic+and+personal-care+products+using+an+in+vitro+tissue+equivalent.">Assessment of ocular irritation ranges of market-leading cosmetic and personal-care products using an in vitro tissue equivalent.</a> Toxicologist. 66, 243 (2002).</li><li>Niranjan, P., Dang, A. H., January, B. G., Gomez, C., Harbell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+EpiOcular+assay+for+preclinical+qualification+of+formulas+for+human+clinical+studies.">Use of the EpiOcular assay for preclinical qualification of formulas for human clinical studies.</a> Toxicologist. 96, 249 (2007).</li><li>Yin, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+ocular+irritation+potential+of+surfactants-based+formulations+at+different+concentrations+using+the+EpiOcular+model.">Prediction of ocular irritation potential of surfactants-based formulations at different concentrations using the EpiOcular model.</a> Toxicologist. 108, 378 (2009).</li><li>Harbell, J., Curren, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+methods+for+the+prediction+of+ocular+and+dermal+toxicity.">In vitro methods for the prediction of ocular and dermal toxicity.</a> Handbook of Toxicology. , (2001).</li><li>Kaluzhny, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+EpiOcular(TM)+eye+irritation+test+for+hazard+identification+and+labelling+of+eye+irritating+chemicals+in+response+to+the+requirements+of+the+EU+cosmetics+directive+and+REACH+legislation.">Development of the EpiOcular(TM) eye irritation test for hazard identification and labelling of eye irritating chemicals in response to the requirements of the EU cosmetics directive and REACH legislation.</a> Altern Lab Anim. 39, 339-364 (2011).</li><li>Pfannenbecker, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cosmetics+Europe+Multi-Laboratory+Pre-Validation+of+the+EpiOcular+Reconstituted+Human+Tissue+Test+Method+for+the+Prediction+of+Eye+Irritation.">Cosmetics Europe Multi-Laboratory Pre-Validation of the EpiOcular Reconstituted Human Tissue Test Method for the Prediction of Eye Irritation.</a> Toxicol in vitro. , (2013).</li><li>MatTek Corporation. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EpiOcular™ Eye Irritation Test (OCL-200-EIT) for the prediction of acute ocular irritation of chemicals for use with Reconstructed Human EpiOcular Model (OCL-200-EIT). Protocol#MK-24-007-0055. , (2014).</li><li>Kaluzhny, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpiOcular+Eye+Irritation+Test+(EIT)+for+Hazard+Identification+and+Labeling+of+Eye+Irritating+Chemicals:+Protocol+Optimization+for+Solid+Materials+and+Extended+Shipment+Times.">EpiOcular Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification and Labeling of Eye Irritating Chemicals: Protocol Optimization for Solid Materials and Extended Shipment Times.</a> Altern Lab Anim. 43 (2), 101-127 (2015).</li><li>Kolle, S. N., Kandarova, H., Wareing, B., van Ravenzwaay, B., Landsiedel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-house+validation+of+the+EpiOcular(TM)+eye+irritation+test+and+its+combination+with+the+bovine+corneal+opacity+and+permeability+test+for+the+assessment+of+ocular+irritation.">In-house validation of the EpiOcular(TM) eye irritation test and its combination with the bovine corneal opacity and permeability test for the assessment of ocular irritation.</a> Altern Lab Anim. 39, 365-387 (2011).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstructed+Human+Cornea-like+Epithelium+(RhCE)+Test+Method+for+Identifying+Chemicals+Not+Requiring+Classification+and+Labelling+for+Eye+Irritation+or+Serious+Eye+Damage.+Draft+proposal+for+a+new+test+guideline..">Reconstructed Human Cornea-like Epithelium (RhCE) Test Method for Identifying Chemicals Not Requiring Classification and Labelling for Eye Irritation or Serious Eye Damage. Draft proposal for a new test guideline..</a> OECD Guideline for the Testing of Chemicals. , (2014).</li><li>Blazka, M. E., Harbell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+ocular+irritation+potential+of+54+test+articles+using+the+EpiOcular+Human+tissue+Construct+Model.">Evaluating the ocular irritation potential of 54 test articles using the EpiOcular Human tissue Construct Model.</a> Toxicol. In Vitro. , (2003).</li><li>Kandarova, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EpiDerm+Test+Protocol+for+the+Upcoming+ECVAM+Validation+Study+on+In+Vitro+Skin+Irritation+Tests+&#8212;+An+Assessment+of+the+Performance+of+the+Optimised+Test.">The EpiDerm Test Protocol for the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests &#8212; An Assessment of the Performance of the Optimised Test.</a> Altern Lab Anim. 33, 351-367 (2005).</li></ol>

Frais de publication de cet article ont été payés par MatTek Corporation.

Nous avons présenté le test d&#39;irritation des yeux (Figure 1) qui a été développé pour le modèle de tissu EpiOcular. L&#39;IET est capable de séparer irritants oculaires et corrosifs (SGH Catégories 1 et 2 combinés) à partir de matériaux qui ne nécessitent pas d&#39;étiquetage (SGH Sans catégorie) avec un haut degré de sensibilité et de spécificité 17. L&#39;IET tel que présenté ici ne fait aucune discrimination entre SGH Catégorie 1 de la catégorie 2 produits chimiques. L&#39;IET a été validé pour la classification et l&#39;étiquetage du potentiel d&#39;irritation oculaire d&#39;un large éventail de produits chimiques, y compris les ingrédients cosmétiques et pharmaceutiques. En conjonction avec d&#39;autres tests in vitro, l&#39;IET servira de remplacement pour le test d&#39;irritation in vivo sur œil de lapin. L&#39;IET utilise deux protocoles similaires, mais distinctes pour les matières liquides et solides, qui varient dans la durée d&#39;exposition et de périodes d&#39;incubation post-exposition (Figure 1). Le critère d&#39;évaluation utilisé dans l&#39;IETest la viabilité des tissus, déterminée par le test MTT, qui a été précédemment utilisé dans les modèles validés épithéliales humaines de tissu 20,21. Pour effectuer ce test, aucun équipement spécial en sus des équipements de culture cellulaire standard est nécessaire. En raison du niveau élevé de reproductibilité tissu à tissu, n = 2 au lieu de tissus généralement recommandé n = 3 sont utilisés. La possibilité d&#39;utiliser n = 2 tissus est un aspect essentiel du protocole, car il permet à un opérateur expérimenté pour traiter simultanément deux tissus, minimisant ainsi la variabilité de l&#39;essai qui peuvent survenir en raison de la différence de traitement des tissus individuels 14. Aussi, en utilisant n = 2 tissus par l&#39;article de test, le caractère irritant de 10 substances d&#39;essai du même état physique (liquide ou solide), avec les contrôles positifs et négatifs, peut être évaluée en utilisant un kit (24 tissus). Autres points clés qui assurent classement fiable des matériaux sont des spécifications pour le contrôle positif substance (de la viabilité des tissus ≤50.0%), la reproductibilité entre les tissus en double (différence &lt;20,0%), et des lectures de DO de contrôle négatif (&gt; 0,8 et &lt;2,5). Lorsque vous effectuez le test IET, il est important de respecter le protocole validé et le dosage suggéré et les horaires de rinçage (tableaux 3 et 4), depuis déviation du protocole ou des changements dans les périodes d&#39;incubation peut entraîner des résultats altérée. De même, les écarts de temps de 3 heures pour les MTT incubation se traduira par des lectures différentes de MTT et peuvent affecter résultat dosage. Occasionnellement, un produit chimique d&#39;essai peut avoir des propriétés optiques ou autres qui peuvent interférer avec le tissu de MTT test de viabilité ou la réduction de la cause de MTT. Par exemple, un produit chimique de test peut directement réduire MTT en produit de réaction bleu-violet, ou peut être une substance colorée qui absorbe la lumière dans la même gamme que MTT formazan (~ 570 nm). Cependant, ces produits chimiques d&#39;essai seront prESENT un problème que, si, au moment du test MTT, une quantité suffisante du matériau est encore présent sur (ou absorbé par) le tissu. Pour éviter cette interférence, les procédures de rinçage vastes sont incorporés dans le protocole de l&#39;IET. Si rinçage ne supprime pas le TA et le TA interfère avec réduction du MTT, des contrôles supplémentaires doivent être utilisés pour détecter et corriger pour elle. En bref, si la réduction de MTT directe de la substance d&#39;essai est suspectée, 50 pi (ou 50 mg pour les solides) du produit chimique en question est incubé pendant 3 heures avec la solution de travail MTT au CSC (NC, 50 pi d&#39;eau déminéralisée stérile, devrait être exécuter simultanément). Si la solution de MTT tourne bleu-violet, l&#39;article de test est présumé avoir réduit le MTT. Dans ce cas, un contrôle fonctionnel en utilisant des commandes de tissus lyophilisés tué doit être effectuée afin d&#39;évaluer si le matériel de test est obligatoire pour le tissu et menant à un faux signal de réduction du MTT. Si il ya réduction du MTT appréciable dans le, contrôle de tissu tué TA-exposée(par rapport à la quantité dans le tissu viable non traité), la viabilité des tissus moyen de l&#39;article d&#39;essai doit être corrigée en soustrayant la moyenne de la viabilité contrôle tué. L&#39;IET se trompe sur le côté de la sécurité, comme en témoigne la faible incidence des classifications faux négatifs 14,15,18. Surtout, aucun des produits chimiques SGH Catégorie 1, qui sont corrosives pour l&#39;œil et qui représentent le plus grave risque oculaire, ont été classés comme non-irritant dans cet essai 14,15,18,19. Enfin, l&#39;un des principaux avantages de la certification RHCE de méthode d&#39;essai in vitro est la possibilité de tester liquide pur et matériaux solides (ce qui est impossible avec des cultures de cellules submergées deux dimensions). L&#39;IET contribuera de manière significative dans la détermination du potentiel d&#39;irritation oculaire d&#39;un large éventail de matériaux en fonction de la classification et de l&#39;étiquetage SGH des Nations unies. Le remplacement des animaux pour déterminer oToxicité culier a été un objectif de la recherche toxicologique, depuis de nombreuses années. La méthode d&#39;essai IET a complété une étude de validation formelle soutenue par EURL ECVAM en 2014 et a été mis en œuvre EpiOcular IET dans les Lignes directrices de l&#39;OCDE que d&#39;essai OCDE TG 492 en 2015.

Les produits de consommation tels que les cosmétiques, les détergents et produits de nettoyage domestiques comprennent une variété de produits chimiques qui peuvent provoquer des lésions graves si elles en contact avec les yeux. Par conséquent, les tests de ces agents pour irritation des yeux est requis par les organismes de réglementation des États-Unis et de l&#39;UE pour assurer la sécurité des consommateurs 1. Une évaluation du potentiel d&#39;irritation oculaire de mélanges et formulations est aussi une exigence de se conformer à REACH (enregistrement, évaluation, autorisation et restriction des produits chimiques) de la législation sur l&#39;étiquetage des ingrédients cosmétiques en vertu de la directive européenne sur les cosmétiques pour le transport de produits chimiques, et pour l&#39;étiquetage des pesticides et des produits ménagers 2. Actuellement, les organismes de réglementation exigent une évaluation de risque oculaire à l&#39;aide du Système général harmonisé de classification et d&#39;étiquetage des produits chimiques (SGH) 3. SGH est principalement basée sur le test d&#39;irritation oculaire de Draize, test d&#39;irritation des yeux le plus largement utilisé dans lequel les substances étrangères et mixtures sont introduits directement dans le sac conjonctival de l&#39;oeil de lapin 4. Selon la classification SGH, SGH Catégorie 1 (corrosives pour l&#39;œil) se réfère à tester les produits chimiques qui causent la blessure initiale sévère pour les tissus oculaires ou de graves dommages à l&#39;œil et de la vision qui est pas totalement réversibles dans les 21 jours suivant l&#39;exposition 3,5. SGH Catégorie 2 se réfère à tester les produits chimiques qui produisent des changements importants dans l&#39;œil qui sont totalement réversibles dans les 21 jours d&#39;exposition. Produits chimiques de test qui ne sont pas corrosifs ou irritants sont appelés SGH Non Catégorie. Depuis plus de 40 ans, le test de Draize lapin a été critiqué pour son manque de reproductibilité, surestimation des réactions humaines, et l&#39;utilisation d&#39;animaux vivants 5-8. Ces préoccupations ont encouragé de nombreuses propositions pour le raffinement, la réduction et le remplacement de l&#39;essai in vivo 9. La nécessité d&#39;alternatives validées non animales a été renforcéepar l&#39;adoption de la septième amendement à la directive sur les cosmétiques, qui interdit l&#39;utilisation d&#39;animaux dans l&#39;évaluation de la sécurité des produits cosmétiques (en 2005) et des ingrédients (en 2009) 2. Depuis 1996, le modèle de tissu de la cornée comme reconstruite a été largement utilisé par l&#39;industrie cosmétique pour évaluer le potentiel d&#39;irritation des matières premières, des formulations à base de tensioactifs, et les mélanges qui sont conçus pour une utilisation dans aggravée, ou dans le voisinage de l&#39;oeil 10-13. L&#39;utilisation du modèle de tissu RHCE permet une application topique directe du matériau d&#39;essai sur la surface du tissu dans sa forme non diluée natif. De cette manière, des formulations solubles dans l&#39;eau non peuvent être testées sans les diluer avec des solvants. En réponse à des EURL ECVAM (Union européenne Laboratoire de référence Centre européen pour le validation des méthodes alternatives) demande d&#39;une méthode largement applicable, simple, économique et du test d&#39;irritation des yeux (IET), qui utilise un single temps d&#39;exposition et est en mesure de séparer les irritants et corrosifs oculaires à partir de matériaux qui ne nécessitent pas d&#39;étiquetage a été développé (figure 1) 14. Basé sur les résultats de 83 produits chimiques (44 liquides et 39 solides), l&#39;IET atteint 95,5 / 68,2 / 81,8% de sensibilité / spécificité et la précision (SS &amp; A) pour les liquides, 100,0 / 68,4 / 84,6% de SS &amp; A pour les matières solides, et 97,6 / 68,3 / 83,1% et pour l&#39;ensemble SS &amp; A. En 2007, une étude de pré-validation multi-laboratoire parrainé par Cosmetics Europe (anciennement Colipa) sous les auspices de l&#39;ECVAM EURL évalué la pertinence et la fiabilité de l&#39;IET dans le but de l&#39;amener à une validation formelle 15. Dans cette étude, 298 essais indépendants ont été effectués dans sept des laboratoires indépendants. Résultats de l&#39;étude ont démontré un accord de 99,7% dans la prédiction avec de faibles coefficients de variation dans tous les laboratoires participants 15. En conséquence, en 2010, le protocole est entré dans une IET formelle EURL ECVAMprogramme de validation. L&#39;étude de validation utilisé 104 produits chimiques d&#39;essai codés, y compris les substances individuelles et les mélanges de produits chimiques, pour lesquels des données de référence in vivo (Draize de données d&#39;irritation oculaire) étaient disponibles. Basé sur le succès de ce travail, un projet d&#39;orientation test OCDE a été présenté en 2014. Il est prévu que l&#39;IET contribuera de manière significative à la classification du potentiel d&#39;irritation oculaire d&#39;un large éventail de matériaux en fonction de la classification et de l&#39;étiquetage SGH des Nations unies.

eye irritation test (eit) for hazard identification of eye irritating chemicals using reconstructed human cornea-like epithelial (rhce) tissue model

Pour se conformer à la septième amendement à la législation de l&#39;UE Directive Cosmétique et de l&#39;UE REACH, validées méthodes alternatives non animales pour l&#39;évaluation fiable et précise de la toxicité oculaire chez l&#39;homme sont nécessaires. Pour répondre à ce besoin, nous avons développé un test d&#39;irritation des yeux (IET), qui utilise un modèle tridimensionnel reconstruit humaine cornée comme épithéliale (RHCE) tissu qui est basée sur des cellules humaines normales. L&#39;IET est capable de séparer les irritants et corrosifs oculaires (SGH catégories 1 et 2 combinés) et ceux qui ne nécessitent pas d&#39;étiquetage (SGH sans catégorie). Le test utilise deux protocoles séparés, l&#39;un conçu pour des produits chimiques liquides et un deuxième protocole similaire pour les articles d&#39;essai solides. Le modèle de prédiction IET utilise une seule période d&#39;exposition (30 min pour les liquides, 6 heures pour les solides) et un seul la viabilité des tissus coupure (60,0% tel que déterminé par le test MTT). Basé sur les résultats de 83 produits chimiques (44 liquides et 39 solides) EIT atteint 95,5 / 68,2 / 81,8% et Sensibilité / spécificité et la précision (SS &amp; A) pour les liquides, 100,0 / 68,4 / 84,6% et de SS &amp; A pour les matières solides, et 97,6 / 68,3 / 83,1% et pour l&#39;ensemble SS &amp; A. L&#39;IET contribuera de manière significative à classer le potentiel d&#39;irritation oculaire d&#39;un large éventail de produits chimiques liquides et solides, sans l&#39;utilisation d&#39;animaux pour satisfaire aux exigences d&#39;essais réglementaires. La méthode EpiOcular IET a été réalisé en 2015 dans les directives de l&#39;OCDE que TG 492.

Résultats transition représentatifs effectués avec 10 des articles de test (TA) et des témoins négatifs et positifs sont présentés dans le tableau 6 et la Figure 3. La DO moyenne = 1,31 pour le NC correspond à 100% la viabilité des tissus, par conséquent, l&#39;ordinateur (DO moyenne = 0,41) avaient la viabilité des tissus relative de 31,2%. Lorsque le protocole EIT a été réalisée dans 15 expériences indépendantes valides dans 7 laboratoires en utilisant le protocole d&#39;exposition liquide et à 8 expériences valides indépendants dans 4 laboratoires, en utilisant le protocole d&#39;exposition solide, la viabilité des tissus moyen de l&#39;ordinateur en utilisant le protocole de liquide était de 36,4 ± 4,0 % et 32,3 ± 6,4% pour le protocole de solides. Dans tous les cas, les résultats de contrôle positifs étaient en dessous de la valeur de coupure de 60,0% 15. Comme le montre la figure 3, TA1, TA2, TA4, TA7 et TA8 eu viabilités des tissus&gt; 60,0% et ont donc été classés comme «NI». TA3, TA5, TA6, TA9, TA10 et avait viabilités de tissus X04; 60,0% et ont donc été classés comme &quot;I&quot;. La différence de la viabilité des tissus entre les tissus en double était &lt;20,0% pour l&#39;ensemble des PS avec une exception de TA2. Par conséquent, les résultats de tous les articles de test, avec une exception de TA2, ont été considérés comme «qualifié», car ils répondaient à tous les critères d&#39;acceptation de l&#39;IET (article 10.2). En raison de la grande variabilité entre les tissus en double pour TA2 dans l&#39;expérience initiale, une deuxième expérience était nécessaire pour obtenir des résultats qualifiés de l&#39;IET. La méthode d&#39;essai IET comme décrit ici en utilisant le modèle de tissu RHCE a été utilisé pour l&#39;évaluation de l&#39;irritation oculaire dans plusieurs études de validation multilaboratoires, y compris la validation formelle par EURL ECVAM / Cosmetics Europe 15,17-19. Dans toutes les études, l&#39;IET a été montré pour être reproductible et a été en mesure d&#39;identifier correctement les produits chimiques (substances et mélanges) ne nécessitant pas de classification et d&#39;étiquetage de l&#39;irritation oculaire ou des lésions oculaires graves acCording au SGH des Nations unies 15,17-19. La méthode d&#39;essai IET remplissait les critères d&#39;acceptation du Groupe de gestion de la validation (VMG) pour irritation des yeux pour la sensibilité, la spécificité et la précision globale et il est actuellement en instance mise en œuvre formelle comme un remplacement partiel pour le lapin in vivo test de Draize 19. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52979/52979fig1.jpg" /> Figure 1: Schéma du protocole IET pour liquides et solides des articles de test abréviations utilisées: AM, milieu de dosage;. CSC, conditions de culture standard; PBS, saline tamponnée au phosphate de Dulbecco; RT température ambiante. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52979/52979fig2.jpg" /> Figure 2:. La configuration de la plaque de 96 puits normalisé pour le test MTT de la viabilité des tissus 200 Deux aliquotes sont transferred dans les puits appropriés d&#39;une plaque pré-marquée de 96 puits. Les abréviations utilisées: NC, contrôle négatif; PC, contrôle positif; TA1-TA20, articles de test 1-20; Blank, solution d&#39;extraction. 96- configuration de plaque de MTT est utilisé avec Excel conçu pour calculer RHCE la viabilité des tissus et des résultats de l&#39;IET. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52979/52979fig3.jpg" /> Figure 3: les résultats obtenus pour l&#39;IET articles 10 de test, NC et les contrôles de PC en utilisant le modèle de tissu RHCE Le graphique est générée à partir d&#39;une feuille de calcul Excel conçu pour présenter les résultats de l&#39;IET.. Produits chimiques d&#39;essai qui réduit la viabilité des tissus ≤ 60,0% par rapport à NC sont classés comme irritants (&quot;I&quot;, TA3, TA5, TA6, TA9 et TA10) et les produits chimiques de test qui avait la viabilité des tissus&gt; 60,0% sont classés comme non-irritants (&quot; NI &quot;, TA1, TA2, TA4, TA7 et TA8). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="7"> Heure de départ pour les étapes de travail du protocole IET (le d&#39;une journée de travail pour un opérateur) </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Chaque ligne correspond à une paire de tissus </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ordre des étapes: </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Liquides: </td><td> PBS </td><td> TA Exposition </td><td> Post- Faire tremper </td><td> Post- <td> MTT Réaction </td><td> MTT Extraction </td><td> Mesure </td></tr><tr><td></td><td> 30 min </td><td> 30 min </td><td> 12 min </td><td> 120 min </td><td> 180 min </td><td> 120 min </td><td> OD </td></tr><tr><td> Caroline du Nord </td><td> 09h00 </td><td> 09:30 </td><td> 10h00 </td><td> 10h12 </td><td> 12h12 </td><td> 15h12 </td><td> après </td></tr><tr><td> Ordinateur personnel </td><td> 09h01 </td><td> 09h31 </td><td> 10h01 </td><td> 10h13 </td><td> 12h13 </td><td> 15h13 </td><td> 17h30 </td></tr><tr><td> TA-1 </td><td> 09h02 </td><td> 09h32 </td><td> 10h02 </td><td> 10h14 </td><td> 12h14 </td><td> 15h14 </td><td></td></tr><tr><td> TA-2 &lt;/ strong&gt; </td><td> 09h03 </td><td> 09h33 </td><td> 10h03 </td><td> 10h15 </td><td> 12h15 </td><td> 15h15 </td><td></td></tr><tr><td> TA-3 </td><td> 09h04 </td><td> 09h34 </td><td> 10h04 </td><td> 10h16 </td><td> 12h16 </td><td> 15h16 </td><td></td></tr><tr><td> TA-4 </td><td> 09h05 </td><td> 09h35 </td><td> 10h05 </td><td> 10h17 </td><td> 12h17 </td><td> 15h17 </td><td></td></tr><tr><td> TA-5 </td><td> 09h06 </td><td> 09h36 </td><td> 10h06 </td><td> 10h18 </td><td> 12h18 </td><td> 15h18 </td><td></td></tr><tr><td> TA-6 </td><td> 09h07 </td><td> 09h37 </td><td> 10h07 </td><td> 10h19 </td><td> 12h19 </td><td> 15h19 </td><td></td></tr><tr><td> TA-7 </td><td> 09h08 </td><td> 09h38 </td><td> 10h08 </td><td> 10h20 </td><td> 12h20 </td><td> 15h20 </td><td></td></tr><tr><td><stro<html> ng&gt; TA-8 </td><td> 09h09 </td><td> 09h39 </td><td> 10h09 </td><td> 10h21 </td><td> 12h21 </td><td> 15h21 </td><td></td></tr><tr><td> TA-9 </td><td> 09h10 </td><td> 9h40 </td><td> 10h10 </td><td> 10h22 </td><td> 12h22 </td><td> 15h22 </td><td></td></tr><tr><td> TA-10 </td><td> 09h11 </td><td> 09h41 </td><td> 10h11 </td><td> 10h23 </td><td> 12h23 </td><td> 15h23 </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 3:. Calendrier Exemple de l&#39;essai des articles liquides de test étapes de Protocole, notamment en pré-mouiller les tissus avec DPBS, l&#39;application des articles de test (AT), au rinçage et post-trempage, la période post-incubation, test MTT, Extraction de MTT, et évaluation de MTT OD sont présentés dans des colonnes. Fois pour les tissus doubles sont organisées en rangées. Les entières tests de dosage 10 PS et les contrôles peuvent être finis en une seule journée. e_content &quot;&gt; <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" height="439" width="582"><tbody><tr><td colspan="6"> Heure de départ pour les étapes du protocole de l&#39;IET (2 jours de travail pour un opérateur) </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Chaque ligne correspond à une paire de tissus </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Jour 1 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Jour 2 (le lendemain) </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ordre des étapes: </td><td> 1 </strong&gt; </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Solides: </td><td> PBS </td><td> TA Exposition </td><td> Post- Faire tremper </td><td> Post- IncubAction </td><td> MTT Réaction </td><td> MTT Extraction </td><td> Mesure </td></tr><tr><td></td><td> 30 min </td><td> 6 heures </td><td> 26 min </td><td> 18 h </td><td> 180 min </td><td> 120 min </td><td> OD </td></tr><tr><td> Caroline du Nord </td><td> 09h00 </td><td> 09:30 </td><td> 15h30 </td><td> 15h56 </td><td> 09h56 </td><td> 12h56 </td&gt; <td> après </td></tr><tr><td> Ordinateur personnel </td><td> 09h02 </td><td> 09h32 </td><td> 15h32 </td><td> 15h58 </td><td> 09h58 </td><td> 12h58 </td><td> 15h30 </td></tr><tr><td> TA-1 </td><td> 09h04 </td><td> 09h34 </td><td> 15h34 </td><td> 16h00 </td><td> 10h00 </td><td> 13h00 </td><td></td></tr><tr><td> TA-2 </td><td> 09h06 </td><td> 09h36 </td><td> 15h36 </td><td> 16h02 </td><td> 10h02 </td><td> 13h02 </td><td></td></tr><tr><td> TA-3 </td><td> 09h08 </td><td> 09h38 </td><td> 15h38 </td><td> 16h04 </td><td> 10h04 </td><td> 13h04 </td><td></td></tr><tr><td> TA-4 </td><td> 09h10 </td><td> 9h40 </td><td> 15h40 </td><td> 16h06 </td><td> 10h06 </td><td> 13h06 </td><td></td></tr><tr><td> TA-5 </td><td> 09h12 </td><td> 09h42 </td><td> 15h42 </td><td> 16h08 </td><td> 10:08 &lt;/ td&gt; <td> 13h08 </td><td></td></tr><tr><td> TA-6 </td><td> 09h14 </td><td> 09h44 </td><td> 15h44 </td><td> 16h10 </td><td> 10h10 </td><td> 13h10 </td><td></td></tr><tr><td> TA-7 </td><td> 09h16 </td><td> 09h46 </td><td> 15h46 </td><td> 16h12 </td><td> 10h12 </td><td> 13h12 </td><td></td></tr><tr><td> TA-8 </td><td> 09h18 </td><td> 09h48 </td><td> 15h48 </td><td> 16h14 </td><td> 10h14 </td><td> 13h14 </td><td></td></tr><tr><td> TA-9 </td><td> 09h20 </td><td> 09h50 </td><td> 15h50 </td><td> 16h16 </td><td> 10h16 </td><td> 13h16 </td><td></td></tr><tr><td> TA-10 </td><td> 09h22 </td><td> 09h52 </td><td> 15h52 </td><td> 16h18 </td><td> 10h18 </td><td> 13h18 </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 4: calendrier Exemple pour les tests d&#39;articles de test solides. Étapes de Protocole, notamment en pré-mouiller les tissus avec DPBS, Application des articles d&#39;essai, de rinçage et de post-trempage, la période post-incubation, test MTT, Extraction de MTT, et évaluation de MTT OD sont présentés dans des colonnes. Fois pour les tissus doubles sont organisées en rangées. L&#39;ensemble du test de tester 10 AT et des contrôles est effectuée sur une période de deux jours. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Montant </td><td> Réactif </td><td> Conditions de stockage </td><td> Source </td><td> Description </td><td> Date d&#39;expiration </td></tr><tr><td> 1 flacon, 2 ml </td><td> Concentré MTT (MTT-100-CON) </td><td> Protégé de la lumière (-20ºC) </td><td> MatTek </td><td> Frozen MTT concentré </td><td> 2 mois </td></tr><tr><td> 1 flacon, 8 ml </td><td> MTT diluant </td><td> 2-8 &amp;# 186; C </td><td> MatTek </td><td> Par dilution MTT concentré avant utilisation dans le dosage MTT </td><td> 2 mois </td></tr><tr><td> 1 bouteille, 60 ml </td><td> Isopropanol (# CAS 67-63-0) </td><td> RT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Solution d&#39;extraction </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Tableau 5: MTT-100 Assay Composants Kit. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> N ° de code </td><td> Tissu </td><td colspan="2"> Données brutes </td><td colspan="2"> Données corrigées Blank </td><td rowspan="2"> moyenne de DO </td><td rowspan="2"> % De viabilité </td></tr><tr><td></td><td> n </td><td> Aliq. 1 </td><td> Aliq. 2 </td><td> Aliq. 1 </td><td> Aliq. 2 </td></tr><tr><td> Caroline du Nord </td><td>1 </td><td> 1.316 </td><td> 1.352 </td><td> 1.316 </td><td> 1.352 </td><td> 1.334 </td><td> 101,6 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1.277 </td><td> 1.309 </td><td> 1.277 </td><td> 1.309 </td><td> 1.293 </td><td> 98,4 </td></tr><tr><td> Ordinateur personnel </td><td> 1 </td><td> 0,379 </td><td> 0,397 </td><td> 0,379 </td><td> 0,397 </td><td> 0,388 </td><td> 29,6 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,419 </td><td> 0,442 </td><td> 0,419 </td><td> 0,442 </td><td> 0,431 </td><td> 32,8 </td></tr><tr><td> TA1 </td><td> 1 </td><td> 1.213 </td><td> 1.244 </td><td> 1.213 </td><td> 1.244 </td><td> 1.229 </td><td> 93,5 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1.355 </td><td> 1.355 </td><td> 1.355 </td><td> 1.355 </td><td> 1.355 </td><td> 103,2 </td></tr><tr><td> TA2 </td><td> 1 </td><td> 1.210 </td><td> 1.122 </td><td> 1.210 </td><td> 1.122 </td><td> 1.166 </td><td> 88,7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,828 </td><td> 0,837 </td><td> 0,828 </td><td> 0,837 </td><td> 0,833 </td><td> 63,4 </td></tr><tr><td> TA3 </td><td> 1 </td><td> 0,167 </td><td> 0,168 </td><td> 0,167 </td><td> 0,168 </td><td> 0,167 </td><td> 12,7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,138 </td><td> 0,136 </td><td> 0,138 </td><td> 0,136 </td><td> 0,137 </td><td> 10.4 </td></tr><tr><td> TA4 </td><td> 1 </td><td> 1.137 </td><td> 1.160 </td><td> 1.137 </td><td> 1.160 </td><td> 1.149 </td><td> 87,4 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1.262 </td><td> 1.191 </td><td> 1.262 </td><td> 1.191 </td><td> 1.227 </td><td> 93,4 </td></tr><tr><td> TA5 </td><td> 1 </td><td> 0.610 </td><td> 0,621 </td><td> 0.610 </td><td> 0,621 </td><td> 0,616 </td><td> 46,9 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,480 </td><td> 0,484 </td><td> 0,480 </td><td> 0,484 </td><td> 0,482 </td><td> 36,7 </td></tr><tr><td> TA6 </td><td> 1 </td><td> 0,502 </td><td> 0,513 </td><td> 0,502 </td><td> 0,513 </td><td> 0,508 </td><td> 38,7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,396 </td><td> 0,407 </td><td> 0,396 </td><td> 0,407 </td><td> 0,402 </td><td> 30,6 </td></tr><tr><td> TA7 </td><td> 1 </td><td> 1.048 </td><td> 1.050 </td><td> 1.048 </td><td> 1.050 </td><td> 1.049 </td><td> 79,9 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1.149 </td><td> 1.150 </td><td> 1.149 </td><td> 1.150 </td><td> 1.150 </td><td> 87,5 </td></tr><tr><td> TA8 </td><td> 1 </td><td> 1.032 </td><td> 1.034 </td><td> 1.032 </td><td> 1.034 </td><td> 1.033 </td><td> 78,7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,941 </td><td> 0,935 </td><td> 0,941 </td><td> 0,935 </td><td> 0,938 </td><td> 71,4 </td></tr><tr><td> TA9 </td&gt; <td> 1 </td><td> 0,022 </td><td> 0,022 </td><td> 0,022 </td><td> 0,022 </td><td> 0,022 </td><td> 1.7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,144 </td><td> 0,149 </td><td> 0,144 </td><td> 0,149 </td><td> 0,147 </td><td> 11.2 </td></tr><tr><td> TA10 </td><td> 1 </td><td> 0,150 </td><td> 0,150 </td><td> 0,150 </td><td> 0,150 </td><td> 0,150 </td><td> 11,4 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,254 </td><td> 0,255 </td><td> 0,254 </td><td> 0,255 </td><td> 0,255 </td><td> 19,4 </td></tr></tbody></table><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> signifier </td><td> Dif. </td><td> moyenne de </td><td> Dif. </td><td> Dif. / 2 </td><td colspan="2"> Classification </td></tr><tr><td></td><td> de la DO </td><td> de la DO </td><td> viabilités [%] </td><td> des viabilités </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Caroline du Nord </td><td> 1.314 </td><td> 0,041 </td><td> 100,0 </td><td> 3.12 </td><td> 1,56 </td><td> NI </td><td> qualifié </td></tr><tr><td> Ordinateur personnel </td><td> 0,410 </td><td> 0,043 </td><td> 31,2 </td><td> 3.23 </td><td> 1,62 </td><td> JE </td><td> qualifié </td></tr><tr><td> TA1 </td><td> 1.292 </td><td> 0,127 </td><td> 98,3 </td><td> 9,63 </td><td> 4.81 </td><td> NI </td><td> qualifié </td></tr><tr><td> TA2 </td><td> 0,999 </td><td> 0,333 </td><td> 76,1 </td><td> 25.36 </td><td> 12.68 </td><td> NI </td><td> D&gt; 20 </td></tr><tr><td> TA3 </td><td> 0,152 </td><td> 0,030 </td><td> 11,6 </td><td> 2.32 </td><td> 1.16 </td><td> JE </td><td> qualifié </td></tr><tr><td> TA4 </td><td> 1.188 </td><td> 0,078 </td><td> 90,4 </td><td> 5,94 </td><td> 2.97 </td><td> NI </td><td> qualifié </td></tr><tr><td> TA5 </td><td> 0,549 </td><td> 0,134 </td><td> 41,8 </td><td> 10.16 </td><td> 5.08 </td><td> JE </td><td> qualifié </td></tr><tr><td> TA6 </td><td> 0,455 </td><td> 0,106 </td><td> 34,6 </td><td> 8.07 </td><td> 4.03 </td><td> JE </td><td> qualifié </td></tr><tr><td> TA7 </td><td> 1.100 </td><td> 0,101 </td><td> 83,7 </td><td> 7,65 </td><td> 3.82 </td><td> NI </td><td> qualifié </td></tr><tr><td> TA8 </td><td> 0,986 </td><td> 0,095 </td><td> 75,0 </td><td> 7.23 </td><td> 3,62 </td><td> NI </td><td> qualifié </td></tr><tr><td> TA9 </td><td> 0,085 </td><td> 0,125 </td><td> 6.4 </td><td> 9,48 </td><td> 4.74 </td><td> JE </td><td> qualifié </td></tr><tr><td> TA10 </td><td> 0,203 </td><td> 0,105 </td><td> 15,4 </td><td> 7,95 </td><td> 3,98 </td><td> JE </td><td> qualifié </td></tr></tbody></table> Tableau 6:. EIT résultats obtenus pour 10 articles d&#39;essai, NC et PC contrôles Les tables sont produced par une feuille de calcul Excel conçu pour calculer la viabilité des tissus et des résultats de l&#39;IET. Produits chimiques d&#39;essai qui réduit la viabilité des tissus ≤ 60,0% par rapport à NC sont classés comme irritants (&quot;I&quot;, TA3, TA5, TA6, TA9 et TA10) et les produits chimiques de test qui avait la viabilité des tissus&gt; 60,0% sont classés comme non-irritants (&quot; NI &quot;, TA1, TA2, TA4, TA7 et TA8).

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Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

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Bioengineering

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

37.0K vues.  MatTek Corporation.  Nous avons développé un test d'irritation des yeux qui utilise un modèle de tissu tridimensionnel épithéliale reconstruit cornée comme humaine (RHCE). Le test est capable de discriminer entre irritation oculaire et des matériaux corrosifs (SGH Catégories 1 et 2 combinés) et ceux qui ne nécessitent pas d'étiquetage (SGH sans catégorie). 

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Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

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	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
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Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury leading to permanent pathological damage. Existing conventional assays allow the analysis of leukocyte adhesion molecules only after the extraction of leukocytes from the blood. This requires the blood to undergo several steps before peripheral blood leukocytes (PBLs) can be ready for analysis, which in turn can stimulate PBLs influencing the research findings. The autoperfused micro flow chamber assay, however, allows scientists to study early leukocytes functional dysregulation using the systemic flow of a live mouse while having the freedom of manipulating a coated chamber. Through a disease model, the functional expression of leukocyte adhesion molecules can be assessed and quantified in a micro-glass chamber coated with immobilized endothelial adhesion molecules ex vivo. In this model, the blood flows between the right common carotid artery and left external jugular vein of a live mouse under anesthesia, allowing the interaction of native PBLs in the chamber. Real-time experimental analysis is achieved with the assistance of an intravital microscope as well as a Harvard Apparatus pressure device. The application of a flow regulator at the input point of the glass chamber allows comparable physiological flow conditions amongst the experiments. Leukocyte rolling velocity is the main outcome and is measured using the National Institutes of Health open-access software ImageJ. In summary, the autoperfused micro flow chamber assay provides an optimal physiological environment to study leukocytes endothelial interaction and allows researchers to draw accurate conclusions when studying inflammation.

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Here, we present a protocol that allows the investigator to assess leukocyte recruitment dynamics ex vivo by connecting a chamber coated with endothelial-derived adhesion molecules to the circulatory system of a mouse. This method offers significant advantages since it allows for leukocyte assessment under relative biological conditions.

Évaluer les interactions de leucocytes-endothélial dans des conditions d&#39;écoulement dans un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Autoperfused Microflow Chambre Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

Production, la caractérisation et utilisations potentielles d&#39;un humain de l&#39;oesophage muqueux modèle 3D de l&#39;ingénierie tissulaire

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Encapsulated Cell Technology for the Delivery of Biologics to the Mouse Eye

Many current therapeutics under development for diseases of the posterior pole of the eye are biologics. These drugs need to be administered frequently, typically via intravitreal injections. Encapsulated cells expressing the biologic of choice are becoming a tool for local protein production and release (e.g., via long-term drug delivery). In addition, encapsulation systems utilize permeable materials that allow diffusion of nutrients, waste, and therapeutic factors into and out of cells. This occurs while masking the cells from the host immune response, avoiding the need for suppression of the host immune system. This protocol describes the use of alginate as a polymer in microencapsulation coupled with the electrospray method as a microencapsulation technique. ARPE-19 cells, a spontaneously arising human RPE cell line, has been used in long-term cell therapy experiments due to its lifetime functionality, and it is used here for encapsulation and delivery of the capsules to mouse eyes. The manuscript summarizes the steps for cell microencapsulation, quality control, and ocular delivery.

Presented here is a protocol for the use of alginate as a polymer in microencapsulation of immortalized cells for long-term delivery of biologics to rodent eyes.

Technologie cellulaire encapsulée pour la livraison de produits biologiques à l’œil de souris

Many current therapeutics under development for diseases of the posterior pole of the eye are biologics. These drugs need to be administered frequently, ...

Growth of Human and Sheep Corneal Endothelial Cell Layers on Biomaterial Membranes

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is deleterious for the cells as it reduces their ability to form a mature and functional layer. Here, we present a method for establishing and subculturing human and sheep corneal endothelial cell cultures that minimizes the loss of cell-to-cell contact. Explants of corneal endothelium/Descemet&#39;s membrane are taken from donor corneas and placed into tissue culture under conditions that allow the cells to collectively migrate onto the culture surface. Once a culture has been established, the explants are transferred to fresh plates to initiate new cultures. Dispase II is used to gently lift clumps of cells off tissue culture plates for subculturing. Corneal endothelial cell cultures that have been established using this protocol are suitable for transferring to biomaterial membranes to produce tissue-engineered cell layers for transplantation in animal trials. A custom-made device for supporting biomaterial membranes during tissue culture is described and an example of a tissue-engineered graft composed of a layer of corneal endothelial cells and a layer of corneal stromal cells on either side of a collagen type I membrane is presented.

This protocol describes the critical steps required to establish and grow corneal endothelial cell cultures from explants of human or sheep tissue. A method for subculturing corneal endothelial cells on membranous biomaterials is also presented.

Croissance des couches cellulaires endothéliales coréennes humaines et brebis sur les membranes biomatériaux

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol applies a macromolecular crowding (MMC) technique to mimic this physiological crowding through the addition of neutral polymers (crowders) to cell cultures in vitro. Previous studies using Ficoll or dextran as crowders demonstrate that the expression of collagen I and fibronectin in WI38 and WS-1 cell lines are significantly enhanced using the MMC technique. However, this technique has not been validated in primary hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts (hHSFs). As hypertrophic scarring arises from the excessive deposition of collagen, this protocol aims to construct a collagen-rich in vitro hypertrophic scar model by applying the MMC technique with hHSFs. This optimized MMC model has been shown to possess more similarities with in vivo scar tissue compared to traditional 2-dimensional (2-D) cell culture systems. In addition, it is cost-effective, time-efficient, and ethically desirable compared to animal models. Therefore, the optimized model reported here offers an advanced &#8220;in vivo-like&#8221; model for hypertrophic scar-related studies.

This protocol describes the use of macromolecular crowding to create an in vitro human hypertrophic scar tissue model that resembles in vivo conditions. When cultivated in a crowded macromolecular environment, human skin fibroblasts exhibit phenotypes, biochemistry, physiology, and functional characteristics resembling scar tissue.

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

Cultiver un épiderme humain reconstruit tridimensionnel à grande échelle

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression of a wide range of diseases including breast, ovarian, kidney, and pancreatic cancers. Freely available fiber quantification software tools are mainly focused on the calculation of fiber alignment or orientation, and they are subject to limitations such as the requirement of manual steps, inaccuracy in detection of the fiber edge in noisy background, or lack of localized feature characterization. The collagen fiber quantitation tool described in this protocol is characterized by using an optimal multiscale image representation enabled by curvelet transform (CT). This algorithmic approach allows for the removal of noise from fibrillar collagen images and the enhancement of fiber edges to provide location and orientation information directly from a fiber, rather than using the indirect pixel-wise or window-wise information obtained from other tools. This CT-based framework contains two separate, but linked, packages named &#8220;CT-FIRE&#8221; and &#8220;CurveAlign&#8221; that can quantify fiber organization on a global, region of interest (ROI), or individual fiber basis. This quantification framework has been developed for more than ten years and has now evolved into a comprehensive and user-driven collagen quantification platform. Using this platform, one can measure up to about thirty fiber features including individual fiber properties such as length, angle, width, and straightness, as well as bulk measurements such as density and alignment. Additionally, the user can measure fiber angle relative to manually or automatically segmented boundaries. This platform also provides several additional modules including ones for ROI analysis, automatic boundary creation, and post-processing. Using this platform does not require prior experience of programming or image processing, and it can handle large datasets including hundreds or thousands of images, enabling efficient quantification of collagen fiber organization for biological or biomedical applications.

Here, we present a protocol to use a curvelet transform-based, open-source MATLAB software tool for quantifying fibrillar collagen organization in the extracellular matrix of both normal and diseased tissues. This tool can be applied to images with collagen fibers or other types of line-like structures.

Quantification de l’organisation du collagène fibrillar avec des outils curvelet à base de transformation

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression ...