Ce protocole combine l’hybridation in situ de l’ARNs de fluorescence et l’immunohistochimie à l’aide de préparations cérébrales fraîches congelées ou fixes. Cette technique permet la flexibilité en démontrant une combinaison de méthodes d’hybridation in situ et d’immunohistochimie très sensibles pour la visualisation spatiale de cibles d’ARN et de protéines dans le même échantillon de tissu. Cette méthode est applicable au marquage multiplex dans la coupe de tissu cérébral, facilitant l’étude de l’organisation spatiale et de la signification fonctionnelle de l’ARNm et des protéines au sein de populations neuronales hétérogènes en neurosciences.
Ce protocole se concentre principalement sur les étapes de traitement des tissus frais congelés et des tissus fixés au paraformaldéhyde. Pour commencer à sectionner le tissu cérébral fraîchement congelé, fixez-le au mandrin du cryostat pré-refroidi et coupez des sections coronales de 14 micromètres d’épaisseur. Montez la section sur une lame de microscopie en verre chargée.
Transférez la diapositive montée dans une boîte à diapositives. Transportez ensuite la boîte dans le congélateur à moins 80 degrés Celsius sur de la glace carbonique. Pour la fixation des tissus, filtrez la solution de paraformaldéhyde préparée.
Refroidissez-le à 4 degrés Celsius. Apportez la lame montée du congélateur à moins 80 degrés Celsius sur de la glace carbonique et plongez-la immédiatement dans la solution de paraformaldéhyde pré-réfrigérée pendant 15 minutes, Effectuez la déshydratation des tissus fraîchement congelés pour vous assurer que la lame de verre est complètement sèche. Après avoir retiré le cerveau d’un support fixe à profusion transcardique, à l’aide d’un microtome vibrant, couper des sections de tissu de 30 micromètres d’épaisseur.
Conservez les sections coupées dans une solution cryoprotectrice. Le jour de l’essai FISH, transférez la section flottante dans une plaque de culture cellulaire à 12 puits contenant 0,1 molaire de PBS et agitez-la à 90 à 100 tr/min sur un agitateur à plate-forme rotative pour éliminer le cryoprotecteur. Ensuite, à l’aide d’un pinceau, montez la section à plat sur une lame de microscopie en verre pour éviter qu’elle ne se détache pendant les lavages, et séchez à l’air libre pendant au moins deux heures.
À l’aide d’un stylo barrière hydrophobe, tracez une barrière hydrophobe autour de la section pour contenir les réactifs FISH. Après le prétraitement, le tissu est incubé dans une solution de protéase et hybridé avec des sondes ARNscopiques pendant deux heures, conformément aux directives du fabricant. Ensuite, des étapes d’amplification séquentielle et d’immunohistochimie de fluorescence sont effectuées.
Commencez par préparer une chambre humidifiée à l’abri de la lumière pour l’incubation des lames. Dans un bain-marie, chauffer le tampon de lavage 50X et sonder à 40 degrés Celsius pendant 10 minutes. Une fois refroidi à température ambiante, préparez un litre de tampon de lavage 1X à partir de la concentration de bouillon 50X.
Préparez le mélange de sondes comme décrit dans le manuscrit du texte. Pour le traitement de la protéinase, ajoutez la protéinase 3 sur la section tissulaire et incubez-la à température ambiante pendant 30 minutes. Pour éliminer la protéinase, plongez doucement la lame dans 0,1 molaire de PBS à température ambiante, en évitant que la section ne se déloge.
Pour l’hybridation, ajoutez le mélange de sonde sur la section de tissu. Placez-le dans la chambre préchauffée humidifiée. Ensuite, incubez-le pendant deux heures à 40 degrés Celsius.
Rincez la section de mouchoirs avec un tampon de lavage deux fois pendant deux minutes. Pour l’amplification du signal, à l’aide d’un flacon compte-gouttes, ajoutez une solution d’amplification pour couvrir la section de tissu et incuber comme décrit dans le texte. Ajoutez la solution de blocage sur la section de tissu et incubez pendant une heure à température ambiante pour éviter une liaison non spécifique.
Faites glisser la diapositive pour retirer l’excès de tampon bloquant après l’incubation. Maintenant, incubez la section avec des anticorps primaires pendant la nuit à 4 degrés Celsius. Le lendemain, lavez la lame trois fois avec 1X TBS.
Ajoutez l’anticorps secondaire et incubez les lames pendant deux heures à température ambiante. Examinez la lame à l’aide d’un microscope à épifluorescence équipé d’une caméra. Acquérez des images représentatives à un grossissement de 20 fois et enregistrez-les sous forme de fichiers TIF.
Dans la présente étude, la qualité et l’intégrité des tissus et l’absence de contamination bactérienne ont été confirmées par l’absence de marquage DAPI. Le marquage à partir de sondes de contrôle positives ciblant l’ubiquitine C, la peptidylprolyl isomérase B et l’ARNm de l’ARN polymérase IIA a confirmé l’intégrité de l’ARN. Dans les préparations fraîchement congelées pour distinguer les neurones positifs à l’ARNm GalR1 dans le NTS, des marqueurs neurochimiques supplémentaires ont été utilisés.
Le transporteur vésiculaire lié à la membrane était clairement étiqueté. En revanche, les protéines cytoplasmiques telles que la tyrosine hydroxylase et la GFP exprimées sous le contrôle du promoteur PHOX2B ont été faiblement observées et décrites comme floculantes car elles n’ont pas de contour clair. Le marquage de l’ARNm cytoplasmique GalR1 par la sonde GalR1 a été ponctué et clairement observé.
Pour confirmer que la qualité de l’immunohistochimie dépend de la localisation subcellulaire des protéines, différentes protéines nucléaires et cytoplasmiques ont été marquées en parallèle avec FISH dans les mêmes coupes de tissus. La GFP cytoplasmique PHOX2B avait un aspect floculant. Alors que le signal de la protéine nucléaire PHOX2B était clair, ce qui a confirmé une meilleure qualité d’immunomarquage lorsqu’il est combiné avec FISH.
Lorsqu’elle a été réalisée sur des coupes congelées fixes en combinaison avec FISH, l’immunohistochimie s’est avérée fiable quelle que soit la localisation subcellulaire. Les neurones positifs à l’ARNm GlyT2 étaient situés ventralement par rapport au NTS et non à l’intérieur du NTS. Les neurones positifs à l’ARNm GlyT2 et à l’ARNm PHOX2B ne se sont pas colocalisés.
Une sous-population de neurones NTS positifs à l’ARNm PHOX2B était immunoréactive à la tyrosine hydroxylase, et aucun ne contenait d’ARNm GlyT2. RNAscope permet de visualiser et d’analyser la distribution de l’ARN à une résolution de molécule unique dans les cellules et les tissus. Il permet la recherche sur de nouvelles espèces d’ARN, les mécanismes des maladies, les modèles d’expression des gènes, la diversité des neurones et les interactions cellulaires.
