Cette étude est un système simple, polyvalent et facile pour examiner différents effets photodynamiques sur divers micro-organismes et cellules. Dans ce système, la LED peut être ajustée dans différents arrangements en fonction de la conception de l’expérience. Différentes conditions de PDT peuvent être calculées dans une plaque de 96 puits ou même une plaque de 384 puits dans une expérience.
Cette technique peut être utilisée pour traiter la kératite fongique à cause de laquelle, dans le monde, environ 150 000 personnes perdent leurs yeux malgré des traitements intensifs. Pour commencer, coupez quatre LED vertes dans une bande de LED et alignez-les avec trois puits d’une plaque de 96 puits. Mesurez le taux de fluence de la LED à 540 nanomètres avec un capteur de puissance lumineuse.
Maintenez une température constante à 25 degrés Celsius avec un ventilateur électrique qui a été assemblé le long de la plaque pendant l’irradiation. Avec une boucle stérile, choisissez une seule colonie de Candida albicans dans une plaque de gélose et ajoutez-la à un tube de verre stérilisé contenant trois millilitres de milieu YPD. Incuber le tube à 25 degrés Celsius à une vitesse de rotation de 155 tr / min pendant 14 à 16 heures pour faire pousser la culture de levure.
Ensuite, diluez la culture de nuit avec un milieu YPD à une valeur OD 600 de 0,5. Incuber à 30 degrés Celsius avec rotation à 155 tr / min pendant quatre heures pour atteindre la phase de croissance logarithmique. Répéter la dilution de la culture en phase logarithmique avec un milieu YPD frais à une valeur OD 600 de 0,65, pour obtenir environ une fois 10 à la septième colonie formant des unités par millilitre.
Préparez simultanément une solution mère de bengale rose à 4% dans 1X PBS. Filtrer stériliser avec un filtre de 0,22 micromètre. Ajouter 111 microlitres de solution de bengale rose à 2% à un millilitre de culture en phase logarithmique, et co-cultiver à différents points temporels à température ambiante pour comprendre l’absorption de RB dans les cellules.
Centrifuger à 16, 100 fois G pendant 2 1/2 minutes à température ambiante, et laver la co-culture trois fois avec un millilitre de 1X PBS. Après le lavage, remettez en suspension la culture de Candida albicans dans un millilitre de 1X PBS. Pour chaque condition, répartissez la culture dans trois puits différents dans une plaque de 96 puits.
Alignez les puits avec le réseau de LED. Dans les groupes exposés à la lumière, allumez le ventilateur électrique et la lumière. Après irradiation, effectuez des dilutions en série décuplées deux fois en prenant 20 microlitres de la solution de co-culture d’un puits et en l’ajoutant à un tube contenant 180 microlitres de 1X PBS.
Ensuite, déposez 20 microlitres de chaque dilution en série dans un quadrant d’une plaque de gélose YPD pour obtenir des colonies dénombrables sur la plaque. La microscopie fluorescente a montré une coloration immédiate de Candida albicans avec du bengale rose sous fluorescence rouge. Après 15 minutes d’incubation, la plupart des cellules ont été colorées avec du bengale rose, ce qui indique qu’il pénètre dans les cellules de manière dépendante du temps.
En outre, l’activation du bengale rose avec la lumière génère des radicaux libres et de l’oxygène singulet dans les cellules, entraînant la mort cellulaire. En l’absence de bengale rose ou d’irradiation, aucune mort cellulaire n’a été observée. Candida albicans a été inhibé après irradiation à la lumière verte en présence de 0,2% de bengale rose d’une manière légèrement dose-dépendante.
Il est important que la plaque de 96 puits soit d’abord alignée avec le centre de la LED. Deuxièmement, la plaque de gélose utilisée doit être soigneusement séchée pour éviter le mélange de colonies séparées. Les Candida albicans qui ont grandi sur la plaque peuvent être envoyés pour une analyse génétique, ce qui peut répondre à la façon dont la PDT affecte l’expression génique des cellules.
Ces techniques ouvrent la voie à l’examen du fonctionnement de la PDT sur différents types de cellules, qu’il s’agisse de cellules cancéreuses, de bactéries, de champignons ou de virus avec une plate-forme facile, peu coûteuse et polyvalente.
