Ce travail est soutenu en partie des subventions du NIH R01 A1064826-01, U19-01 AI062627, NO1-HHSN26600500032C (à SM). Nous remercions nos membres de laboratoire à l&#39;aide de discussion et technique, Tina Heil pour l&#39;examen critique du manuscrit. Nous tenons à remercier David Bina, Milwaukee Département de la Santé Laboratoire de culture de virus et PCR.

<ol>
	<li>Hirst, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+agglutination+of+red+cells+by+allantoic+fluid+of+chick+embryos+infected+with+influenza+virus.">The agglutination of red cells by allantoic fluid of chick embryos infected with influenza virus.</a> Science. 94, 22-23 (1941).</li><li>Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+polymerase+chain+reaction+as+a+rapid+and+efficient+alternative+to+estimation+of+picornavirus+titers+by+tissue+culture+infectious+dose+50%+or+plaque+forming+units.">Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units.</a> Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).</li><li>Kalter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemagglutinating+Behavior+of+Mouse+and+Egg-adapted+Type+A+(PR8)+Influenza+Virus.">Hemagglutinating Behavior of Mouse and Egg-adapted Type A (PR8) Influenza Virus.</a> Science. 110, 184-184 (1949).</li><li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Plaques+in+Monolayer+Tissue+Cultures+by+Single+Particles+of+an+Animal+Virus.">Production of Plaques in Monolayer Tissue Cultures by Single Particles of an Animal Virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 38, 747-752 (1952).</li><li>Deyde, V. M., Nguyen, T., Bright, R. A., Balish, A., Shu, B., Lindstrom, S., Klimov, A. I., Gubareva, L. 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Immunol. 53, 149-154 (2009).</li><li>Rahman, M., Kieke, B. A., Vandermause, M. F., Mitchell, P. D., Greenlee, R. T., Belongia, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+Directigen+flu+A+B+enzyme+immunoassay+and+direct+fluorescent+assay+for+detection+of+influenza+infection+during+the+2004-2005+season.">Performance of Directigen flu A+B enzyme immunoassay and direct fluorescent assay for detection of influenza infection during the 2004-2005 season.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 58, 413-418 (2007).</li><li>Landry, M. L., Ferguson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suboptimal+detection+of+influenza+virus+in+adults+by+the+Directigen+Flu+A+B+enzyme+immunoassay+and+correlation+of+results+with+the+number+of+antigen-positive+cells+detected+by+cytospin+immunofluorescence.">Suboptimal detection of influenza virus in adults by the Directigen Flu A+B enzyme immunoassay and correlation of results with the number of antigen-positive cells detected by cytospin immunofluorescence.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 3407-3409 (2003).</li><li>Herrmann, B., Larsson, C., Zweygberg, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+typing+of+influenza+viruses+A+and+B+by+a+nested+reverse+transcription-PCR:+comparison+to+virus+isolation+and+antigen+detection+by+immunofluorescence+and+optical+immunoassay+(FLU+OIA).">Simultaneous detection and typing of influenza viruses A and B by a nested reverse transcription-PCR: comparison to virus isolation and antigen detection by immunofluorescence and optical immunoassay (FLU OIA).</a> J. Clin. Microbiol. 39, 134-138 (2001).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints.">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> Am. J. Epidemiol. 27, 493-497 (1938).</li><li>Doerr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+into+the+infrared.">Fluorescent proteins: into the infrared.</a> Nat. Meth. 6, 482-483 (2009).</li><li>Shu, B., Wu, K. H., Emery, S., Villanueva, J., Johnson, R., Guthrie, E., Berman, L., Warnes, C., Barnes, N., Klimov, A., Lindstrom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+performance+of+the+CDC+real-time+reverse+transcriptase+PCR+swine+flu+panel+for+detection+of+2009+A+(H1N1)+pandemic+influenza+virus.">Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 2614-2619 (2011).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

La flambée récente épidémie de la grippe aviaire en Asie du Sud et une peur globale de la pandémie de grippe porcine imposer préoccupations énormes pour la santé publique et de la sécurité. Mise au point critique a été consacrée à générer des vaccins pour les souches existantes et nouvelles du virus de la grippe. Disponibilité des rapides technologies à haut débit pour la détection précise et exacte des calculs titre viral va considérablement améliorer le traitement. Les techniques les plus couramment utilisées employées pour calculer titre du virus comprennent des essais de plaque d&#39;hémagglutination de formation et de la grippe. Le test de formation de plaques a d&#39;abord été élaboré pour estimer titres bactériophages et a été adopté par Renato Dulbecco pour calculer animales titres viraux 4. Pour effectuer ce test, 10 des dilutions du stock de la grippe ou des spécimens d&#39;animaux tels que le liquide de LBA sont préparés et aliquotes de 0,1 ml sont inoculés sur la monocouche de cellules MDCK en plaques 6 puits. Le virus est autorisé à s&#39;adsorber sur les cellules MDCK suivies par l&#39;annoncedition d&#39;un milieu nutritif et d&#39;agarose. Au cours de l&#39;incubation, les cellules d&#39;origine infectées libèrent descendance virale qui s&#39;est propagée uniquement aux cellules voisines. L&#39;effet cytopathogène de l&#39;infection par le virus grippal produit une zone circulaire de cellules infectées appelé une plaque. Chaque plaque est sans doute formé après l&#39;infection d&#39;une cellule unique avec une seule particule de virus suivie par la réplication du virus. Le contraste entre les cellules vivantes et les plaques peuvent être améliorées par des colorants tels que le cristal violet. Un inconvénient majeur de cet essai est le manque de reproductibilité et de fortes disparités au sein des expériences. Un autre test utilisé pour déterminer le titre virus de la grippe est le dosage de l&#39;hémagglutination. Le présente protéine hémagglutinine sur la surface de la virus de la grippe se lie efficacement à N-acétylneuraminique l&#39;acide-les protéines contenant sur ​​mammifères et aviaires globules rouges 1. Cette interaction entre le virus de l&#39;influenza et les érythrocytes conduit à d&#39;agglutination sous la forme d&#39;un treillis. Le lEvel d&#39;agglutination est utilisée pour estimer le titre du virus de la grippe dans les éprouvettes. Test d&#39;agglutination érythrocytaire est utilisée uniquement pour déterminer le titrage d&#39;un virus connu et ne peut pas être utilisé à des fins d&#39;identification des souches. Depuis cet essai ne fait pas de distinction entre le live et les virus morts, il est difficile d&#39;obtenir un calcul précis de titres viraux. Actuelles des diagnostics cliniques d&#39;infections de la grippe sont basées sur des tests sérologiques, la réaction en chaîne par polymérase, l&#39;immunofluorescence directe et 1,6 spécimen de culture cellulaire. La nouvelle méthode décrite ici a aussi le potentiel clinique et de laboratoire de diagnostic. Grippe détection kits Directigen FLU-A. (BD Biosciences, San Jose, CA) et BinaxNOW (Binax, Inc, Scarborough, ME) test immunochromatographie utilisation pour détecter l&#39;antigène viral tel que nucléoprotéine 7 L&#39;utilisation de ces kits, la détection du virus peut être réalisé dans les 15 minutes, mais tous les échantillons négatifs doivent être en outre screened par le Procédé de culture cellulaire. Diverses études ont également rapporté une faible sensibilité de ces kits, en particulier, lorsque l&#39;infection était légère ou faible 8. Dans notre méthode, nous avons constamment de détecter aussi peu que 100 PFU de virus. Cela donne à penser notre technique est utile dans la détection du virus H1N1 dans des échantillons cliniques, même lorsque l&#39;infection est bénigne. Une méthode à base de fluorescence pour détecter les antigènes viraux ont été signalés, soit des échantillons où aspirat rhinopharyngé ont été analysés directement ou ont été ensemencés sur une monocouche de cellules sensibles à la multiplication du virus et les analyses subséquentes 9. Cependant, ces méthodes sont limitées à des fins de diagnostic et ne conviennent pas pour les calculs titre du virus. Q-PCR aide à identifier la présence de l&#39;ARN viral et de ne pas estimer l&#39;infectiosité des virus vivants. Par rapport à ces essais, le système de dosage IR à base de colorant aidera dans la recherche et le dénombrement titre viral dans les échantillons cliniques et de laboratoire. En cas de flambée de grippe, il estcritique pour diagnostiquer beaucoup d&#39;échantillons dans une période de temps courte. Notre méthode repose sur une plaque de 384 puits et d&#39;un scanner IR permet de numériser 6 plaques à la fois (&gt; 2.000 échantillons), offrant ainsi un plus grand avantage par rapport aux autres méthodes directes fluorescentes. Faisabilité d&#39;un traitement rapide de milliers d&#39;échantillons cliniques pourrait réduire la variabilité des essais, la durée de dosage et les coûts. L&#39;utilisation d&#39;un anticorps M2-spécifique offre l&#39;avantage d&#39;être indépendante des différences entre les souches dans les protéines H et N. La protéine M2-est relativement conservée dans la plupart des souches de la grippe infectant les humains. Si des anticorps spécifiques aux taches qui circulent sont combinés avec notre système de on peut mesurer à la fois le titre de virus et d&#39;identifier la souche. Cependant, depuis M2 est la cible pour les médicaments amantadine comme des mutants peuvent survenir qui pourraient changer le site de liaison pour l&#39;anticorps monoclonal utilisé ici. Ceci constitue une limitation potentielle de ce système chez les individus qui sont traités par ces médicaments. Multipledosages sont utilisés pour énumérer les titres de la grippe dans des échantillons d&#39;essai. Pour calculer le virus de titre, 50% de la dose infectieuse de culture tissulaire (DICT 50) et d&#39;œufs allantoïques fluide à base de tests sont largement utilisés 1,10. Toutefois, les exigences de plusieurs jours que ces méthodes soient moins fiables. En outre, dans ces méthodes des calculs basés sur le changement de 50% dans le nombre de plaques de fournir théoriques, mais pas exacte titrages viraux. Plaque formant des tests peuvent être effectués dans les 96 heures, mais, manque de reproductibilité est une préoccupation majeure dans les calculs de titre viral. La technique décrite ici présente a plusieurs avantages distincts. D&#39;abord, il s&#39;agit d&#39;une technique hautement reproductible avec des résultats cohérents. Deuxièmement, les calculs titre viral sont basées sur la quantification simple des intensités de fluorescence, qui sont comparées contre de définition des courbes standard. Troisièmement, deux ou plusieurs anticorps primaires peuvent être utilisés pour diagnostiquer de multiples sérotypes dans un échantillon donné. En outre, IR colorant anticorps conjugués ont minimal autofluorescence et ont été utilisés pour l&#39;imagerie des cellules 11. UV ou visuelle de rayonnement (300-600 nM) des résultats de l&#39;autofluorescence cellulaire élevée en raison de la présence de hautes quantique rendement fluorophores endogènes. Il s&#39;agit notamment des acides aminés aromatiques, les lipo-pigments, des nucléotides pyridiniques (NADPH), l&#39;élastine, le collagène et coenzymes flavines. Cette propriété intrinsèque des cellules, il est difficile d&#39;utiliser ces sources de rayonnement en tant que sondes pour quantifier l&#39;expression de protéines spécifiques. En revanche, le proche infrarouge colorants exciter et émettent entre 670-1000 nm. Beaucoup de molécules hôtes cellulaires et d&#39;hydrocarbures aromatiques polycycliques n&#39;excitent pas à cette longueur d&#39;onde et en raison de diffusion de la lumière réduite, émettre de la fluorescence de fond extrêmement faible. En outre, la fenêtre entre le fond et la détection spécifique est largement améliorée en raison d&#39;un coefficient d&#39;extinction élevé des fluorophores dans le proche infrarouge. Photostabilité, supérieure signal de-sur-bruit, est extrêmement pertinente dans la quantification des titres viraux. Utilisez des microflchambres uidic permettra d&#39;automatiser le processus de sélection grâce à des contrôles robotiques, et pourrait nous permettre de tester des échantillons cliniques hautement contagieuses en toute simplicité. Ainsi, l&#39;utilisation des colorants dans le proche infrarouge dans ces méthodes est idéal et très fiable d&#39;énumérer les titres viraux dans des échantillons de tissus.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Sérum-albumine bovine </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11750 </td><td></td></tr><tr><td> Virus PR8 </td><td></td><td></td><td> De Dr Thomas Moran M </td></tr><tr><td> De chèvre anti-souris IRDye @ 800 </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 926-32210 </td><td> 1:200 de dilution </td></tr><tr><td> LI-COR Odyssey IR scanner </td><td> LI-COR-biosciences </td><td> 9201-01 </td><td></td></tr><tr><td> 384 puits fond plat </td><td> Nalge Nunc internationale </td><td> 164730 </td><td></td></tr><tr><td> 96-puits fond plat </td><td> Nalge Nunc internationale </td><td> 165305 </td><td></td></tr><tr><td> Du milieu DMEM </td><td> Invitrfibrinogène </td><td> 11965126 </td><td></td></tr><tr><td> Milieu RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 11875135 </td><td></td></tr><tr><td> Le bicarbonate de sodium </td><td> Invitrogen </td><td> 25080 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamine 100x </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Trypson-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> R001100 </td><td></td></tr><tr><td> Pyruvate de sodium </td><td> Invitrogen </td><td> 11360070 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-M-2 anticorps </td><td></td><td></td><td> De Dr Thomas Moran M </td></tr><tr><td> Anti-NP mAb </td><td> CDC </td><td> V2S2208 </td><td> Obtenu par un autre MTA </td></tr></tbody></table>

high-throughput detection method for influenza virus

Virus de la grippe est un agent pathogène respiratoire qui provoque une degré élevé de morbidité et de mortalité chaque année en plusieurs parties du monde. Par conséquent, le diagnostic précis de la souche infectante et rapide criblage à haut débit d&#39;un grand nombre d&#39;échantillons cliniques est primordiale pour lutter contre la propagation des infections en cas de pandémie. Actuelles des diagnostics cliniques d&#39;infections de la grippe sont basées sur des tests sérologiques, la réaction en chaîne par polymérase, l&#39;immunofluorescence directe et de 1,2 spécimen de culture cellulaire. Nous rapportons ici le développement d&#39;une nouvelle technique de diagnostic utilisé pour détecter les virus de la grippe en direct. Nous avons utilisé les ressources humaines adaptée à la souris A/PR/8/34 (PR8, H1N1) de 3 à tester l&#39;efficacité de cette technique en utilisant des cellules MDCK 4. Cellules MDCK (10 4 ou 5 x 10 3 par puits) ont été cultivées dans 96 - ou de plaques de 384 puits, des infectées par le PR8 et de protéines virales ont été détectées utilisant des anticorps anti-M2 suivie par une IR de colorant-conjugué Secanticorps secondaire. M2 5 et l&#39;hémagglutinine 1 sont deux protéines marqueurs majeurs utilisés dans de nombreux différents tests de diagnostic. Embauche IR-dye-anticorps secondaires conjugués à minimiser l&#39;autofluorescence associée à d&#39;autres colorants fluorescents. L&#39;utilisation de l&#39;anticorps anti-M2 nous a permis d&#39;utiliser l&#39;intensité de fluorescence spécifique de l&#39;antigène comme une métrique directe de la quantité virale. Pour énumérer l&#39;intensité de fluorescence, nous avons utilisé le LI-COR Odyssey à base de scanner IR. Ce système utilise deux canaux à base de laser détections infrarouges pour identifier les fluorophores et de les différencier du bruit de fond. Le premier canal excite à 680 nm et émet à 700 nm pour aider à quantifier l&#39;arrière-plan. Le second canal détecte fluorophores que excitent à 780 nm et émettent à 800 nm. Numérisation de PR8-infectés cellules MDCK dans le scanner IR a indiqué une infection virale titre dépendant fluorescence brillante. Une corrélation positive de l&#39;intensité de fluorescence à titre de virus à partir de 10 2 -10 5 UFP pourrait être consistently observée. Positivité minimale détectable, mais toujours vu avec 10 2 -10 3 PFU PR8 titres viraux ont démontré la sensibilité élevée des colorants dans le proche infrarouge. Le rapport signal-bruit a été déterminée en comparant la maquette infectés ou isotype-traités des cellules MDCK. En utilisant les intensités de fluorescence à partir de 96 - ou des formats de plaques de 384 puits, nous avons construit des courbes de titrage standard. Dans ces calculs, la première variable est le titre viral tandis que le deuxième variable est l&#39;intensité de fluorescence. Par conséquent, nous avons utilisé la distribution exponentielle pour générer une courbe d&#39;ajustement afin de déterminer la relation polynomiale entre les titres viraux et des intensités de fluorescence. Collectivement, nous concluons que IR à base de colorant système de détection de protéines peut aider à diagnostiquer l&#39;infection des souches virales et précisément énumérer le titre des agents pathogènes infectieux.

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High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Cette méthode décrit l&#39;utilisation de système d&#39;imagerie infrarouge à base de colorants pour la détection du virus H1N1 dans broncho-alvéolaire (LBA) des souris infectées avec une sensibilité élevée. Cette méthodologie peut être effectuée dans un 96 - ou 384 puits de plaque, il faut &lt;volume de 10 ul de matériel d&#39;essai et a le potentiel pour le dépistage simultané de plusieurs agents pathogènes.

Méthode de détection à haut débit pour les virus de la grippe

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

high-throughput-detection-method-for-influenza-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

26.0K vues.  Blood Research Institute. Cette méthode décrit l'utilisation de système d'imagerie infrarouge à base de colorants pour la détection du virus H1N1 dans broncho-alvéolaire (LBA) des souris infectées avec une sensibilité élevée. Cette méthodologie peut être effectuée dans un 96 - ou 384 puits de plaque, il faut 

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Génération de virus recombinants de la grippe des ADN plasmidique

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Recherche

Immunologie et infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Utiliser l&#39;imagerie Bioluminescent chargé d&#39;enquêter sur une synergie entre Streptococcus pneumoniae Et virus Influenza A de souriceaux

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5 For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus have been demonstrated.6-11 The identification and subtyping of influenza on DNA microarrays has applications in both public health and the clinic for early detection, rapid intervention, and minimizing the impact of an influenza pandemic. Traditional fluorescence is currently the most commonly used microarray detection method. However, as microarray technology progresses towards clinical use,1 replacing expensive instrumentation with low cost detection technology exhibiting similar performance characteristics to fluorescence will make microarray assays more attractive and cost-effective.
The ampliPHOX colorimetric detection technology is intended for research applications, and has a limit of detection within one order of magnitude of traditional fluorescence11, with a main advantage being an approximate ten-fold lower instrument cost compared to the confocal microarray scanners required for fluorescence microarray detection. Another advantage is the compact size of the instrument which allows for portability and flexibility, unlike traditional fluorescence instruments. Because the polymerization technology is not as inherently linear as fluorescence detection, however, it is best suited for lower density microarray applications in which a yes/no answer for the presence of a certain sequence is desired, such as for pathogen detection arrays. Currently the maximum spot density compatible with ampliPHOX detection is &tilde;1800 spots/array. Because of the spot density limitations, higher density microarrays are not suitable for ampliPHOX detection.
Here, we present ampliPHOX colorimetric detection technology as a method of signal amplification on a low density microarray developed for the detection and characterization of influenza viruses (FluChip). Although this protocol uses the FluChip (a DNA microarray) as one specific application of ampliPHOX detection, any microarray incorporating biotinylated target can be labeled and detected in a similar manner. The microarray design and biotinylation of the target to be captured are the responsibility of the user. Once the biotinylated target has been captured on the array, ampliPHOX detection can be performed by first tagging the array with a streptavidin-label conjugate (ampliTAG). Upon light exposure using the ampliPHOX Reader instrument, polymerization of a monomer solution (ampliPHY) occurs only in regions containing ampliTAG-labeled targets. The polymer formed can be subsequently stained with a non-toxic solution to improve visual contrast, followed by imaging and analysis using a simple software package (ampliVIEW). The entire FluChip assay from un-extracted sample to result can be performed in about 6 hours, and the ampliPHOX detection steps described above can be completed in about 30 min.

ampliPHOX colorimetric detection technology is presented as an inexpensive alternative to fluorescence detection for microarrays. Based on photopolymerization, ampliPHOX produces solid polymer spots visible to the naked eye in just a few minutes. Results are then imaged and automatically interpreted with a simple yet powerful software package.

ampliPHOX détection colorimétrique sur un microréseau d&#39;ADN pour la grippe

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Virus de la grippe Propagation dans embryonnés de poulet Oeufs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Lingettes nasal pour la grippe détection d&#39;un virus et l&#39;isolement des porcs

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In Vitro désassemblage du virus grippal A capsides par Centrifugation Gradient

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

À haut débit de détection de pathogènes dans respiratoires Spécimens animaux par Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.

Études de Virus influenza de type A dans un modèle murin d’Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface glycoproteins of the virus. The generation of escape variants is a powerful method in elucidating how viruses escape immune detection and in identifying critical residues required for antibody binding. Here, we describe a protocol on how to generate influenza A virus escape variants by utilizing human or murine monoclonal antibodies (mAbs) directed against the viral hemagglutinin (HA). With the use of our technique, we previously characterized critical residues required for the binding of antibodies targeting either the head or stalk of the novel avian H7N9 HA. The protocol can be easily adapted for other virus systems. Analyses of escape variants are important for modeling antigenic drift, determining single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring resistance and virus fitness, and in the designing of vaccines and/or therapeutics.

We describe a method by which we identify critical residues required for the binding of human or murine monoclonal antibodies that target the viral hemagglutinin of influenza A viruses. The protocol can be adapted to other virus surface glycoproteins and their corresponding neutralizing antibodies.

Génération des variantes d’évasion de neutraliser les anticorps monoclonaux Influenza Virus

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Extraction rapide, sûre et Simple acide nucléique chevet manuelle pour la détection des Virus dans des échantillons de sang total

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...