Cette étude a été soutenue par la subvention du NIH (R15DA029863), la subvention Florida Atlantic University de recherche de premier cycle (M30014) et de l&#39;École de médecine vétérinaire de subvention de recherche Ross University. Nous tenons à remercier l&#39;Institut national sur l&#39;abus des drogues (Rockville, MD) pour fournir (±) 3,4-méthylènedioxyméthamphétamine (MDMA ±) pour ce travail.

Les procédures d&#39;utilisation des animaux décrits ci-dessous ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation (IACUC) à l&#39;école de médecine vétérinaire de l&#39;Université de Ross et Florida Atlantic University. Bien que les techniques stériles et des gants sont nécessaires, l&#39;environnement RNase-free est pas nécessaire lors de l&#39;utilisation de ce protocole. 1. Préparation <ol><li> Préparation des tissus et de sectionnement <ol><li> Attribuer des rats au hasard en trois groupes: les frais / solution saline (SAL; NaCl 0,9%), le préfixe / SAL et préfixés / 3,4-méthylènedioxyméthamphétamine (MDMA; voir détails dans le tableau 1). </li><li> Administrer trois doses de 1 ml / kg SAL et 10 mg / kg par voie intrapéritonéale MDMA, respectivement, pour les groupes SAL et MDMA à intervalle de 2 h. Permettre aux animaux de survivre le traitement pendant 6 jours. </li><li> Au jour 7, administrer 100 mg / kg de kétamine en combinaison de 5 mg / kg par voie intrapéritonéale xylazine aux rats pour une anesthésie profonde (ie, la perte de clignotement de la cornée et tail pincer réflexes). </li><li> Pour le groupe frais / SAL, décapiter rapidement rats et enlever le cerveau pour le test de cerveau frais (voir les détails dans la référence 5). </li><li> Pour les groupes / MDMA préfixés / SAL et préfixés, faire une coupe le long du sternum environ 10 -12 cm et ensuite exposer l&#39;extrémité du sternum. </li><li> Maintenez l&#39;extrémité du sternum avec une pince hémostatique et couper la membrane latéralement des deux côtés avec des ciseaux pointus et ensuite coupé vers le haut à travers les côtes et en parallèle vers les poumons. </li><li> Avec une main, tenir la pointe ventrale du cœur avec une petite pince. Avec l&#39;autre main, percer le ventricule gauche avec une aiguille de calibre 18 de la seringue (noter le côté de l&#39;adaptateur de l&#39;aiguille est reliée à un tuyau de silicium en forme de Y Sal et paraformaldéhyde conteneurs glacées et les pompes péristaltiques, voir la référence 9). </li><li> Tournez sur la pompe de SAL au niveau moyen de la vitesse d&#39;écoulement (~ 5 ml / min) et à la perforation de l&#39;oreillette droite avec la pince pour permettre l&#39;évasion de retour circulation. Maintenir SAL perfusion pendant 30 min. </li><li> Tournez sur la pompe de paraformaldéhyde au niveau moyen et laissez la glace-paraformaldéhyde 4% froid pour perfuser l&#39;animal pendant 30 min. </li><li> Retirer l&#39;instrument de perfusion et de décapiter l&#39;animal. Faire un postéro couper à travers la ligne médiane du crâne, puis battre le crâne pour exposer la cavité du crâne 10. </li><li> Retirer le cerveau avec une spatule à partir de la cavité du crâne et du cerveau placer dans un tube à centrifuger de 50 ml contenant 25 ml de paraformaldehyde à 4%. Gardez le cerveau dans le tube contenant paraformaldéhyde à 4 ºC réfrigérateur pendant 24 h. </li><li> Déplacer le cerveau dans un tube centrifuge de 50 ml contenant 25 ml de solution de saccharose à 30% à 4 ° C pendant 3 jours. Enfin, stocker le cerveau dans les sacs en plastique à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Montez le cerveau sur un mandrin avec intégration des médias et de geler les médias enrobage contenant cerveau dans un cryostat à une température de -26 ºC. Couper le gelé fraisn cerveau cerveau en 20 sections um et le paraformaldéhyde-préfixés en sections de 10 um. Transférer la section à une lame de microscope RT en touchant la diapositive à la section. </li><li> Air sec à température ambiante pendant 4 h. Conserver les diapositives de section dans un sac étanche scellée à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li><li> Déshydration <ol><li> Prenez diapositives de la -80 ° C congélateur et attribuer des sections dans une des trois tests: HT2A, PPIB (contrôle positif) ou dapB (contrôle négatif); marque et sections de l&#39;étiquette avec un stylo à bille (ne pas utiliser un crayon). Plonger les lames dans 100% d&#39;alcool à la température ambiante pendant 5 min. Sécher les lames pendant 5 min dans une hotte. </li></ol></li><li> Prétraitement <ol><li> Pipette 20 pl du réactif de prétraitement-1 (inactivation de la phosphatase alcaline) aux coupes sur des lames. Placer les lames sur un rail de support d&#39;une plaque à l&#39;humidité (à noter que le plateau est recouvert d&#39;un couvercle afin de maintenir une humidité élevée pour empêcher l&#39;évaporation à partir de la réaction de solution). </li><li> Secouer doucement le plateau de l&#39;humidité sur un agitateur horizontal à basse vitesse pendant 10 min. Laver les lames à deux reprises avec de l&#39;eau distillée deux fois (ddH 2 O) pendant 2 min. Immerger la lame dans un bécher de 200 ml contenant 150 ml du réactif de prétraitement-2 (rupture des liaisons transversales induites par paraformaldéhyde fixation). Faire bouillir les diapositives pour un total de 5 min à 100 ° C (de restauration induite par la chaleur de la structure de l&#39;ARN 11). </li><li> Laver les lames à deux reprises avec le trou DDH 2 O pendant 2 min. Placer les lames dans alcool à 100% pendant 5 min. Sécher les lames pendant 5 min dans la hotte. Utilisez un stylo hydrophobe pour dessiner un cercle autour de la zone sélectionnée dans la section de tissu (par exemple, des structures non-corticales, y compris le thalamus et l&#39;hypothalamus comme indiqué dans la figure 2). </li><li> Pipette 10 ul du prétraitement-3 réactif (augmentation du taux de pénétration de la sonde) à chaque zone sélectionnée, et couvrent le plateau de l&#39;humidité avec le couvercle. Placer le plateau dans le four à hybridationéquipé du agitateur horizontal et régler la température du four à 40 ºC; secouer doucement le plateau pendant 30 min. Laver les lames à deux reprises avec le trou DDH 2 O pendant 2 min. </li></ol></li></ol> 2. L&#39;hybridation et d&#39;amplification <ol><li> Pipette 10 ul de TR2A, PPIB et dapB réactifs de sonde, respectivement, sur les zones sélectionnées. Couvrir le bac d&#39;humidité avec le couvercle pour empêcher l&#39;évaporation du réactif. Secouer doucement sur l&#39;agitateur horizontal réglé à une vitesse faible. Incuber les lames à 40 ° C dans le four pendant 2 heures. </li><li> Laver les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant 2 minutes. Pipette 10 ul du réactif d&#39;amplification-1 sur chaque zone sélectionnée, agiter et incuber les lames à 40 ° C pendant 30 min. </li><li> Laver les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant 2 minutes. Pipette 10 ul du réactif Amplification-2 sur chaque zone sélectionnée, agiter et incuber les lames à 40 ° C pendant 15 min. </li><li> Laver les lames à deux reprises wvec un tampon de lavage pendant 2 minutes. Pipette 10 ul du réactif Amplification-3 sur chaque zone sélectionnée, agiter et incuber les lames à 40 ° C pendant 30 min. </li><li> Laver les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant 2 minutes. Pipette 10 ul du réactif Amplification-4 de chaque zone sélectionnée, agiter et incuber les lames à 40 ° C pendant 15 min. </li><li> Laver les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant 2 minutes. Pipette 10 ul du réactif Amplification-5 sur chaque zone sélectionnée, agiter et incuber les lames à température ambiante pendant 30 min. </li><li> Laver les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant 2 minutes. Pipette 10 ul du réactif Amplification-6 sur chaque zone sélectionnée, agiter et incuber les lames à température ambiante pendant 15 min. Laver les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant 2 minutes. </li></ol> 3. Signal Detection <ol><li> Introduire à la pipette 10 ul du réactif rouge à chaque région sélectionnée (A noter que le réactif est un mélange de rouge et rouge-B-A dans un rapport 1:60 et doit être utilisé immédiatement). Placer la lame dans le bac d&#39;humidité sur le agitateur horizontal à température ambiante et agiter doucement à basse vitesse pendant 10 min. </li><li> Laver les lames deux fois avec (ddH 2 O) pendant 10 min. Sécher les lames à 60 ° C dans le four pendant 15 min. Placer les lames dans le xylène sous la hotte pendant 5 min. Pipette 20 ul de milieu de montage à base de xylène sur chaque zone sélectionnée et couvrir avec une lamelle. </li></ol> 4. Capture d&#39;image <ol><li> Prenez microphotographies numériques des zones sélectionnées (par exemple, l&#39;hypothalamus, les figures 1 et 3) avec un grossissement de 4 × 20 × et des lentilles d&#39;objectif. Enregistrez le fichier d&#39;image. </li></ol> 5. Analyse des particules de l&#39;image <ol><li> Glissez et déposez le fichier de l&#39;image dans la fenêtre principale de ImageJ. Allez à la barre de menu et sélectionnez &#39;Image&#39;, suivant, sélectionnez &quot;Type&quot; dans le menu déroulant, puis sélectionnez &#39;8-bit&#39;. </li><li> Sélectionnez «Réglage», puis sélectionnez «Threshold &#39;pour ouvrir la boîte de dialogue. Réglez la valeur de barre inférieure dans la boîte de dialogue afin que le fond indésirable est retiré. Allez à la barre de menu et sélectionnez «Analyser», puis sélectionnez «analyser des particules &#39;pour ouvrir une deuxième boîte de dialogue. </li><li> Régler la taille des particules à 10, sélectionner la prochaine &#39;Show présente »et sélectionnez« Afficher les résultats »et« boîtes Résumer&#39;. Enfin, cliquez sur «OK» pour afficher les données de particules dans les boîtes de dialogue. </li></ol> 6. Calcul Spreadsheet <ol><li> Saisissez les données dans la feuille Excel et en moyenne le nombre de particules dans le groupe SAL comme base de référence. Calculer le niveau de pourcentage de chaque section et faire un graphique en conséquence (Figure 4). </li></ol>

<ol>
	<li>Muzyk, A. J., Jakel, R. J., Preud'homme, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+syndrome+after+a+massive+overdose+of+controlled-release+paroxetine.">Serotonin syndrome after a massive overdose of controlled-release paroxetine.</a> Psychosomatics. 51, 437-442 (2010).</li><li>Davies, O., Batajoo-Shrestha, B., Sosa-Popoteur, J., Olibrice, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full+recovery+after+severe+serotonin+syndrome,+severe+rhabdomyolysis,+multi-organ+failure+and+disseminated+intravascular+coagulopathy+from+MDMA.">Full recovery after severe serotonin syndrome, severe rhabdomyolysis, multi-organ failure and disseminated intravascular coagulopathy from MDMA.</a> Heart Lung. 43, 117-119 (2014).</li><li>Bosch, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Verbal+memory+deficits+are+correlated+with+prefrontal+hypometabolism+in+18FDG+PET+of+recreational+MDMA+users.">Verbal memory deficits are correlated with prefrontal hypometabolism in 18FDG PET of recreational MDMA users.</a> PLoS On. 8, e61234 (2013).</li><li>Smithies, V., Broadbear, J., Verdejo-Garcia, A., Conduit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+overnight+memory+consolidation+in+ecstasy+users.">Dysfunctional overnight memory consolidation in ecstasy users.</a> J Psychopharmaco. 28, 751-762 (2014).</li><li>Winzer-Serhan, U. H., Broide, R. S., Chen, Y., Leslie, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+radioactive+in+situ+hybridization+using+full+length+hydrolyzed+riboprobes+to+detect+&#945;2+adrenoceptor+subtype+mRNAs+in+adult+and+developing+rat+brain.">Highly sensitive radioactive in situ hybridization using full length hydrolyzed riboprobes to detect &#945;2 adrenoceptor subtype mRNAs in adult and developing rat brain.</a> Brain Res Brain Res Proto. 3, 229-241 (1999).</li><li>Zoeller, R. T., Fletcher, D. L., Butnariu, O., Lowry, C. A., Moore, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-ethylmaleimide+(NEM)+can+significantly+improve+in+situ+hybridization+results+using+35S-labeled+oligodeoxynucleotide+or+complementary+RNA+probes.">N-ethylmaleimide (NEM) can significantly improve in situ hybridization results using 35S-labeled oligodeoxynucleotide or complementary RNA probes.</a> J Histochem Cytoche. 45, 1035-1041 (1997).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diag. 14, 22-29 (2012).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope+for+in+situ+detection+of+transcriptionally+active+human+papillomavirus+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma.</a> J Vis E. , (2014).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis E. , (2012).</li><li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+pericytes+and+capillary+diameter+in+brain+slices+and+isolated+retinae.">Imaging pericytes and capillary diameter in brain slices and isolated retinae.</a> Nat Proto. 9, 323-336 (2014).</li><li>Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+techniques:+current+perspectives.">Antigen retrieval techniques: current perspectives.</a> J Histochem Cytoche. 49, 931-937 (2001).</li><li>Qin, Y., Heine, V. M., Karst, H., Lucassen, P. J., Joels, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+patterns+in+rat+dentate+granule+cells:+comparison+between+fresh+and+fixed+tissue.">Gene expression patterns in rat dentate granule cells: comparison between fresh and fixed tissue.</a> J Neurosci Method. 131, 205-211 (2003).</li><li>Carter, B. S., Fletcher, J. S., Thompson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+messenger+RNA+expression+by+in+situ+hybridization+using+RNA+probes+synthesized+via+in+vitro+transcription.">Analysis of messenger RNA expression by in situ hybridization using RNA probes synthesized via in vitro transcription.</a> Method. 52, 322-331 (2010).</li><li>Mijnster, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+and+cellular+distribution+of+serotonin+5-hydroxytryptamine2a+receptor+mRNA+in+the+nucleus+accumbens,+olfactory+tubercle,+and+caudate+putamen+of+the+rat.">Regional and cellular distribution of serotonin 5-hydroxytryptamine2a receptor mRNA in the nucleus accumbens, olfactory tubercle, and caudate putamen of the rat.</a> J Comp Neuro. 389, 1-11 (1997).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+region-specific+alterations+of+5-HT2A+and+5-HT2C+receptors+in+serotonin+transporter+knockout+mice.">Brain region-specific alterations of 5-HT2A and 5-HT2C receptors in serotonin transporter knockout mice.</a> J Neuroche. 84, 1256-1265 (2003).</li><li>Horner, K. A., Gilbert, Y. E., Noble, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+5-HT2A+receptor+mRNA+expression+following+withdrawal+from+a+chronic+escalating+dose+regimen+of+D-amphetamine.">Differential regulation of 5-HT2A receptor mRNA expression following withdrawal from a chronic escalating dose regimen of D-amphetamine.</a> Brain Re. 1390, 10-20 (2011).</li><li>Mocci, G., Jimenez-Sanchez, L., Adell, A., Cortes, R., Artigas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+5-HT2A+receptors+in+prefrontal+cortex+pyramidal+neurons+projecting+to+nucleus+accumbens.+Potential+relevance+for+atypical+antipsychotic+action.">Expression of 5-HT2A receptors in prefrontal cortex pyramidal neurons projecting to nucleus accumbens. Potential relevance for atypical antipsychotic action.</a> Neuropharmacolog. 79, 49-58 (2014).</li><li>Reneman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+and+chronic+effects+of+MDMA+('Ecstasy')+on+cortical+5-HT2A+receptors+in+rat+and+human.">The acute and chronic effects of MDMA ('Ecstasy') on cortical 5-HT2A receptors in rat and human.</a> 26, 387-396 (2002).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrentes.

One of the major concerns of in situ hybridization test is to choose appropriate techniques used for RNA preservation because of RNase enzymes. It is well known that these enzymes are widely present in the cells and environment which can affect the results. However, enzyme activity can be quickly distinguished by placing the tissue in the dry ice/alcohol solution5,12. Although quick preservation is critical for hybridization using a riboprobe13, little is known about experimental conditions...

Serotonin (5-hydroxytryptamine; 5-HT) syndrome is an acute neurologic disorder caused by 5-HT-promoting drugs such as antidepressants1, while also occurring in situations of MDMA use for recreational purposes2. Molecular mechanisms responsible for mood swings, learning and memory deficits that occur in association with the acute syndrome are not well understood3,4. In situ hybridization is a powerful research tool allowing the detection and quantification of specific mRNAs expressed potentially at a single-cell level. The conventional way to perform in situ hybridization is to utilize a radioactive-labeled riboprobe that specifically hybridizes the gene of interest. However, a major drawback is that the method requires complicated and time-consuming probe preparation and hybridization steps, as well as access to fresh frozen tissues maintained in an RNase-free environment5,6. 
Oligonucleotide probes have been recently developed to hybridize shorter RNA fragments than those required for riboprobes7. Furthermore, the probes produce a low background signal without sacrificing specificity8. This newly-developed probe technology can be used in situ hybridization on paraformaldehyde-prefixed brain tissues commonly available in immunocytochemical laboratories.
Here, we describe a protocol for in situ hybridization using oligonucleotide probes on paraformaldehyde-prefixed rat brain and compare findings with those noted in a fresh frozen brain5,6. This protocol is used to test the hypothesis that MDMA substance abuse causes changes in 5-HT2A receptor gene htr2a mRNA in the brain. We began the procedure with MDMA treatment followed by paraformaldehyde tissue perfusion of the animal, in situ hybridization of the thr2a probe, and data analysis. Note that dapB (the bacterial gene coding for dihydrodipicolinate reductase) is used as a negative control, and ppiB (housekeeping gene coding for peptidylprolyl isomerase B) as a positive control.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="873">
	<tbody>
		<tr>
			<td>RNAscope Negative Control Probe-DapB</td>
			<td>Advanced cell diagnostic, INC</td>
			<td>310098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Pretreat 4</td>
			<td>Advanced cell diagnostic, INC</td>
			<td>320046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - Red</td>
			<td>Advanced cell diagnostic, INC</td>
			<td>310036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Probe - Rn-Ppib</td>
			<td>Advanced cell diagnostic, INC</td>
			<td>313921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Htr2a</td>
			<td>Advanced cell diagnostic, INC</td>
			<td>300031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM 1850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>88032-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>222000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus microscope slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Provis AX70</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid in situ hybridization using oligonucleotide probes on paraformaldehyde-prefixed brain of rats with serotonin syndrome

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin (5-hydroxytryptamine; 5-HT) syndrome. This hypothesis can be tested using in situ hybridization to detect the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a. In the past, such procedures, utilizing radioactive riboprobe, were difficult because of the complicated workflow that needs several days to perform and the added difficulty that the technique required the use of fresh frozen tissues maintained in an RNase-free environment. Recently, the development of short oligonucleotide probes has simplified in situ hybridization procedures and allowed the use of paraformaldehyde-prefixed brain sections, which are more widely available in laboratories. Here, we describe a detailed protocol using non-radioactive oligonucleotide probes on the prefixed brain tissues. Hybridization probes used for this study include dapB (a bacterial gene coding for dihydrodipicolinate reductase), ppiB (a housekeeping gene coding for peptidylprolyl isomerase B), and htr2a (a serotonin gene coding for 5-HT2A receptors). This method is relatively simply, cheap, reproducible and requires less than two days to complete.

En utilisant les sondes d&#39;ARN oligonucléotidique (&lt;25 nt), l&#39;hybridation peut être détectée sous forme de points rouges dans les cellules de l&#39;hypothalamus préparés à partir de cerveaux congelés paraformaldehyde préfixée et frais. Les molécules d&#39;ARNm HTR2A sont présents dans certaines cellules (indiquées par les flèches solides), mais pas d&#39;autres (flèches ouvertes). Nous avons observé qu&#39;il n&#39;y a pas de différence entre le paraformaldehyde préfixée et les tiss...

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Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

This protocol describes a rapid and simplified in situ hybridization method ideal forparaformaldehyde-prefixed brain, thus reducing the need for prolonged complex steps while using fresh frozen tissues. The method is validated using the identification of the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a in rats.

Rapid<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation utilisant sondes oligonucléotidiques sur Brain Paraformaldéhyde préfixée de rats avec syndrome sérotoninergique

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

rapid-situ-hybridization-using-oligonucleotide-probes-on

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

8.8K vues.  Ross University School of Veterinary Medicine. This protocol describes a rapid and simplified in situ hybridization method ideal forparaformaldehyde-prefixed brain, thus reducing the need for prolonged complex steps while using fresh frozen tissues. The method is validated using the identification of the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a in rats.