This work was funded by both the&#160;Canadian Institutes of Health Research&#160;and&#160;Natural Sciences and the Engineering Research Council of Canada. M. Bisaillon is a Chercheur Boursier Senior from the Fonds de Recherche en Sant&#233; du Qu&#233;bec and also a member of the Centre de Recherche Clinique du Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke. We thank Dr. Ralf Bartenschlager for the generous gift of the HCV replicon system. We also thank Dr. Charles Rice and Dr. Daniel Lamarre for kindly providing the hepatic cell line. We also want to thank Guillaume Tremblay for technical assistance.

1. Les cellules élaboration et au traitement <ol><li> Dans une plaque de 24 puits, mettre un couvercle de verre au fond des puits. Laver chaque puits avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). </li><li> Semences Huh-7 cellules de soutien réplicon sub-génomique du VHC dans chaque puits à une densité de 5 x 10 4 cellules / puits. En l&#39;absence de traitement à faire, les cellules peuvent être ensemencées à une densité plus élevée. Le milieu de culture est du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de Foetal Bovine Serum (FBS), 2 mM de L-glutamine, du pyruvate de sodium 1 mM et 250 mg / ml de G-418 (pour maintenir le réplicon). </li><li> Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2. Le lendemain, traiter les cellules avec 3 uM de hLF purifiée à partir de lait maternel humain. </li></ol> 2. Paraformaldéhyde / Préparation saccharose (12% PAF et 12% de saccharose) <ol><li> Mettre 500 ml de PBS dans un bêcher et chauffer entre 20 ° C et 30 ° C. Dissoudre 60 g de saccharose dans le PBS. Dissoudre 60 g de Paraformalhyde (PAF) dans le / solution de saccharose PBS. Ajouter lentement NaOH 2N (3 à 7 ml) jusqu&#39;à ce qu&#39;une solution claire est obtenue. </li><li> Ajuster le pH à 7,4 avec HCl. Complète le volume à 500 ml avec du PBS. Filtrez par gravité sur filtre Whatman. Avant l&#39;emploi, diluer la solution avec du PBS à une concentration finale de 4% et de PAF 4% de saccharose (de stockage 4 ° C pendant 1 semaines maximum). </li></ol> 3. immunofluorescence <ol><li> Au moment voulu (0 h, 2 h ou 24 h de traitement), laver deux fois les cellules (1 min) avec du PBS et on fixe avec du PBS / 4% PAF / 4% de saccharose pendant 20 min à température ambiante. Les cellules sont généralement à 30-40% de confluence et de 1,5x10 5 cellules sont utilisées. </li><li> Perméabiliser les cellules avec 0,15% de Triton X-100 dans du PBS pendant 5 min à température ambiante et le bloc de 10% de sérum de chèvre normal (NGS) dans du PBS pendant 20 min. </li><li> Diluer l&#39;anticorps primaire de la protéine d&#39;intérêt dans 10% de NGS (exemple: souris anti-anticorps primaire hLF dilué à 1: 1000). Appliquer l&#39;anticorps primaire pour les cellules. </li><li> Après 4 heures à température ambiante ou O /N à 4 ° C, laver les cellules trois fois pendant 5 min avec 10% de NGS. Colorer les cellules avec un anticorps secondaire marqué avec un fluorochrome dilué dans 10% de NGS (exemple: fluorochrome avec la longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 488 nm lié à un anticorps anti-souris 1: 1000) pendant 1 heure à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver les cellules une fois pendant 5 min avec du PBS et colorer les cellules avec 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (1 ug / ml) pendant 15 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver les cellules deux fois pendant 5 min avec du PBS. Placer le couvercle sur les verres SlowFade milieu de montage avant la visualisation au microscope. Les cellules sont maintenant prêts pour l&#39;analyse par épifluorescence ou microscopie confocale. </li><li> Utiliser différentes commandes pour assurer la spécificité de la détection. Par exemple, tous les anticorps peuvent être omis dans le but de détecter autofluorescence. L&#39;anticorps primaire peut être omis afin de déterminer la coloration non spécifique par l&#39;anticorps secondaire. Enfin, si possible, contrôle de cellules ou de tissus qui ne sont pasexprimer la molécule d&#39;intérêt peut également être utilisé. </li><li> Visualisez les échantillons en utilisant un microscope à fluorescence appropriée (à épifluorescence ou confocale) et jeux de filtres appropriés pour le marqueur fluorescent utilisé. Diapositives peut également être stocké dans une boîte de diapositives à &lt;-20 ° C pour un examen ultérieur. </li></ol> 4. microscopie à fluorescence <ol><li> Conserver les échantillons dans l&#39;obscurité pour éviter photoblanchiment. Allumez la source de lumière du microscope choisi (épifluorescence ou confocale). </li><li> Allumez le microscope. Allumez l&#39;appareil photo pour le microscope. Mettez la lame sur le microscope pour la visualisation. Ajouter de l&#39;huile d&#39;immersion sur le tiroir pour augmenter l&#39;ouverture numérique de la lentille d&#39;objectif. </li><li> Sélectionnez les filtres appropriés. Ajuster le focus et l&#39;objectif approprié. Ajustez les volets afin de détecter le fluorochrome approprié, mais éviter photoblanchiment. Gardez plafonniers hors de minimiser fond clair quand on regarde l&#39;échantillon. </li><li> Changer efiltres électroniques de visualiser différents fluorochromes (par exemple DAPI et pour une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 488 nm). Prenez des photos avec l&#39;appareil photo. </li></ol>

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	<li>Odell, I. D., Cook, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+techniques.">Immunofluorescence techniques.</a> J Invest Derm. 133 (1), e4 (2013).</li><li>Portugal, J., Waring, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignment+of+DNA+binding+sites+for+4&#8217;,6-diamidine-2-phenylindole+and+bisbenzimide+(Hoechst+33258).+A+comparative+footprinting+study.">Assignment of DNA binding sites for 4&#8217;,6-diamidine-2-phenylindole and bisbenzimide (Hoechst 33258). A comparative footprinting study.</a> Biochim Biophys Acta. 949 (2), 158-168 (1988).</li><li>Lichtman, J. W., Conchello, J. -. A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Nat Methods. 2 (12), 910-919 (2005).</li><li>St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy:+comparisons,+applications,+and+problems.">Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems.</a> BioTechniques. 39, S2-S5 (2005).</li><li>Yi, M., Kaneko, S., Yu, D. Y., Murakami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+envelope+proteins+bind+lactoferrin.">Hepatitis C virus envelope proteins bind lactoferrin.</a> Journal of virology. 71, 5997-6002 (1997).</li><li>Wakabayashi, H., Oda, H., Yamauchi, K., Abe, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactoferrin+for+prevention+of+common+viral+infections.">Lactoferrin for prevention of common viral infections.</a> J Inf Chem. 20 (11), 666-671 (2014).</li><li>Picard-Jean, F., Bouchard, S., Lariv&#233;e, G., Bisaillon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intracellular+inhibition+of+HCV+replication+represents+a+novel+mechanism+of+action+by+the+innate+immune+Lactoferrin+protein.">The intracellular inhibition of HCV replication represents a novel mechanism of action by the innate immune Lactoferrin protein.</a> Antiviral research. 111, 13-22 (2014).</li><li>Johnson, G. D., Davidson, R. S., McNamee, K. C., Russell, G., Goodwin, D., Holborow, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fading+of+immunofluorescence+during+microscopy:+a+study+of+the+phenomenon+and+its+remedy.">Fading of immunofluorescence during microscopy: a study of the phenomenon and its remedy.</a> J Immunol Methods. 55 (2), 231-242 (1982).</li><li>Green Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+protein:+a+perspective.">fluorescent protein: a perspective.</a> Protein Sci. 20 (9), 1509-1519 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

L&#39;épidémie de VHC demeure une menace mondiale, avec 80% des patients nouvellement infectés en développement une infection chronique, les mettant à risque de cirrhose, l&#39;insuffisance hépatique ou carcinome hépatocellulaire. Action directe des agents antiviraux ciblant la réplication du VHC et de la maturation représentent premiers agents anti-VHC, comme l&#39;a récemment démontré par l&#39;approbation réglementaire de deux inhibiteurs de la protéase NS3 extrémité N-terminale (bocéprévir et téla...

Immunofluorescence is a technique that uses a fluorescence microscope to visualize the distribution and/or localization of a target molecule in a biological sample. Immunofluorescence relies on the specificity of fluorescent-labelled antibodies against their corresponding antigens within a cell1. It is typically used on tissue sections and cultured cell lines in order to analyze the distribution/localization of various biological molecules such as proteins, nucleic acids and glycans. It should be noted that immunofluorescence is often used in combination with other non-antibody methods of fluorescent staining such as the 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) stains which are typically used to label DNA2. Moreover, this technique involves fixation of the cells which allows the analysis of cells at a specific time.
Different types of microscopes can be used to analyze immunofluorescence samples. The simplest is the epifluorescence microscope (Figure 1) for which excitation of the fluorochrome and detection of the fluorescence are done through the same light path3. Because most of the excitation light is transmitted through the sample, only reflected excitatory light can reach the objective together with the emitted light. This approach unfortunately leadsto a frequent high signal to noise ratio.In contrast, confocal microscopy (Figure 2) offers a distinct advantage for increasing optical resolution and contrast by means of adding a spatial pinhole placed at the confocal plane of the lens to eliminate out-of-focus light4. This approach allows the reconstruction of three-dimensional structures from the obtained images. However, since an important fraction of the light from the sample is blocked at the pinhole, long exposures are often required.
There are two classes of immunofluorescence techniques, primary (or direct) and secondary (or indirect). Direct immunofluorescence involves a primary antibody linked with a fluorochrome (Figure 3). This method is less frequently used because it provides lower signal, involves higher cost and less flexibility1. Moreover, such antibodies are generally harder to find commercially. On the other hand, the direct attachment of the fluorochrome to the antibody significantly reduces the number of steps in the procedure, saving time and frequently reducing non-specific background signal. This also limits the possibility of antibody cross-reactivty.
Indirect immunofluorescence involves a primary unlabelled antibody which is specific for the epitope of interest1. A secondary antibody which carries the fluorochrome then recognizes the primary antibody and binds to it (Figure 3). Although indirect immunofluorescence is more complex and time consuming than direct immunofluorescence, it is frequently used because of its high sensitivity and it also provides an amplified signal since more than one secondary antibody can attach to each primary antibody. In addition, a vast array of commercial secondary antibodies is available at affordable prices.
Hepatitis C virus (HCV) is a major public-health problem with 130-170 million individuals chronically infected worldwide. In order to halt the epidemic, therapy against HCV will need to be both effective and widely available. Studies focusing on safe and affordable natural product active against HCV have revealed the antiviral activity of the human Lactoferrin (hLF) protein which binds and neutralizes the circulating virion5. In the current study, investigation of hLF activity on the HCV subgenomic replicon system, which is independent from viral entry and shedding, revealed a distinct antireplicative activity of hLF against HCV. This manuscript presents a study in which immunofluorescence assays were performed to monitor the internalization of hLF, an important component of the immune system6, into hepatic cells. Moreover, we monitored the inhibitory potential of hLF on the intracellular replication of the Hepatitis C virus (HCV).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAF</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>PAR070.1</td>
			<td>Flammable solid, skin irritant, lungs and eyes.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-425-CL</td>
			<td>Without Ca2+ &#38; Mg2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>053-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488-labeled anti-mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 568-labeled anti-rabbit</td>
			<td>Invitrogeb</td>
			<td>A21069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat germ agglutinin Alexa Fluor 488 conjugate (WGA)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>W11261</td>
			<td>Potentially mutagenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NS5A rabbit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-hLF mouse</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab10110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst stain</td>
			<td>Life Techn.</td>
			<td>H1399</td>
			<td>Potentially&#160;mutagenic&#160;and&#160;carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hLF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse visible/epifluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epifluorescence/confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence to monitor the cellular uptake of human lactoferrin and its associated antiviral activity against the hepatitis c virus

L&#39;immunofluorescence est une technique de laboratoire couramment utilisés pour étudier de nombreux aspects de la biologie. Il est généralement utilisé pour visualiser la distribution et / ou la localisation d&#39;une molécule cible dans des cellules et des tissus. Immunofluorescence repose sur la spécificité des anticorps marqués par fluorescence contre leurs antigènes correspondants au sein d&#39;une cellule. Les deux approches directes et indirectes immunofluorescence peuvent être utilisés qui reposent sur l&#39;utilisation d&#39;anticorps liés à un fluorochrome. L&#39;immunofluorescence directe est moins fréquemment utilisé, car il fournit le signal inférieur, implique un coût plus élevé et moins de flexibilité. En revanche, l&#39;immunofluorescence indirecte est plus couramment utilisé en raison de sa haute sensibilité et fournit un signal amplifié depuis plus d&#39;un anticorps secondaire peut se rattacher à chaque anticorps primaire. Dans ce manuscrit, à la fois microscopie à épifluorescence et microscopie confocale ont été utilisés pour contrôler l&#39;internalisation de la lactoferrine humaine, un élément important de la réponse immunitairesystème, dans les cellules hépatiques. De plus, nous avons surveillé le potentiel d&#39;inhibition de la hLF sur la réplication intracellulaire du virus de l&#39;hépatite C par immunofluorescence. Aussi bien les avantages et les inconvénients associés à ces approches sont discutées.

La capacité de la lignée de cellules Huh-7 hépatique administrée de manière exogène à internaliser hLF a été surveillée en utilisant une immunofluorescence sur Miscroscope confocale. hLF a été ajouté au milieu de culture et l&#39;internalisation a été laissé pendant 24 heures, après quoi, la hLF extracellulaire a été lavée avec du PBS et la membrane résiduel lié hLF a été dégradé avec un traitement à la trypsine 5 min (1 ml). Les cellules ont été réensemencées et autorisés à ré-adhérer...

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Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.

Immunofluorescence de suivi de l&#39;absorption cellulaire de la lactoferrine humaine et de son activité associée antivirale contre le virus de l&#39;hépatite C

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

immunofluorescence-to-monitor-cellular-uptake-human-lactoferrin-its

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.2K vues.  Université de Sherbrooke. The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.