The authors gratefully acknowledge the National Science Foundation (NSF) for financial support of this work through a CAREER award (CBET-0746210) and through award CBET-1159500. We would like to thank Dr. Turkson (Univ. of Hawaii Cancer Center) and Dr. Altomare (Univ. of Central Florida College of Medicine) for assistance with cell culture.

1. Lignes de culture de cellules <ol><li> (Cellules humaines ovariennes tumorales) en maintenant les flacons de cryogène dans l&#39;eau chaude pour les moins de 2 min Thaw TE 71 (cellules épithéliales thymiques Souris), MDA-MB-231 (cellules de cancer du sein humain), de A549 (cellules de cancer du poumon humain) et OVCAR3 . Ajouter 10 ml de milieu DMEM supplémenté avec 10% de FBS à chaque lignée cellulaire et centrifuger pendant 6 min à 106 x g. </li><li> Aspirer la suspension et ajouter des médias 3ml au culot. Mélanger les cellules correctement par pipetage à plusieurs reprises. Ajouter cette solution à la cellule préchauffé 7 ml de milieu DMEM supplémenté avec 10% de FBS dans des flacons T75 et maintenir des flacons en atmosphère humidifiée de 95% d&#39;air / 5% de CO2 à 37 ° C. Étiqueter ce flacon comme Passage 0. </li><li> Lorsque la confluence des cellules atteint 80%, de récolter les cellules par incubation avec de la trypsine 0,05% pendant 10 min. Neutraliser la trypsine en ajoutant quantité égale de médias. Centrifugeuse cette solution pendant 6 minutes à 106 x g. Retirer la suspension et ajouter 3 ml de milieu frais à elle. Mélanger well et transférer petite quantité (100 ul) dans un flacon de culture contenant 7 ml de milieu. Incuber le flacon de culture dans un incubateur. Etiqueter le flacon comme Passage 1. </li><li> Culture des lignées cellulaires jusqu&#39;au passage 11 ou 12. </li></ol> 2. Fabrication de nanoparticules <ol><li> Préparation de ~ 10 -6 M (ajusté) non dilué solution stock MEH-PPV <ol><li> Dans un flacon de 1 mg ajouter Poly [2-méthoxy-5- (2-éthylhexyloxy) -1,4-phénylènevinylène] (MEH-PPV) ayant une masse moléculaire (moyenne en nombre Mn) 150,000-250,000 g / mol et 3 ml de tétrahydrofuranne (THF) . On agite le mélange pendant 2 heures tout en chauffant à 80 ° C sur une plaque chaude. </li><li> Filtrer la solution ci-dessus dans un nouveau flacon en utilisant un filtre à seringue de 0,2 pm. Étiqueter cette solution comme «MEH-PPV solution stock non dilué. Cette solution sera impliqué dans la préparation de nanoparticules après un réglage fin de la concentration comme décrit dans les étapes 2.1.3 et 2.1.4. </li><li> Ajouter 50 pi de la solution stock de MEH-PPV non dilué dans 3 ml de THF. Étiqueter cette solution comme «stock solution diluée MEH-PPV. Transférer dans une cuvette en quartz de 1 cm et mesurer l&#39;absorbance à 495 nm par spectroscopie UV-vis. </li><li> Si l&#39;absorbance de la solution stock de MEH-PPV diluée est supérieure à 0,17, diluer la solution stock de MEH-PPV non dilué en ajoutant plus de THF 1 ml à la fois, et répétez l&#39;étape 2.1.3 jusqu&#39;à ce que l&#39;absorbance mesurée à 495 nm est dans le aller 0,13 à 0,17. </li><li> Calculer la molarité de la solution stock de MEH-PPV diluée en utilisant la loi de Beer-Lambert, comme indiqué ci-dessous. Ici 0,15 absorbance est utilisée, par exemple, pour le reste du protocole (par exemple., D&#39;ajuster tous les calculs suivants sur la base de l&#39;absorbance observée), le coefficient d&#39;extinction MEH-PPV utilisé est de 10 7 M -1 cm -1 et la longueur de chemin d&#39;accès utilisé est 1 cm. A = ε xbxc (équation 1) (ε - le coefficient d&#39;extinction molaire, A - absorbance, b - longueur du trajet, c - concentration de la solution) 0.15 = 10 7 M -1 cm -1 x 1 cm xc (équation 2) c = 1,5 x 10 -8 M (équation 3) Utilisez cette concentration pour trouver la concentration de la solution mère de MEH-PPV non dilué comme suit: M 1 V 1 = V 2 M 2 (équation 4) 0,15 x 10 -7 M x M = 3050 pi 2 x 50 pi (équation 5) M 2 = 9,15 x 10 -7 M (équation 6) Ceci est la concentration de la &#39;MEH-PPV solution stock non dilué ajusté ». </li></ol></li><li> Calcul de masse de MEH-PPV dans la solution stock de MEH-PPV non dilué rajusté <ol><li> Calculer la masse de MEH-PPV dans 1 ml de la solution mère non dilué ajusté comme indiqué ci-dessous en utilisant la molarité obtenue dans la section 2.1.4 et le poids moléculaire (Mw) de MEH-PPV, qui est de 10 6 g / mol. M = n / V (n -. Pas de moles, V - le volume en L) (équation 7) Ainsi, la masse du MEH-PPV dans 1 ml de und ajustésolution stock iluted est 9,15 x 10 -4 g. </li></ol></li><li> Alliant PCBM dans MEH-PPV <ol><li> Calculer la masse de Phenyl-C 61 butyrique ester méthylique d&#39;acide (PCBM) pour être ajouté dans la solution mère de MEH-PPV de faire dopé solution MEH-PPV 50% en poids PCBM, où 50% PCBM est définie par rapport à la masse de MEH-PPV (par exemple, la moitié de la masse de MEH-PPV). En utilisant le poids de MEH-PPV obtenue dans la section 2.2. Messe de PCBM / 9,15 x 10 -4 g de MEH-PPV x 100% = 50% en poids PCBM (équation 8) Messe de PCBM = 4,57 x 10 -4 g (équation 9) </li><li> Peser 1 mg PCBM dans une fiole et ajouter 500 ul de THF. Calculer la concentration de cette solution en PCBM en utilisant le poids moléculaire du PCBM comme 910,88 g / mol Molarité de solution de PCBM = 0,001 g / (910,88 g / mol * 500 pi) (équation 10) Molarité de la solution de PCBM = 2,19 x 10 -9 mol / ul (équation 11) </li><li> Calculer le volume de solution de PCBM nécessaire d&#39;ajouter à la ME non dilué ajustéSolution H-PPV de stock pour obtenir le PCBM dopé solution à 50% en poids de MEH-PPV dans le THF en utilisant la molarité calculé à l&#39;étape 2.3.2 4,57 x 10 -4 g du PCBM x 1 mol / 1 910,88 gx ul / 2,19 x 10 -9 mol = 229 ul (équation 12) Ajouter 229 pi de la solution de PCBM dans 1 ml de solution stock ajusté MEH-PPV non dilué et bien mélanger. </li></ol></li><li> Préparation de nanoparticules par un procédé de reprécipitation <ol><li> Transférer 1 ml de la solution MEH-PPV / PCBM mélangé dans la seringue de 1 ml avec l&#39;aiguille attachée à elle. </li><li> Injecter rapidement 1 ml de la solution MEH-PPV / PCBM mélangé dans 4 ml d&#39;eau DI agitation à 1200 rpm. Arrêtez de remuer immédiatement après l&#39;injection. Utilisez ces nanoparticules sans autre traitement. </li></ol></li></ol> 3. Incubation de lignées cellulaires avec des nanoparticules pour l&#39;imagerie NOTE: Toutes les expériences d&#39;imagerie ont été achevés en boîtes de Pétri de 35 mm <ol><li> L&#39;absorption de nanoparticles dans des lignées cellulaires <ol><li> Des lignées cellulaires de culture jusqu&#39;à la 12 ème passage. À la 12 e des cellules de culture de passage à 35 mm boîtes de Pétri. Ajuster la concentration de cellules ajoutées aux 35 mm boîtes de Pétri de telle sorte qu&#39;après 24 h les cellules sont 40% de confluence. </li><li> A ce stade, retirer le support du DMEM supplémenté avec 10% de FBS à partir des boîtes de Pétri, laver les cellules deux fois avec du DPBS 1x, et ajouter 100 ul de la suspension de nanoparticules dans 2 ml de DMEM pour les boîtes de Pétri. </li><li> Après 24 heures enlever le DMEM / nanoparticules suspension des boîtes de Pétri et laver les cellules avec 1x DPBS 3 fois. Ensuite, fixer les cellules par incubation avec du paraformaldehyde à 4% pendant 10 min. Laver deux fois avec du DPBS. Colorer les cellules avec 300 nM DAPI par incubation avec le colorant pendant 2 min. Laver deux fois avec du DPBS. Puis maintenir les cellules dans du DPBS pour l&#39;imagerie. </li></ol></li><li> Détection de ROS <ol><li> A549 de la Culture et des lignées cellulaires OVCAR3 dans des boîtes de Pétri, 6 pour la lignée cellulaire, comme expliqué dans la section 3.1.1. Etiqueter leDes boîtes de Pétri comme indiqué dans le Tableau 1. </li><li> Ajouter 100 ul de la suspension de nanoparticules dans 2 ml de DMEM à trois des boîtes de Pétri comme indiqué dans le tableau 1 et incuber pendant 24 heures. Pour les boîtes de Pétri qui recevront des doses de lumière, laver les cellules après 24 h et les cellules en suspension dans HBSS (solution saline équilibrée de Hank) Dye médias libres. </li><li> Réchauffez la lampe du simulateur solaire pour 15 min. Placez filtre UV en avant de la lampe à filtrer les rayons UV. Calibrer la lampe avec une cellule solaire de référence en ajustant la puissance de la lampe pour obtenir 0,5 soleil (50 mW / cm 2) intensité à la surface de la boîte de Pétri. Dans cette configuration particulière que la condition a été réalisée avec 218 W de puissance fournie à la lampe. </li><li> Placer les boîtes de Pétri sous la lampe (couvercle ouvert) pendant 60 min, ce qui résulte en un dosage de lumière 180 J / cm 2 tel que représenté dans les calculs ci-dessous: 50 mW / cm 2 x 3.600 sec / 1,000 = 180 J / cm 2 </li><li> Retirer HBSS sans lavage et ajouter en outre de 2 ml de milieu DMEM supplémenté avec 10% de FBS pour les boîtes de Pétri. Incuber les cellules pendant encore 2 heures. </li><li> Pour le contrôle positif incuber les cellules avec 100 pM de peroxyde d&#39;hydrogène (H 2 O 2) pendant 30 min. </li><li> Colorer les cellules dans toutes les boîtes de Pétri avec une concentration finale de 5 uM du réactif de détection ROS en incubant les cellules avec le colorant pendant 30 min à 37 ° C. </li><li> Fixer les cellules par incubation avec du paraformaldehyde à 4% pendant 10 min. Laver deux fois avec du DPBS. Colorer les cellules avec 300 nM DAPI par incubation avec le colorant pendant 2 min. Laver deux fois avec du DPBS. Puis maintenir les cellules dans du DPBS pour l&#39;imagerie. </li></ol></li><li> Apoptose et la nécrose par PI et l&#39;annexine V FITC <ol><li> Culture de chaque lignée cellulaire dans 5 boîtes de Pétri. Trois de ces boîtes de Petri aura pour l&#39;expérience 2, tandis que les boîtes de Pétri restants seront échantillons témoins. Incuber les 3 boîtes de Pétri pour expérimenter avec des nanoparticules que l&#39;eXplained à la section 3.1.2. Les échantillons de contrôle ne sont pas incubées avec des nanoparticules. </li><li> Après 24 heures d&#39;incubation suivre l&#39;étape 3.2.3. </li><li> Placez les 3 boîtes de Pétri expérimentales sous la lampe (couvercle ouvert) et supprimer l&#39;un à 20 min, l&#39;un à 40 min et l&#39;autre à 60 min. Cela donne trois échantillons qui ont été exposés à des doses de lumière de 60, 120 et 180 J / cm 2, respectivement (calcul à la section 3.2.4). Ensuite, administrer un 180 J / cm 2 dosage de la lumière à l&#39;un des plats contrôle de Pétri. Ceci est la dose de lumière de contrôle appliqué en l&#39;absence de nanoparticules. Ne pas appliquer la dose de lumière à l&#39;échantillon de contrôle restant (pas de nanoparticules et aucune dose de lumière appliquée). </li><li> Remplacez le HBSS avec les médias DMEM supplémenté avec 10% de FBS et garder les boîtes de Pétri dans l&#39;incubateur pendant 4 heures. </li><li> Colorer les cellules dans le dispositif expérimental et les boîtes de Pétri de contrôle avec 20 pi d&#39;annexine V FITC en incubant les cellules avec le colorant pendant 15 min. Laver deux fois avec du DPBS. Colorer le caunes avec 300 nM DAPI ainsi que 300 nM PI (iodure de propidium) par incubation avec les colorants pour 2 min. Laver deux fois avec du DPBS. Puis maintenir les cellules dans du DPBS pour l&#39;imagerie. </li></ol></li></ol> 4. La cytotoxicité intrinsèque de nanoparticules <ol><li> Le comptage des cellules et mise en culture dans des plaques à 96 puits <ol><li> Récolter les cellules provenant des flacons de culture en supprimant médias et lavage des cellules deux fois avec du DPBS puis par incubation des cellules avec de la trypsine 0,05% pendant 10 min. Ajouter 2 ml de milieu DMEM supplémenté avec 10% de FBS à la solution de cellules résultante. Mélanger la solution appropriée pour séparer les amas de cellules en maillots. </li><li> Prendre 100 ul de la suspension de cellules et ajouter 900 ul de milieu DMEM supplémenté avec 10% de FBS. Bien mélanger. Placez 10 pi de cette suspension sur un hémocytomètre. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre et la régler la concentration de la suspension de cellules dans 4.1.1 à 5 x 10 4 cellules / ml. </li><li> Prenez 5 plaques à 96 puits étiquetés comme 0 h, 24 hr, 48 h, 72 h et 96 h. Ajouter 50 pi de 5 x 10 4 cellules / ml des solutions de cellules (TE 71 et A549) dans les puits comme indiqué dans le tableau 2, l&#39;ensemencement ainsi 2500 cellules / puits. Faites la même procédure pour les lignées cellulaires OVCAR3 et MDA-MB-231. </li><li> Après 24 h laver les puits avec du DPBS 1x et ajouter 50 ul de concentrations croissantes de nanoparticules dans les puits comme indiqué dans le tableau 2. Préparer différentes concentrations de nanoparticules par addition de 20, 100, et 180 ul de suspension de nanoparticules à 2.4.2 DMEM à obtenir un volume final de 2 ml, ce qui donne des concentrations de nanoparticules de 0,4 x 10 -4 mg / ml, 2,0 x 10 -4 mg / ml, et 3,6 x 10 -4 mg / ml, respectivement. Chaque lignée cellulaire a triple pour chaque concentration de nanoparticules. </li></ol></li><li> Mesure de la viabilité cellulaire dans l&#39;obscurité <ol><li> Ajouter 10 ul MTT à la plaque 0 h immédiatement après l&#39;ajout de nanoparticules. Incuber la plaque pendant 4 heures pour cryst formazanals pour former. Ajouter la solution de solubilisation de 50 ul dans les puits. Incuber la plaque pendant 6 heures pour dissoudre les cristaux de formazan. </li><li> Mesure de la viabilité cellulaire de la plaque de 0 h en enregistrant l&#39;absorbance à 570 nm avec un lecteur de microplaque. </li><li> Pour une plaque à 24 h, laver les cellules avec 1x DPBS et ajouter 50 médias ul dans chaque puits d&#39;incubation après 24 h avec des nanoparticules. Ajouter MTT et de lire la plaque, comme expliqué en 4.2.1 et 4.2.2. </li><li> Pour 48 h, 72 h et 96 h plaques, laver les cellules avec 1x DPBS et ajouter 50 médias ul dans les puits après 24 heures d&#39;incubation avec des nanoparticules. Incuber les cellules pendant les périodes restantes. </li><li> 4.2.5) Mesurer la viabilité cellulaire à des points de temps particuliers comme expliqué en 4.2.1 et 4.2.2. </li><li> Recommencer l&#39;expérience complète de 3 fois (n = 3) </li></ol></li></ol> 5. Mesure de la viabilité cellulaire Après PDT <ol><li> Le comptage des cellules et la mise en culture dans des plaques à 96 puits. <ol><li> Étiqueter un ensemble de 9Plaques de 6 puits comme indiqué dans le tableau 3, à la fois pour les plaques TE 71 + A549 et OVCAR3 + MDA-MB-231 plaques. La disposition des plaques sera le même, comme indiqué dans 4.1.3. </li><li> Ensemencer les plaques à 96 puits comme expliqué dans la section 4.1 avec la même disposition, comme indiqué dans le tableau 2 dans la section 4.1.2. </li><li> Après 24 h ajouter des nanoparticules pour les plaques comme expliqué dans la section 4.1.4. </li><li> 24 h après l&#39;addition de nanoparticules laver les cellules avec du DPBS 1x et ajouter 50 ul de HBSS à chaque puits. </li><li> Irradier les plaques avec les doses de lumière respectifs, comme expliqué au paragraphe 3.2.3. </li><li> Remplacer la HBSS avec 50 ul du milieu DMEM supplémenté avec 10% de FBS et on incube les plaques pendant les périodes de temps respectives après la PDT. </li><li> Après chaque période de temps de mesurer la viabilité cellulaire comme expliqué en 4.2.1 et 4.2.2. </li></ol></li></ol> 6. microscopie à fluorescence <ol><li> L&#39;absorption de nanoparticules <ol><li> Allumer les lampes du microscope une le laser 30 min avant l&#39;imagerie. Mettez la boîte de Pétri contenant les cellules fixes (comme expliqué dans la section 3.1) sur la scène du microscope. </li><li> Recueillir la fluorescence de nanoparticules et DAPI en utilisant des filtres comme indiqué dans le tableau 4. Superposez le contraste de phase, nanoparticules et images DAPI dans le logiciel ImageJ. </li></ol></li><li> Détection de ROS <ol><li> Allumer les lampes du microscope 30 minutes avant l&#39;imagerie. Mettez la boîte de Pétri contenant les cellules (comme expliqué dans la section 3.2) sur la scène du microscope. </li><li> Recueillir la fluorescence de nanoparticules, DAPI et le réactif de détection ROS en utilisant des filtres comme indiqué au tableau 4. Superposer le contraste de phase, nanoparticule, DAPI et les images ROS de réactif de détection dans le logiciel ImageJ. </li></ol></li><li> Apoptose et la nécrose par PI et l&#39;annexine V FITC <ol><li> Allumer les lampes du microscope 30 minutes avant l&#39;imagerie. Mettez la boîte de Pétri contenant les cellules (comme expliqué danssection 3.3) sur la scène du microscope. </li><li> Recueillir la fluorescence de nanoparticules, DAPI, PI, et Annexin V FITC en utilisant des filtres comme indiqué dans le tableau 4. Superposez le contraste de phase, nanoparticule, DAPI, PI et les images Annexin V FITC dans le logiciel ImageJ. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Pour atteindre nanoparticule absorption, il était nécessaire de maintenir certaines mesures critiques tout en fabrication des nanoparticules. Une solution IM 10 -6 MEH-PPV (mélangé avec 50% en poids PCBM) dans du THF a été préparé pour l&#39;injection dans de l&#39;eau DI, comme il a été observé que la concentration de cette solution joue un rôle important dans la détermination de la taille des nanoparticules est formée. La concentration a été vérifiée par spectroscopie UV-vis. Notez que dan...

En thérapie photodynamique (PDT) photosensibilisants sont administrés à un tissu cible, et lors de l&#39;exposition à la lumière du photosensibilisant génère Reactive Oxygen Species (ROS). ROS espèces tels que l&#39;oxygène singlet et superoxyde peuvent induire un stress oxydatif et les dommages structurels à la suite de cellules et de tissus 1-4. En raison de sa facilité d&#39;application de cette méthode a été activement étudiée et des essais cliniques ont eu lieu de 5,6. Cependant, des problèmes importants tels que la toxicité dans l&#39;obscurité des sensibilisateurs, la sensibilité du patient à la lumière (en raison de la distribution non-sélective de l&#39;agent de sensibilisation), et le caractère hydrophobe des sensibilisateurs (ce qui conduit à une biodisponibilité réduite et le potentiel de toxicité aiguë) restent. Nous rapportons ici un procédé pour la fabrication et l&#39;évaluation in vitro de la conduite nanoparticules de polymère mélangé avec les photosensibilisateurs fullerène en tant que nouvelle génération de PDT. Les nanoparticules sont formées par auto-agrégation desle polymère semi-conductrice MEH-PPV (poly [2-méthoxy-5- (2-éthylhexyloxy) -1,4-phénylènevinylène]) avec le PCBM de fullerène (C 61 phényl-butyrique ester méthylique d&#39;acide) lorsque ces matériaux dissous dans un compatible solvant sont rapidement injectés dans un solvant non compatible (figure 1A). Le choix de MEH-PPV que le polymère hôte est motivé par son coefficient d&#39;extinction élevé qui conduit à des taux élevés de formation de triplet, et à la fois la charge et le transfert d&#39;énergie efficace et ultrarapide pour le fullerène PCBM 7. Ces propriétés sont idéales pour la sensibilisation de l&#39;oxygène singulet et la formation de superoxyde dans la PDT. Fullerène a en fait été appliquée dans la PDT dans la forme moléculaire et nanoparticule 8-13. Cependant, la cytotoxicité sévère a entravé le développement 12. Ici, nous montrons que l&#39;encapsulation du fullerène dans une matrice hôte de MEH-PPV donné composites nanoparticules MEH-PPV / PCBM résultats dans un matériau sensibiliser PDT que jeest pas cytotoxique intrinsèque, montre spécificité envers les cellules cancéreuses en raison de la taille des nanoparticules et de la charge de surface, et les rendements de traitement PDT très efficace à des doses de faible luminosité due aux propriétés photophysiques susmentionnés.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene] (MEH-PPV)</td>
			<td>Sigma Aidrich</td>
			<td>536512-1G</td>
			<td>average Mn&#160;150,000-250,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[6,6]-Phenyl C61&#160;butyric acid methyl ester (PCBM)</td>
			<td>Sigma Aidrich</td>
			<td>684449-500MG</td>
			<td>&#62; 99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran (THF)</td>
			<td>EMD</td>
			<td>TX0284-6</td>
			<td>Drisolv</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>National Scientific Company</td>
			<td>37510-1</td>
			<td>For filtration of MEH-PPV solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-495</td>
			<td>25 mm, 0.2 &#181;m, PTFE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81320</td>
			<td>For injection of MEH-PPV solution into water to make nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium/Ham&#39;s F-12 50/50 Mix (DMEM)</td>
			<td>Corning (VWR)</td>
			<td>45000-350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution without phenol red (HBSS)</td>
			<td>Quality Biological (VWR)</td>
			<td>10128-740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium (DPBS)</td>
			<td>Corning (VWR)</td>
			<td>45000-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) (FBS)</td>
			<td>Corning (VWR)</td>
			<td>45000-736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 1X 0.25%</td>
			<td>Corning (VWR)</td>
			<td>45000-664</td>
			<td>Trypsin/2.21 mM EDTA in HBSS without sodium bicarbonate, calcium and magnesium Porcine Parvovirus Tested</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td>15710</td>
			<td>16% paraformaldehyde is diluted to 4% by adding PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>&#160;Biotium VWR</td>
			<td>89139-054</td>
			<td>Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 culture flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-856</td>
			<td>for culturing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-771</td>
			<td>for MTT assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dishes with Vents</td>
			<td>Greiner Bio-One (VWR)</td>
			<td>82050-538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V FITC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A13199</td>
			<td>dye for apoptosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celltiter 96 non-R 1000 assays</td>
			<td>Promega (VWR)</td>
			<td><a href="https://www.vwrsp.com/catalog/product/index.cgi?catalog_number=PAG4000">PAG4000</a></td>
			<td>MTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellROX Green Reagent, for oxidative stress detection</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10444</td>
			<td>For ROS detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-vis spectrometer</td>
			<td>Agilent 8453</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrometer</td>
			<td>NanoLog HoribaJobin Yvon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic light scattering</td>
			<td>PD2000DLS, Precision detector</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>NuAir DH Autoflow</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss Axioskop2</td>
			<td></td>
			<td>63X oil immersion objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epiluminescence microscope</td>
			<td>Olympus IX71</td>
			<td></td>
			<td>60X water immersion objective lens, Andor Zyla sCMOS camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solar Simulator</td>
			<td>Newport 67005 Oriel Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reference solar cell</td>
			<td>Oriel&#160;</td>
			<td></td>
			<td>VLSI Standards Incorporated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek Ex808</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific Partnership</td>
			<td>3200</td>
			<td>For counting cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photodynamic therapy with blended conducting polymer/fullerene nanoparticle photosensitizers

In this article a method for the fabrication and reproducible in-vitro evaluation of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene as the next generation photosensitizers for Photodynamic Therapy (PDT) is reported. The nanoparticles are formed by hydrophobic interaction of the semiconducting polymer MEH-PPV (poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene]) with the fullerene PCBM (phenyl-C61-butyric acid methyl ester) in the presence of a non-compatible solvent. MEH-PPV has a high extinction coefficient that leads to high rates of triplet formation, and efficient charge and energy transfer to the fullerene PCBM. The latter processes enhance the efficiency of the PDT system through fullerene assisted triplet and radical formation, and ultrafast deactivation of MEH-PPV excited stated. The results reported here show that this nanoparticle PDT sensitizing system is highly effective and shows unexpected specificity to cancer cell lines.

L&#39;absorption et la cytotoxicité intrinsèque de nanoparticules Les 50% en poids de nanoparticules mélangées MEH-PPV / PCBM ont été incubées avec TE 71, MDA-MB-231, A549 et des lignées cellulaires OVCAR3. Le niveau PCBM de mélange a été choisi comme 50% PCBM, qui a été montré pour fournir des propriétés de charge et de transfert d&#39;énergie idéale entre les polymères et les fullerènes 14 conjugués. Images de fluorescence de nanoparticules absorption sont p...

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Photodynamic Therapy with Blended Conducting Polymer/Fullerene Nanoparticle Photosensitizers

This protocol describes a method for the fabrication of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene. These nanoparticles were investigated for their potential use as a next generation photosensitizers for Photodynamic Therapy (PDT).

La thérapie photodynamique avec Blended polymère conducteur / Fullerene nanoparticules photosensibilisants

In this article a method for the fabrication and reproducible in-vitro evaluation of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene as the next ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

8.4K vues.  University of Central Florida. This protocol describes a method for the fabrication of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene. These nanoparticles were investigated for their potential use as a next generation photosensitizers for Photodynamic Therapy (PDT). 

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Conducting Miller-Urey Experiments

In 1953, Stanley Miller reported the production of biomolecules from simple gaseous starting materials, using an apparatus constructed to simulate the primordial Earth&#39;s atmosphere-ocean system. Miller introduced 200 ml of water, 100 mmHg of H2, 200 mmHg of CH4, and 200 mmHg of NH3 into the apparatus, then subjected this mixture, under reflux, to an electric discharge for a week, while the water was simultaneously heated. The purpose of this manuscript is to provide the reader with a general experimental protocol that can be used to conduct a Miller-Urey type spark discharge experiment, using a simplified 3 L reaction flask. Since the experiment involves exposing inflammable gases to a high voltage electric discharge, it is worth highlighting important steps that reduce the risk of explosion. The general procedures described in this work can be extrapolated to design and conduct a wide variety of electric discharge experiments simulating primitive planetary environments.

The Miller-Urey experiment was a pioneering study regarding the abiotic synthesis of organic compounds with possible relevance to the origins of life. Simple gases were introduced into a glass apparatus and subjected to an electric discharge, simulating the effects of lightning in the primordial Earth&#8217;s atmosphere-ocean system. The experiment was conducted for one week, after which, the samples collected from it were analyzed for the chemical building blocks of life.

Mener des expériences de Miller-Urey

In 1953, Stanley Miller reported the production of biomolecules from simple gaseous starting materials, using an apparatus constructed to simulate the ...

Recherche

Chimie

A Technique to Functionalize and Self-assemble Macroscopic Nanoparticle-ligand Monolayer Films onto Template-free Substrates

This protocol describes a self-assembly technique to create macroscopic monolayer films composed of ligand-coated nanoparticles1,2. The simple, robust and scalable technique efficiently functionalizes metallic nanoparticles with thiol-ligands in a miscible water/organic solvent mixture allowing for rapid grafting of thiol groups onto the gold nanoparticle surface. The hydrophobic ligands on the nanoparticles then quickly phase separate the nanoparticles from the aqueous based suspension and confine them to the air-fluid interface. This drives the ligand-capped nanoparticles to form monolayer domains at the air-fluid interface.&#160; The use of water-miscible organic solvents is important as it enables the transport of the nanoparticles from the interface onto template-free substrates.&#160; The flow is mediated by a surface tension gradient3,4 and creates macroscopic, high-density, monolayer nanoparticle-ligand films.&#160; This self-assembly technique may be generalized to include the use of particles of different compositions, size, and shape and may lead to an efficient assembly method to produce low-cost, macroscopic, high-density, monolayer nanoparticle films for wide-spread applications.

A simple, robust and scalable technique to functionalize and self-assemble macroscopic nanoparticle-ligand monolayer films onto template-free substrates is described in this protocol.

Une technique pour fonctionnaliser et auto-assemblage de nanoparticules macroscopiques-ligand monocouches Films sur substrats libre-modèle

This protocol describes a self-assembly technique to create macroscopic monolayer films composed of ligand-coated nanoparticles1,2. The simple, robust and ...

Synthesis and Testing of Supported Pt-Cu Solid Solution Nanoparticle Catalysts for Propane Dehydrogenation

A convenient method for the synthesis of bimetallic Pt-Cu catalysts and performance tests for propane dehydrogenation and characterization are demonstrated here. The catalyst forms a substitutional solid solution structure, with a small and uniform particle size around 2 nm. This is realized by careful control over the impregnation, calcination, and reduction steps during catalyst preparation and is identified by advanced in situ synchrotron techniques. The catalyst propane dehydrogenation performance continuously improves with increasing Cu:Pt atomic ratio.

A convenient method for the synthesis of 2 nm supported bimetallic nanoparticle Pt-Cu catalysts for propane dehydrogenation is reported here. In situ synchrotron X-ray techniques allow for the determination of the catalyst structure, which is typically unobtainable using laboratory instruments.

Synthèse et test de la solution solide supportée Pt-Cu Catalyseurs de nanoparticules pour la déshydrogénation au propane

A convenient method for the synthesis of bimetallic Pt-Cu catalysts and performance tests for propane dehydrogenation and characterization are ...

Liquid-cell Transmission Electron Microscopy for Tracking Self-assembly of Nanoparticles

Drying a nanoparticle dispersion is a versatile way to create self-assembled structures of nanoparticles, but the mechanism of this process is not fully understood. We have traced the trajectories of individual nanoparticles using liquid-cell transmission electron microscopy (TEM) to investigate the mechanism of the assembly process. Herein, we present the protocols used for liquid-cell TEM studies of the self-assembly mechanism. First, we introduce the detailed synthetic protocols used to produce uniformly sized platinum and lead selenide nanoparticles. Next, we present the microfabrication processes used to produce liquid cells with silicon nitride or silicon windows and then describe the loading and imaging procedures of the liquid-cell TEM technique. Several notes are included to provide helpful tips for the entire process, including how to manage the fragile cell windows. The individual motions of nanoparticles tracked by liquid-cell TEM revealed that changes in the solvent boundaries caused by evaporation affected the self-assembly process of nanoparticles. The solvent boundaries drove nanoparticles to primarily form amorphous aggregates, followed by flattening of the aggregates to produce a 2-dimensional (2D) self-assembled structure. These behaviors are also observed for different nanoparticle types and different liquid-cell compositions.

Here we introduce experimental protocols for the real-time observation of a self-assembly process using liquid-cell transmission electron microscopy.

Microscopie électronique à Transmission liquide-cellule suivi auto-assemblage des nanoparticules

Drying a nanoparticle dispersion is a versatile way to create self-assembled structures of nanoparticles, but the mechanism of this process is not fully ...

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity and convenient colorimetric readout. However, high densities of nanoparticles are typically needed for detection. The available synthesis-based enhancement protocols are either limited to gold and silver nanoparticles or rely on precise enzymatic control and optimization. Here, we present a protocol to enhance the colorimetric readout of gold, silver, silica, and iron oxide nanoprobes. It was observed that the colorimetric signal can be improved by up to a 10000-fold factor. The basis for such signal enhancement strategies is the chemical reduction of Au3+ to Au0. There are several chemical reactions that enable the reduction of Au3+ to Au0. In the protocol, Good&#39;s buffers and H2O2 are used and it is possible to favor the deposition of Au0 onto the surface of existing nanoprobes, in detriment of the formation of new gold nanoparticles. The protocol consists of the incubation of the microarray with a solution consisting of chloroauric acid and H2O2 in 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid pH 6 buffer following the nanoprobe-based detection assay. The enhancement solution can be applied to paper and glass-based sensors. Moreover, it can be used in commercially available immunoassays as demonstrated by the application of the method to a commercial allergen microarray. The signal development requires less than 5 min of incubation with the enhancement solution and the readout can be assessed by naked eye or low-end image acquisition devices such as a table-top scanner or a digital camera.

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

In this work, a protocol for signal enhancement of nanoprobe-based biosensing is presented. The protocol is based on the reduction of chloroauric acid onto the surface of existing nanoprobes that consist of gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles.

Signal Nanoprobe rapide amélioration de la synthèse de nanoparticules or In Situ

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity ...

Methionine Functionalized Biocompatible Block Copolymers for Targeted Plasmid DNA Delivery

Reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization integrates the advantages of radical polymerization and living polymerization. This work presents the preparation of methionine functionalized biocompatible block copolymers via RAFT polymerization. Firstly, N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide-b-N-(3-aminopropyl)methacrylamide (BNHEMA-b-APMA, BA) was synthesized via RAFT polymerization using 4,4&#8217;-azobis(4-cyanovaleric acid) (ACVA) as an initiating agent and 4-cyanopentanoic acid dithiobenzoate (CTP) as the chain transfer agent. Subsequently, N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide-b-N-(3-guanidinopropyl)methacrylamide (methionine grafted BNHEMA-b-GPMA, mBG) was prepared by modifying amine groups in APMA with methionine and guanidine groups. Three kinds of block polymers, mBG1, mBG2, and mBG3, were synthesized for comparison. A ninhydrin reaction was used to quantify the APMA content; mBG1, mBG2, and mBG3 had 21%, 37%, and 52% of APMA, respectively. Gel permeation chromatography (GPC) results showed that BA copolymers possess molecular weights of 16,200 (BA1), 20,900(BA2), and 27,200(BA3) g/mol. The plasmid DNA (pDNA) complexing ability of the obtained block copolymer gene carriers was also investigated. The charge ratios (N/P) were 8, 16, and 4 when pDNA was complexed completely with mBG1, mBG2, mBG3, respectively. When the N/P ratio of mBG/pDNA polyplexes was higher than 1, the Zeta potential of mBG was positive. At an N/P ratio between 16 and 32, the average particle size of mBG/pDNA polyplexes was between 100-200 nm. Overall, this work illustrates a simple and convenient protocol for the block copolymer carrier synthesis.

This work presents the preparation of methionine functionalized biocompatible block copolymers (mBG) via the reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) method. The plasmid DNA complexing ability of the obtained mBG and their transfection efficiency were also investigated. The RAFT method is very beneficial for polymerizing monomers containing special functional groups.

Copolymères de bloc biocompatibles biocompatibles de methionine pour la livraison ciblée de Plasmid d'ADN

Reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization integrates the advantages of radical polymerization and living polymerization. This ...

Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in physiological fluids induce denaturation and degradation of self-assembled DNA nanostructures. In non-viral gene delivery, enzymatic degradation of DNA is overcome by the encapsulation of the negatively charged DNA in a cationic shell. Herein, inspired by gene delivery advancements, a simple, one-step and robust methodology is presented for the stabilization of DNA origami nanostructures by coating them with chitosan and linear polyethyleneimine. The polycation coating efficiently protects DNA origami nanostructures in Mg-depleted and nuclease-rich media. This method also preserves the full addressability of enzyme- and aptamer-based functionalization of DNA nanostructures.

Here, a protocol for the protection of DNA origami nanostructures in Mg-depleted and nuclease-rich media using natural cationic polysaccharide chitosan and synthetic linear polyethyleneimine (LPEI) coatings is presented.

Thérapie génique inspiré Polycation enduit pour la Protection de l’ADN Origami Nanostructures

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in ...

Gold Nanoparticle Modified Carbon Fiber Microelectrodes for Enhanced Neurochemical Detection

For over 30 years, carbon-fiber microelectrodes (CFMEs) have been the standard for neurotransmitter detection. Generally, carbon fibers are aspirated into glass capillaries, pulled to a fine taper, and then sealed using an epoxy to create electrode materials that are used for fast scan cyclic voltammetry testing. The use of bare CFMEs has several limitations, though. First and foremost, the carbon fiber contains mostly basal plane carbon, which has a relatively low surface area and yields lower sensitivities than other nanomaterials. Furthermore, the graphitic carbon is limited by its temporal resolution, and its relatively low conductivity. Lastly, neurochemicals and macromolecules have been known to foul at the surface of carbon electrodes where they form non-conductive polymers that block further neurotransmitter adsorption. For this study, we modify CFMEs with gold nanoparticles to enhance neurochemical testing with fast scan cyclic voltammetry. Au3+ was electrodeposited or dipcoated from a colloidal solution onto the surface of CFMEs. Since gold is a stable and relatively inert metal, it is an ideal electrode material for analytical measurements of neurochemicals. Gold nanoparticle modified (AuNP-CFMEs) had a stability to dopamine response for over 4 h. Moreover, AuNP-CFMEs exhibit an increased sensitivity (higher peak oxidative current of the cyclic voltammograms) and faster electron transfer kinetics (lower &#916;EP or peak separation) than bare unmodified CFMEs. The development of AuNP-CFMEs provides the creation of novel electrochemical sensors for detecting fast changes in dopamine concentration and other neurochemicals at lower limits of detection. This work has vast applications for the enhancement of neurochemical measurements. The generation of gold nanoparticle modified CFMEs will be vitally important for the development of novel electrode sensors to detect neurotransmitters in vivo in rodent and other models to study neurochemical effects of drug abuse, depression, stroke, ischemia, and other behavioral and disease states.

In this study, we modify carbon-fiber microelectrodes with gold nanoparticles to enhance the sensitivity of neurotransmitter detection.

Microélectrodes de fibres de carbone modifiées par nanoparticules d'or pour une détection neurochimique améliorée

For over 30 years, carbon-fiber microelectrodes (CFMEs) have been the standard for neurotransmitter detection. Generally, carbon fibers are aspirated into ...

Nanoparticle Tracking Analysis of Gold Nanoparticles in Aqueous Media through an Inter-Laboratory Comparison

In the field of nanotechnology, analytical characterization plays a vital role in understanding the behavior and toxicity of nanomaterials (NMs). Characterization needs to be thorough and the technique chosen should be well-suited to the property to be determined, the material being analyzed and the medium in which it is present. Furthermore, the instrument operation and methodology need to be well-developed and clearly understood by the user to avoid data collection errors. Any discrepancies in the applied method or procedure can lead to differences and poor reproducibility of obtained data. This paper aims to clarify the method to measure the hydrodynamic diameter of gold nanoparticles by means of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). This study was carried out as an inter-laboratory comparison (ILC) amongst seven different laboratories to validate the standard operating procedure&#8217;s performance and reproducibility. The results obtained from this ILC study reveal the importance and benefits of detailed standard operating procedures (SOPs), best practice updates, user knowledge, and measurement automation.

The protocol described here aims to measure the hydrodynamic diameter of spherical nanoparticles, more specifically gold nanoparticles, in aqueous media by means of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). The latter involves tracking the movement of particles due to Brownian motion and implementing the Stokes-Einstein equation to obtain the hydrodynamic diameter.

Analyse du suivi des nanoparticules d’or dans les médias aqueux par le biais d’une comparaison inter-laboratoire

In the field of nanotechnology, analytical characterization plays a vital role in understanding the behavior and toxicity of nanomaterials (NMs). ...

Gold Nanoparticle Synthesis

Gold nanoparticles (Au nanoparticles) that are ~12 nm in diameter were synthesized by rapidly injecting a solution of 150 mg (0.15 mmol) of tetrachloroauric acid in 3.0 g (3.7 mmol, 3.6 mL) of oleylamine (technical grade) and 3.0 mL of toluene into a boiling solution of 5.1 g (6.4 mmol, 8.7 mL) of oleylamine in 147 mL of toluene. While boiling and mixing the reaction solution for 2 hours, the color of the reaction mixture changed from clear, to light yellow, to light pink, and then slowly to dark red. The heat was then turned off, and the solution was allowed to gradually cool down to room temperature for 1 hour. The gold nanoparticles were then collected and separated from the solution using a centrifuge and washed three times; by vortexing and dispersing the gold nanoparticles in 10 mL portions of toluene, and then precipitating the gold nanoparticles by adding 40 mL portions of methanol and spinning them in a centrifuge. The solution was then decanted to remove any remaining byproducts and unreacted starting materials. Drying the gold nanoparticles in a vacuum environment produced a solid black pellet; which could be stored for long periods of time (up to one year) for later use, and then redissolved in organic solvents such as toluene.

A protocol for synthesizing ~12 nm diameter gold nanoparticles (Au nanoparticles) in an organic solvent is presented. The gold nanoparticles are capped with oleylamine ligands to prevent agglomeration. The gold nanoparticles are soluble in organic solvents such as toluene.