Le protocole suivant fournit des instructions pour générer des cellules souches pluripotentes autologues induites par l’homme grâce à la reprogrammation rapide et efficace des fibroblastes cutanés humains isolés d’une biopsie de poinçon de peau. Les procédures peuvent être effectuées par des chercheurs ayant peu ou pas d’expérience dans la reprogrammation cellulaire et avec un ajustement approprié, permet le produit de cellules souches pluripotentes induites sans xéno. Les cellules IPS autologues pourraient être utilisées pour des applications de médecine régénérative et pour la modélisation de maladies comme les troubles génétiques ou le cancer afin d’étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents et de développer des thérapies plus spécifiques.
La charge de travail est élevée. Il est extrêmement utile d’étudier le protocole avant de planifier soigneusement l’expérience, y compris les étapes au cours de laquelle les reagents et les matériaux doivent être préparés. La démonstration visuelle de la procédure aide les chercheurs ayant peu ou pas d’expérience à effectuer l’isolement cellulaire et la reprogrammation, en évitant les erreurs courantes liées à une contamination microbienne et arn possible.
Sous une capuche stérile, laver l’échantillon fraîchement obtenu de la peau humaine de l’abdomen dans un plat de 100 millimètres avec la solution HPSS. Enlever les cheveux et les graisses à l’aide de fines forceps et ciseaux et les disséquer avec un scalpel pour obtenir des fragments de la taille de deux millimètres par un millimètre, en évitant les cicatrices, les zones sales ou brûlées du tissu. Placer quatre petits fragments dans chaque plat de 35 millimètres, couvrir d’un verre de couverture stérile et ajouter 1,5 millimètre d’I-DMEM.
Incuber les plaques à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant environ 15 jours ou jusqu’à ce que les cellules atteignent 85% de confluence. Modifiez le milieu de culture tous les trois jours et vérifiez quotidiennement la croissance des cellules à l’aide d’un microscope à contraste de phase inversé. Maintenant, soulevez les verres de couverture avec des forceps fins, placez-les à l’envers dans un plat de 100 millimètres et lavez-les avec 1X PBS stérile.
Retirez les fragments des échantillons et jetez-les. Laver les assiettes avec 1X PBS stériles. Retirer le 1X PBS et ajouter trois millimètres de Trypsin-EDTA aux verres de couverture placés dans le plat de 100 millimètres et ajouter un millimètre de Trypsin-EDTA aux plats de 35 millimètres ainsi.
Incuber pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Ensuite, bloquez la trypsinisation en ajoutant cinq millimètres de TSS au plat de 100 millimètres et deux millimètres de TSS à chaque plat de 35 millimètres. Recueillir la suspension en tubes stériles de 15 millimètres, centrifugeuse à 400 fois G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.
Aspirer le supernatant et réutiliser la pastille en 12 millimètres d’I-DMEM. Divisez la suspension cellulaire en aliquots de trois millimètres et transférez-les chacun dans une plaque de 60 millimètres. Incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.
Changez le milieu tous les jours. Gardez les cellules en culture jusqu’à ce qu’elles atteignent une confluence de 75% Après cela, répéter la trypsinisation trois fois pour obtenir des cellules qui traversent quatre. Ensuite, synchronisez les cellules en remplaçant l’I-DMEM par du S-DMEM et incubez pendant 48 heures à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.
Pendant la synchronisation cellulaire, préparez le cocktail de reprogrammation d’ARN non modifié du milieu d’expansion du fibroblaste et du cocktail de reprogrammation de l’ARN non modifié pour une programmation gratuite de fibroblaste. Pour simplifier la préparation des neuf tubes d’arn aliquots non modifiés qui sont ensuite divisés en 36, nous avions l’habitude de suivre un schéma que nous avons attaché au mur du capot. Enduire une plaque de 24 puits en transférant 100 microlitres de matrice membranaire du sous-sol décongelés sur la glace à chaque puits pour couvrir uniformément le fond.
Incuber pendant au moins une heure à 37 degrés Celsius avant d’ensemencer les cellules. Aspirer le milieu à partir de plaques avec des cellules en culture et rapidement laver en 1X PBS. Répétez la trypsinisation pour obtenir les cellules qui traversez cinq.
Aspirer le supernatant et résusquer la pastille dans un volume approprié de milieu d’expansion fibroblaste. Préparer et nettoyer l’hémomètre avec 70% d’alcool. Ensuite, préparez une solution en mélangeant doucement 10 microlitres de bleu trypan et 10 microlitres de suspension cellulaire dans un tube de 1,5 millilitre, et incuber pendant une à deux minutes à température ambiante.
Pipette 10 microlitres de la solution dans l’hémocytomètre et le placer sur la scène d’un microscope à contraste de phase inversée pour compter. Les cellules non viables sont bleues tandis que les cellules viables ne sont pas tachées. Comptez les cellules dans au moins deux carrés de la chambre de l’hémocytomètre.
Effectuer une dilution pour obtenir une densité de 2,5 fois 10 à la quatrième cellule par 500 microlitres de milieu d’expansion fibroblaste et de résuspendre la pastille cellulaire. Pipette 500 microlitres de la suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque de 24 puits. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Le matin, retirez l’ancien milieu de chaque puits et remplacez-le par 500 microlitres de milieu de culture sans facteur xéno-libre pré-zarmed. Incuber à 37%celsius sous 5% de dioxyde de carbone pendant au moins six heures. Décongeler cinq aliquots de 15,4 microlitres de cocktail total de reprogrammation nmRNA à température ambiante, puis les placer dans la glace.
Ajouter 234,6 microlitres de sérum réduit moyen à chaque aliquot, pipette doucement trois à cinq fois et étiqueter chacun comme tube A.Label cinq tubes stériles sans RNase de 0,5 millilitre comme tube B et mélanger six microlitres de microférant synthétique rna transfection réavant avec 244 microlitres de sérum moyen réduit. Ensuite, utilisez des pipettes pour ajouter le contenu de chaque tube B à un tube Une goutte sage. Mélanger en tapant sur le fond du tube.
Incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Après cela, pour ajouter 125 microlitres de solution complexe de transfection nmRNA de chacun des cinq aliquots à chaque puits, incliner la plaque et pipette tomber sage dans le milieu. Mélanger le contenu dans les 20 puits en berçant doucement.
Utilisez les quatre autres puits comme référence. Incuber la plaque pendant 15 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, aspirez le médium.
Sous le capot stérile, répétez la procédure de transfection, comme le premier jour, tous les jours pendant trois jours de plus. Le cinquième jour, aspirez le milieu et échangez avec du XF/FF Culture Medium frais et préchauffé sous une hotte stérile. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Surveillez quotidiennement la culture cellulaire au microscope à contraste de phase, jusqu’à ce qu’elle observe la formation de colonies ipsc. Le but de ce protocole était de reprogrammer des fibroblastes cutanés isolés de la peau abdominale utilisant la méthode de reprogrammation non-intégration. Les fibroblastes humains ont dépassé des échantillons de peau abdominale dans un délai d’une semaine de culture et ont atteint 85% de confluence dans les deux semaines.
Les cellules ont été caractérisées par la croissance adhésive sur les plats de culture en plastique, et leur morphologie variait de allongé et en forme de fuseau à aplati et en forme d’étoile. La morphologie fibroblaste et l’arrangement et la culture ont radicalement changé après l’ensemencement sur BMM, quand ils ont acquis une morphologie allongée et disposés pour former de minces structures ramifiés. Les petites colonies étaient déjà visibles dans la culture dès le premier jour de la première transfection et leur taille a augmenté progressivement au fil du temps, tandis que leur nombre a augmenté jusqu’au septième jour, puis est resté stable entre le septième jour et le jour 14, probablement en raison de la fusion de colonies plus petites pour former de plus grandes colonies.
Étant donné que la procédure de reprogrammation a été effectuée à l’aide de supports exempts d’antibiotiques, dans le cas où les conditions stériles n’étaient pas garanties, la contamination microbienne est devenue un problème majeur. Le taux de prolifération et la densité de placage ont un impact sur l’efficacité de reprogrammation, il est donc important de planifier le passage cellulaire et de définir la densité de placage sur la base du taux de prolifération cellulaire. Remplaçant les reagents d’origine animale par des réaménageurs appropriés sans xéno, ce protocole permet la reprogrammation de fibroblastes humains adultes en cellules IPS dans un environnement de culture sans xéno complet qui n’étaient pas leur utilisation clinique.
Les cellules humaines sont une source potentielle d’infection par des agents pathogènes transmissibles par le sang, par conséquent, l’équipement de protection individuelle doit être porté tout au long de la procédure.
