Les auteurs tiennent à remercier ZEBET au BfR (Allemagne), BASF SE (Allemagne), IIVS Inc (USA), Zet-LSL (Autriche) pour participer à étude multicentrique de validation internationale de la SIT à jour EpiDerm (5 ).

Conditionné tissus I. - Jour 0 <ol><li> Dès réception de la PEV EpiDerm SIT-200-kit, vérifier tous les composants du kit pour l&#39;intégrité (pour plus de détails voir le tableau kit de réactifs et équipements spécifiques). </li><li> Pour tous les trois tissus EpiDerm, préparer un stérile 6-même plaque de pré-rempli avec 0,9 ml de milieu de dosage. </li><li> Dans des conditions stériles, ouvrez le sac en plastique contenant la plaque de 24 puits contenant les tissus EpiDerm et enlever la gaze stérile. </li><li> Utilisez une pince stérile pour enlever chaque insert contenant les tissus EpiDerm et le lieu de l&#39;insérer dans le vide de 24 puits à plaques. Durant cette étape, enlever tout reste d&#39;expédition agarose qui adhère à la face externe de l&#39;insert en douceur buvard sur du papier filtre stérile. </li><li> Dans les 5 prochaines minutes, inspecter visuellement les tissus. Ne pas utiliser les tissus défectueux ou tissus qui sont entièrement recouvertes de liquide. </li><li> Aide d&#39;un écouvillon coton-tige stérile, sécher soigneusement la surface des tissus. Essayez de ne pas toucher le tissu directement - les effets capillaires sont suffisants pour éliminer l&#39;humidité de la surface du tissu. </li><li> Après séchage de la surface du tissu, de transfert trois tissus de la rangée supérieure des plaques de 6 puits pré-rempli avec 0,9 mL de milieu de dosage. Communiqué de bulles d&#39;air piégées sous les inserts. </li><li> Placez les plaques de 6 puits contenant les insère dans l&#39;incubateur pendant 60 ± 5 min de pré-incubation à 37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 95% HR (humidité relative). </li><li> A la fin des années 60 ± 5 min de pré-période d&#39;incubation, transférer les inserts dans les puits supérieures dans les puits inférieurs de la plaque à 6 puits. Placez les plaques de nouveau dans l&#39;étuve (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 95% HR) pour une nuit de pré-incubation (18 ± 3 h). </li><li> Placez le reste du milieu de dosage dans le réfrigérateur (5 ± 3 ° C). Après la nuit de pré-incubation, les produits chimiques d&#39;essai peut être appliqué aux tissus EpiDerm. Remarque: La procédure de pré-incubation peut être raccourcie en cas de livraison tardive des tissus (par exemple si les tissus arrivent le mercredi au lieu du mardi). </li></ol> II. Exposition aux produits chimiques - Jour 1 <ol><li> Préparer une plaque de 6 puits par produit chimique de test en remplissant la rangée supérieure uniquement avec 0,9 ml par puits de milieu de dosage. </li><li> Environ 5 minutes avant l&#39;exposition prévue aux produits chimiques, enlever les plaques de 6 puits contenant des tissus pré-conditionné de l&#39;incubateur. </li><li> Évaluer la surface des tissus et enlever toute l&#39;humidité à l&#39;aide des conseils de coton stérile. </li><li> Étiqueter tous les couvercles plaque à 6 puits avec les codes de matériel d&#39;essai ou de noms. </li><li> Dose les tissus avec les produits chimiques d&#39;essai à 1 minute d&#39;intervalle pour faciliter le rinçage de la chimie de test après l&#39;exposition. Garder les assiettes avec les tissus dosé dans la hotte stérile, jusqu&#39;à ce que le dernier tissu est dosé. </li><li> Pour tester les produits chimiques liquides, dispenser 30 uL de la solution directement au-dessus du tissu et placer le filet de nylon à la surface des tissus. Si nécessaire, doucement la position du maillage en utilisant l&#39;ampoule dirigée pipette Pasteur en verre. N&#39;appuyez pas sur la surface du tissu. </li><li> Pour les semi-solides essai, l&#39;utilisation d&#39;une pipette volumétrique de dispenser 30 uL directement au-dessus du tissu. Si nécessaire, le répandre chimique avec une pipette Pasteur pour couvrir la surface du tissu, autant que possible. </li><li> Pour les matériaux solides, peu avant l&#39;application de la substance d&#39;essai, humidifier la surface du tissu avec 25 uL de DPBS stérile. Cela permettra d&#39;améliorer de contact de la surface du tissu avec le produit chimique d&#39;essai. Remplissez un 25 mg une cuillère calibrée de demande forte (ou tout autre outil approprié) avec environ 25 mg de matière broyée finement tests. Appliquer le produit chimique d&#39;essai solide à la surface du tissu. Si nécessaire, utilisez une ampoule dirigée pipette Pasteur de vider complètement la cuillère. Secouez la inserts pour améliorer la diffusion de la solide sur la surface. </li><li> Pour les substances de test avec une consistance cireuse, essayer de former un appartement &quot;cookie comme« morceau d&#39;environ 8 mm de diamètre et de le placer au-dessus du tissu, qui a été préalablement mouillée avec du DPBS stérile. Pour améliorer le contact entre substance d&#39;essai et de tissus, alourdir le «cookie» avec un acier inoxydable ou en plastique d&#39;aide. </li><li> Appliquer DPBS que le contrôle négatif et 5% de SDS comme contrôle positif pour les tissus de contrôle. </li><li> Après le dosage du dernier tissu, de transférer toutes les plaques pendant 35 ± 1 minutes à l&#39;incubateur humidifié (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 95% HR). </li><li> Après les 35 minutes d&#39;incubation ± 1 à 37 ° C enlever toutes les plaques de l&#39;incubateur. Placer les plaques dans la hotte stérile et attendre une période de 60 minutes d&#39;exposition chimique est terminée pour le premier tissu dosé. </li><li> Ensuite commence la procédure de lavage en utilisant les insérer une par intervalle de temps minute (pour assurancee que la durée totale d&#39;exposition pour chaque insert est de 60 minutes). </li><li> Utilisez une bouteille de lavage pour rincer les tissus avec du DPBS stérile. Remplissez le tissu insert 15 fois en utilisant un flux constant de DPBS et il vide (Remarque:. Pour les tissus avec un filet de nylon, laver la surface du tissu 5 fois et de supprimer le maillage soigneusement avec de l&#39;a souligné, pince forte Ensuite, continuer avec le reste 10 lavages). </li><li> Après le 15 rincez à l&#39;aide de la pissette, immerger complètement l&#39;insert 3 fois 150 ml et DPBS secouer pour enlever le reste du matériel d&#39;essai. </li><li> Enfin, rincez l&#39;insert de tissu fois de l&#39;intérieur et une fois de l&#39;extérieur avec du DPBS stérile. </li><li> Enlever tout excédent de DPBS du tissu en agitant l&#39;insert, et il buvard sur le papier buvard stériles. </li><li> Transférer les inserts de tissu effacé de la nouvelle plaque de 6 puits préalablement pré-remplies avec le milieu. Toutes ces étapes (14-18) doit être fait dans 1 min de chaque insertion. </li><li> Après le dernier tissu est rincé, sécher soigneusement la surface de chaque tissu avec un coton-tige stérile. </li><li> Incuber les tissus dans l&#39;incubateur pour les prochaines 24 ± 2 heures (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 95% HR). Remarque: Chaque technicien essai ne doivent pas tester plus de six substances d&#39;essai, y compris les contrôles négatifs et positifs dans une course de test unique (SET), pour être en mesure de suivre le protocole décrit ci-dessous </li></ol> III. D&#39;échange moyen - Jour 2 <ol><li> Après les 24 ± 2 heures post-incubation, transférer les inserts dans la partie inférieure de la plaque de 6 puits, pré-remplis avec 0,9 ml de médias. Media de rangées supérieures peuvent être collectées pour l&#39;analyse des critères d&#39;évaluation supplémentaires (cytokines, chimiokines etc.) L&#39;analyse des critères d&#39;évaluation secondaires est facultative. </li><li> Continuer avec le post-incubation (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 95% HR) pendant 18 ± 3 heures. </li></ol> IV. Test de viabilité MTT - Jour 3 <ol><li> Étiquette à deux plaques de 24 puits avec les noms des produits chimiques ou des codes. Une plaque servira pour l&#39;incubation des tissus avec des MTT et l&#39;autre pour l&#39;étape d&#39;extraction. </li><li> Préparer la solution de MTT par le dégel du concentré de MTT (5 mg / ml) et le diluer avec le diluant MTT. La concentration finale de solution de MTT est de 1 mg / ml. </li><li> Pipeter 300 uL de solution de MTT dans chaque puits de la plaque de 24 puits. </li><li> Retirez les plaques de 6 puits de l&#39;incubateur, éponger le fond des inserts sur un papier buvard, et de les transférer dans la plaque de 24 puits pré-rempli avec MTT. </li><li> Placer la plaque de 24 puits dans l&#39;étuve (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 95% HR) et incuber pendant 3 heures ± 5 min. Respecter strictement les 3 heures ± 5 min le temps d&#39;incubation pour éviter l&#39;écart entre les lectures différentes MTT. </li><li> Lorsque l&#39;incubation MTT est terminée, utilisez une pompe d&#39;aspiration pour aspirer le support doucement MTT de tous les puits. </li><li> Remplir le puits avec du DPBS et aspirer à nouveau. Répétez ceci deux fois plus de rinçage et de s&#39;assurer que les tissus sont secs après l&#39;aspiration dernier. </li><li> Après les lavages de transférer les inserts d&#39;une nouvelle plaque de 24 puits. Plongez délicatement les inserts par pipetage solution 2 ml d&#39;extraction (isopropanol) dans chaque insert. Le niveau va augmenter au-dessus du bord supérieur de l&#39;insert, donc complètement submerger les tissus. </li><li> Sceller la plaque de 24 puits (par exemple avec Parafilm ou en utilisant sac d&#39;étanchéité) pour inhiber l&#39;évaporation d&#39;extraction. Extrait du MTT à partir des tissus d&#39;au moins 2 heures à température ambiante avec agitation douce sur un agitateur plaque (~ 120 rpm). Nuit d&#39;extraction sans secouer peut aussi être utilisé. </li><li> Après la période d&#39;extraction est terminée, percent les inserts avec une aiguille d&#39;injection ou l&#39;ampoule perles pipette Pasteur et de permettre l&#39;extrait de courir dans le puits à partir de laquelle l&#39;insert a été prise. </li><li> Jeter l&#39;insert perforé et une pipette la solution dans le puits de haut en bas trois fois jusqu&#39;à ce qu&#39;elle soit homogène. </li><li> Pour chaque tissu, de transfert à deux aliquots de 200 ul de la solution violette formazan dans une plaque de microtitration 96 puits à fond plat. Transférer les doublons en fonction de la conception plaque fixe donnée dans le tableur accompagnant ce protocole vidéo. Pour les blancs, utilisez l&#39;isopropanol. </li><li> Lire la densité optique (DO) des extraits de MTT dans un spectrophotomètre plaque de 96 puits en utilisant une longueur d&#39;onde de 570 nm (540-580) sans filtre de référence. </li><li> Inscrivez les résultats dans le tableur pour le calcul automatique des résultats (figure 1). </li><li> Un produit chimique d&#39;essai est étiqueté «irritant» (R38 ou de la catégorie 2 du SGH) si la viabilité du tissu pour cent déterminé par test MTT est &lt;50% par rapport au contrôle négatif. Remarque: Le MTT est toxique, donc n&#39;oubliez pas de porter des gants lorsque vous manipulez. Protéger MTT et sa soilutions de la lumière, puisque MTT est sensible à la lumière. Utiliser une solution de MTT dans quelques heures après sa préparation, car il se dégrade au fil du temps. </li></ol> Qualité Assay V. Contrôles <ul><li> EpiDerm PEV-200-SIT Critères d&#39;acceptation kit: Dans les modèles in vitro RHE devrait fournir des données cohérentes, de haute qualité au fil du temps, pas seulement pendant le processus de validation (8). Lignes directrices recommandées pour assurer la reproductibilité de dosage à long terme et de rendement comprennent «une caractérisation complète des cellules ou des tissus, l&#39;échantillonnage de chaque lot ... pour des performances et l&#39;utilisation régulière des contrôles et des produits chimiques de référence pour fournir une assurance de la cohérence de la performance du test&quot; (9) . En plus de critères d&#39;acceptation de dosage décrites ci-dessous, chaque lot de production de EpiDerm de contrôle de qualité est testé par le fabricant contre un produit chimique de référence supplémentaire (1% de Triton X-100). Le temps d&#39;exposition nécessaires pour réduire la viabilité des tissus à 50% (HE-50) pour le Triton X-100 est déterminée. Pour EpiDerm, moyenne annuelle HE-50 valeurs ont varié de 5,9 à 7,5 heures heures. Le lot de beaucoup CV pour les tissus de contrôle négatif (ie la variabilité de la viabilité de base) a été en moyenne moins de 7,5% pour chaque année depuis 1996. La valeur du ET50 chaque lot de production doit se situer à moins de 2 écarts-types de la moyenne historique Triton X-100 ET50 créé en 1996 (soit HE-50 = 6,7 heures; limite d&#39;acceptation plus faible = 4.8h; limite d&#39;acceptation supérieur = 8.7h) afin d&#39;être libéré pour une utilisation par le fabricant. </li><li> EPI-200-SIT Assay acceptation Critère 1: Contrôle négatif: L&#39;OD absolue du contrôle négatif (CN) des tissus (traités avec du DPBS stérile) dans le MTT-test est un indicateur de la viabilité des tissus obtenus dans le laboratoire d&#39;essai après l&#39;expédition et le stockage des procédures et des conditions spécifiques d&#39;utilisation. Le test répond au critère d&#39;acceptation si la moyenne des DO 570 des tissus NC est ≥ 1,0 et ≤ 2,5. </li><li> EPI-200-SIT Assay acceptation Critère 2: Contrôle positif Une solution à 5% de SDS (en H 2 O) est utilisé comme contrôle positif (CP) et testé concurremment avec les produits chimiques d&#39;essai. Signifie Concurrent que le PC doit être testé dans chaque essai, mais pas plus d&#39;un PC est requis par les tests par jour. Viabilité du contrôle positif doit se situer dans l&#39;intervalle de confiance de 95% des données historiques. Le test répond au critère d&#39;acceptation si la viabilité moyenne des tissus PC exprimée en% des tissus témoins négatifs est de 20%. </li><li> EPI-200-SIT Assay acceptation Critère 3: déviation standard (SD) Le pouvoir irritant pour la peau est prédite à partir de la viabilité moyenne déterminée sur 3 tissus unique et donc de la variabilité des tissus répétitions doit être suffisamment faible. Le test répond au critère d&#39;acceptation si la SD calculée à partir de différents tissus viabilités% des 3 traités de façon identique répliques est &lt;18%. </li></ul> Les résultats représentatifs <div style="border:1px #000000 solid; width:100%; padding-bottom:5px;"><img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1.jpg" alt="Figure 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_2.jpg" alt="Figure 2" /> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_3.jpg" alt="Figure 3" /> </div> Figure 1 Les résultats obtenus pour six articles d&#39;essai, NC et de contrôle pour PC -. Une partie de la feuille de calcul automatisé pour le calcul des résultats. Test de produits chimiques qui ont réduit la viabilité des tissus en dessous de 50% référencé à NC sont classés comme irritants. Le test est optimisé pour fournir des résultats qui sont assez loin de la classification de coupure (50% de viabilité) augmentant ainsi la robustesse de l&#39;analyse. <div style="background-image:url(../index_RES_1me8j21/c1vzp1s1_strip23px.png); background-position:0 100%; background-repeat:repeat-x; height:24px; width:100%;"><div style="padding-left:26px; padding-right:4px; padding-top:4px; width:100%;"> Matériaux </div></div><img src="/files/ftp_upload/1366/materialstable.jpg" alt="Liste des matériaux" />

<ol>
	<li>Kand&#225;rov&#225;, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I. n. g. r. i. d., Traue, D., Slawik, B., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+EpiDerm+Test+Protocol+for+the+upcoming+ECVAM+Validation+Study+on+In+Vitro+Skin+Irritation+Tests.">Optimization of the EpiDerm Test Protocol for the upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests.</a> ALTEX. 21, 107-114 (2004).</li><li>Kand&#225;rov&#225;, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol+-+Assessment+of+the+performance+of+the+optimized+test.">EpiDerm Skin Irritation Test Protocol - Assessment of the performance of the optimized test.</a> ATLA. 33, 351-367 (2005).</li><li>Kand&#225;rov&#225;, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Kearney, P., Sheasgreen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Skin+Irritation+Test:+Improving+the+Sensitivity+of+the+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol.Accepted+for+publication.">In Vitro Skin Irritation Test: Improving the Sensitivity of the EpiDerm Skin Irritation Test Protocol.Accepted for publication.</a> ATLA. , (2009).</li><li>Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovi, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kand&#225;rov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ECVAM+International+Validation+Study+on+In+Vitro+Tests+for+Acute+Skin+Irritation:+Report+on+the+Validity+of+the+EPISKIN+and+EpiDerm+Assays+and+on+the+Skin+Integrity+Function+Test.">The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test.</a> ATLA. 35, 559-601 (2007).</li><li>Liebsch, M., Gamer, A., Curren, R., Frank, J., Genschow, E., Tharmann, J., Remmele, M., Bauer, B., Raabe, H., Barnes, N., Hilberer, A., Wilt, N., Lornejad-Sch&#228;fer, M. R., Sch&#228;fer, C., Spiller, E., Hayden, P., Kand&#225;rov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follow-up+validation+of+the+modified+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+(SIT):+results+of+a+multicentre+study+of+twenty+reference+test+substances.">Follow-up validation of the modified EpiDerm Skin Irritation Test (SIT): results of a multicentre study of twenty reference test substances.</a> , (2008).</li><li>United Nations. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS). , (2007).</li><li>ESAC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Statement on the Scientific Validity of In-Vitro Tests for Skin Irritation Testing. , (2008).</li><li>Gupta, K., Rispin, A., Stitzel, K., Coecke, S., Harbell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods:+Issues+and+answers.">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Issues and answers.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 43, 219-224 (2005).</li><li>Rispin, A., Stitzel, K., Harbell, J., Klausner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods:+Current+practice.">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Current practice.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 45, 97-103 (2006).</li></ol>

The authors are employees of MatTek corporation which produce reagents and tools used in this article.

Dans cette vidéo, nous avons démontré le test d&#39;irritation cutanée EpiDerm (EpiDerm SIT) a développé et validé par des tests in vitro d&#39;irritation cutanée des substances chimiques, y compris les ingrédients des produits cosmétiques et pharmaceutiques. Lorsque vous effectuez cette méthode, il est important de travailler dans des conditions aseptiques et de suivre strictement le protocole validé, puisque déviation du protocole peut entraîner des résultats différents. Certaines modifications de l&#39;essai sont possibles, cependant, des modifications au protocole doivent être discutés directement avec les auteurs. La seule limitation de cette méthode est une ingérence possible de la substance d&#39;essai avec le critère de MTT. Une substance d&#39;essai ou d&#39;une couleur qui réduisent directement MTT (et imite ainsi l&#39;activité déshydrogénase des mitochondries cellulaires) peuvent interférer avec le résultat de MTT. Cependant, ces substance d&#39;essai sont un problème seulement si, au moment du test MTT (soit 42 heures après exposition à la substance d&#39;essai) des quantités suffisantes de la substance d&#39;essai sont toujours présents sur (ou dans) les tissus. Dans le cas de cet événement peu probable, la réduction (vrai) MTT métaboliques et de la contribution par un matériel d&#39;essai de couleur ou de (faux) la réduction du MTT directe par le matériel d&#39;essai peut être quantifiée par une procédure décrite en détail dans la procédure de fonctionnement standard de dosage fournie par MatTek Corp

an in vitro skin irritation test (sit) using the epiderm reconstructed human epidermal (rhe) model

Le test d&#39;irritation cutanée EpiDerm (EpiDerm SIT) a été développé<sup&gt; (1,2,3)</sup&gt; Et validé<sup&gt; (4,5)</sup&gt; Pour<em&gt; In vitro</emTests&gt; irritation de la peau des substances chimiques, y compris les ingrédients des produits cosmétiques et pharmaceutiques. Le EpiDerm SIT utilise la 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Reconstruite épidermique humain (RHE) EpiDerm modèle. La procédure décrite dans ce protocole permet la discrimination entre les irritants de la catégorie 2 du SGH et non irritants<sup&gt; (6)</sup&gt;. Le test est effectué au cours d&#39;une période de 4 jours, composé de pré-incubation, exposition de 60 minutes, 42 heures post-incubation et de test de viabilité au MTT. Après réception des tissus et nuit pré-incubation (jour 0), les tissus sont localement exposés aux produits chimiques d&#39;essai (jour 1), qui peut être liquide, semi-solides, solides ou de cire. Trois tissus sont utilisés pour chaque produit chimique d&#39;essai, ainsi que pour le contrôle positif (5% aq. Solution SDS), et un contrôle négatif (DPBS). Exposition chimique dure 60 minutes, 35 minutes dont les tissus sont conservés dans une étuve à 37 ° C. Les substances d&#39;essai sont alors retirés de la surface du tissu par une procédure de lavage extensif. Les inserts de tissu sont effacés et transférés dans un milieu frais. Après une période d&#39;incubation de 24 h (jour 2), le milieu est échangé. Le milieu peut être sauvegardée pour une analyse plus approfondie de cytokines ou d&#39;autres paramètres d&#39;intérêt. Après l&#39;échange moyenne, les tissus sont incubés pendant 18 heures supplémentaires. A la fin de l&#39;ensemble de 42h post-incubation (jour 3), les tissus sont transférés dans une solution de MTT jaune et incubées pendant 3 heures. La résultante bleu-violet du sel de formazan, formée principalement par métabolisme mitochondrial, est extrait pendant 2 heures en utilisant l&#39;isopropanol. La densité optique du formazan extraite est déterminé à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre. Un produit chimique est classé comme un irritant si la viabilité des tissus par rapport à des tissus traités de contrôle négatif est réduit en dessous de 50%. Cette procédure peut être utilisée en remplacement complet de la peau in vivo chez le lapin test d&#39;irritation pour l&#39;identification des dangers et d&#39;étiquetage des produits chimiques en conformité avec les règlements de l&#39;UE<sup&gt; (7)</sup&gt;.

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An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model

Dans cette vidéo, nous démontrons le test d&#39;irritation cutanée EpiDerm (EpiDerm SIT) développée et validée pour<em&gt; In vitro</emTests&gt; irritation de la peau des substances chimiques, y compris les ingrédients des produits cosmétiques et pharmaceutiques.

Une In Vitro Test d&#39;irritation cutanée (SIT) en utilisant le EpiDerm humaine reconstruite épidermique (RHE) Modèle

The EpiDerm Skin Irritation test (EpiDerm SIT) was developed (1,2,3) and validated (4,5) for in vitro skin irritation testing of chemicals, including ...

an-vitro-skin-irritation-test-sit-using-epiderm-reconstructed-human

Research

JoVE Journal

Biology

An In Vitro Skin Irritation Test (SIT) using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal (RHE) Model

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Vidéo: An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

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Christopher Hughes: un modèle in vitro pour l&#39;étude de l&#39;angiogenèse (Interview)

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Recherche

Biologie

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

Souris épidermique Neural Stem Cell Crest (EPI-NCSC) cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

Un allèle spécifique Assay expression du gène pour l&#39;épreuve la base fonctionnelle des associations génétiques

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imagerie C. elegans Les embryons en utilisant un microscope à épifluorescence et de logiciels Open Source

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

À long terme des essais de toxicité létale avec le Crustacé Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

Différenciation de la peau de souris nouveau-nés des cellules souches dérivées dans les cellules germinales comme<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and develops most often in the setting of immunosuppression. Despite decades of research, optimal treatment of KS remains poorly defined and clinical outcomes are especially unfavorable in resource-limited settings. KS lesions are driven by pathological angiogenesis, chronic inflammation, and oncogenesis, and various in vitro cell culture models have been developed to study these processes. KS arises from KSHV-infected cells of endothelial origin, so EC-lineage cells provide the most appropriate in vitro surrogates of the spindle cell precursor. However, because EC have a limited in vitro lifespan, and as the oncogenic mechanisms employed by KSHV are less efficient than those of other tumorigenic viruses, it has been difficult to assess the processes of transformation in primary or telomerase-immortalized EC. Therefore, a novel EC-based culture model was developed that readily supports transformation following infection with KSHV. Ectopic expression of the E6 and E7 genes of human papillomavirus type 16 allows for extended culture of age- and passage-matched mock- and KSHV-infected EC and supports the development of a truly transformed (i.e., tumorigenic) phenotype in infected cell cultures. This tractable and highly reproducible model of KS has facilitated the discovery of several essential signaling pathways with high potential for translation into clinical settings.

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is a tumor induced by infection with the oncogenic virus human herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). The endothelial cell culture model described here is uniquely suited for studying the mechanisms by which KSHV transforms host cells.

Un modèle In Vitro pour étudier la Transformation cellulaire par Herpesvirus sarcome de Kaposi

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately 30 x 106 viable cells per mouse. Primary adult mouse keratinocytes are harvested from the dorsal skin of female mice. Male mice (~6 weeks old) can be used for keratinocyte harvesting depending on the requirements of the experiment. Euthanized mice are shaved and sterilized with serial washes in povidone iodine and ethanol solutions (70% alcohol). After disinfecting the mice, the dorsal skin is removed and the subcutaneous fat and muscle are removed with a scalpel and discarded. The skins are cut into small pieces and treated with a mild, low temperature trypsinization to detach the lower dermis from the epidermis. The scraped epidermises are stirred at low speed, filtered to remove the hairs, counted, and re-suspended in culture medium. This method provides an excellent single cell suspension of highly culturable cells for many downstream applications.

The goal of this protocol is to isolate epidermal keratinocytes from the dorsal skin of adult mice for a variety of downstream applications such as molecular biology, biochemistry, fluorescence activated cell sorting, and primary in vitro uses (e.g., clonogenic keratinocytes).

Isolement des kératinocytes épidermiques de souris et de leur culture clonogène in vitro

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...

A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and require surgical debridement and skin grafting. Successful integration of the donor graft into a recipient wound bed depends on timely recruitment of immune cells, robust angiogenic response and new extracellular matrix formation. The development of novel therapeutic agents, which target some key processes involved in wound healing, are hindered by the lack of reliable preclinical models with optimized objective assessment of wound closure. Here, we describe an inexpensive and reproducible model of experimental full thickness burn wound reconstructed with an allogeneic skin graft. The wound is induced on the dorsum surface of anaesthetized inbred wild type mice from the BALB/C and SKH1-Hrhr backgrounds. The burn is produced using a brass template measuring 10 mm in diameter, which is preheated to 80 &#176;C and delivered at a constant pressure for 20 s. Burn eschar is excised 24 hours after the injury and replaced with a full thickness graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse. No specialized equipment is required for the procedure and surgical techniques are straightforward to follow. The method may be effortlessly implemented and reproduced in most research settings. Certain limitations are associated with the model. Due to technical difficulties, the harvest of thinner split thickness skin grafts is not possible. The surgical method we describe here allows for the reconstruction of burn wounds using full thickness skin grafts. It may be used to carry out preclinical therapeutic testing.

The aim of this study was to develop a murine model of burn wound healing. A thermal burn was induced on the dorsal skin of mice using a preheated brass template. Burned tissue was debrided and overlaid with a skin graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse.

Un modèle murine d’une blessure de brûlure reconstruite avec une greffe de peau allogénique

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and ...