This research was supported in part by a National Research Service Award (T32GM07616) from the National Institute of General Medical Sciences.

1. installation expérimentale et la préparation d&#39;échantillons <ol><li> Fabriquer microtoroids utilisant la lithographie, la gravure, et la fonte de la procédure comme décrit précédemment 6. Fabriquer microtoroids sur le dessus d&#39;une plaquette de silicium (puce) qui ont typiquement un diamètre majeur de 80 à 100 um, et un diamètre mineur de 2 um. </li><li> Se détendre à peu près un mètre de fibre optique monomode (125 um gaine, 4,3 um de diamètre de champ de mode) de sa bobine de fibre. </li><li> Au milieu de la partie déroulée de la fibre optique, la bande un petit segment (2,5 cm) de la couche de polymère autour de la fibre optique en utilisant une pince à dénuder. Note: Ceci est la partie de la fibre optique qui sera utilisé pour coupler la lumière évanescente dans le microtoroid. </li><li> Nettoyez la fibre dénudée avec de l&#39;alcool de l&#39;isopropanol et un non pelucheux lingette. </li><li> Maintenez cette partie de la fibre en place à l&#39;aide d&#39;un support de fibre fait de pinces magnétiques. </li><li> Diluer la fibre dénudée à ~ 500 nm par melting et en tirant à l&#39;aide d&#39;un chalumeau à hydrogène et moteurs pas à pas deux mobiles dans des directions opposées à 60 um / min. Placez la fibre optique à l&#39;intérieur de la partie supérieure de la flamme, qui devrait être ~ 10 mm de hauteur. Arrêter tirant sur la fibre lorsque la transmission à travers la fibre arrête fluctuant, qui peut être surveillée soit visuellement (en regardant la lumière qui est diffusée latéralement à partir du clignotement de fibres sur et en dehors) ou en connectant la fibre à une photodiode qui est fixé à un oscilloscope . </li><li> Cliver une extrémité de la fibre optique et l&#39;insérer dans un adaptateur de fibre nue. Placer cette extrémité de la fibre à l&#39;entrée du photo-récepteur. </li><li> Fibre coupler l&#39;autre extrémité de la bobine de fibre à l&#39;aide d&#39;un laser par le coupleur de fibre optique. </li><li> Placez la puce microtoroid sur un porte-échantillon (acier inoxydable, 37,8 mm x 6,4 mm x 3,2 mm) en utilisant soit époxy ou ruban adhésif double face. </li><li> Monter le porte-échantillon sur une platine de positionnement qui se compose d&#39;une nano 3 axes de positionnement (nanocube) stade (voir la liste d&#39;équipement) sur le dessus d&#39;un micromètre à 3 axes. Effectuer toutes les expériences sur une table optique pneumatique isolé pour minimiser les vibrations. </li><li> Position grossière de la puce de l&#39;échantillon en utilisant le micromètre à 3 axes. </li><li> Alignez les contenant microtoroid puce parallèle à la fibre optique en utilisant la nano-positionneur. Remarque: Aligner le microtoroid à une distance d&#39;une longueur d&#39;onde de la lumière d&#39;entrée (~ 633 nm). Pour la visualisation de ce processus utiliser deux colonnes d&#39;imagerie (tube avec objectif et la caméra objective, voir la liste de l&#39;équipement) positionnée sur le dessus et sur le côté de la puce. </li><li> Optimiser la polarisation de la lumière laser dirigé à travers la fibre optique en utilisant un contrôleur en ligne de polarisation (voir la liste d&#39;équipement) avec un bouton pour ajuster la polarisation. Remarque: la polarisation optimale est obtenue lorsque l&#39;inclinaison mesurée dans la transmission de la fibre optique apparaît le plus étroit. Observez cette trempette sur un oscilloscope (voir l&#39;étape 2.2 pour plus de détails). </li><li> Constructionune chambre d&#39;échantillon par epoxying une lamelle de verre sur la platine porte-échantillon en utilisant une lame de microscope en verre comme un écarteur. Remarque: Un boîtier en plexiglas couvrant l&#39;ensemble de la configuration peut être utile pour minimiser les courants d&#39;air. Une petite ouverture devrait être laissée à la solution pour permettre à pomper à l&#39;aide de tubes. </li><li> Équilibrer thermiquement suspensions de particules ou de solutions aqueuses d&#39;une seule molécule ≥ 1 heure dans un bain d&#39;eau RT (~ 500 ml). Note: Les échantillons sont dilués à la concentration désirée dans des microtubes en utilisant les tampons associés spécifiées par le fabricant, par exemple, PBS ou HEPES. Si aucun événement de liaison est détecté, augmenter la concentration en sel du tampon. </li><li> Vortex particule de solutions contenant (1 ml) pendant environ 2 brièvement sec. </li><li> Injecter des solutions contenant des particules dans la chambre d&#39;échantillon à 1 ml / min en utilisant une pompe à seringue de 1 ml. </li><li> Après la chambre de l&#39;échantillon a rempli, éteignez la pompe seringue. </li><li> Attendre 30 secondes avant que les données d&#39;enregistrement afin de minimiserles effets des vibrations mécaniques résultant de l&#39;écoulement de fluide qui peuvent affecter la mesure. </li></ol> 2. Serrure de fréquence <ol><li> Re-coupler le tore à la fibre optique par déplacement du porte-échantillon avec la nanopositionneur, parce que le couplage sera perturbé en raison de l&#39;injection de fluide. </li><li> Localiser la longueur d&#39;onde de résonance de la microtoroid par le balayage laser d&#39;entrée commandé par ordinateur par le biais d&#39;une variété de longueurs d&#39;onde. Effectuer cette opération par l&#39;envoi d&#39;un signal de tension de forme d&#39;onde triangulaire à un élément piézo-électrique à l&#39;intérieur de l&#39;unité de commande laser qui régule la longueur d&#39;onde du laser. Effectuer des expériences en utilisant la lumière visible (635 nm ± 2,5 nm) car il est faible absorption de la lumière dans l&#39;eau à cette longueur d&#39;onde. </li><li> Mesure de la transmission de la lumière à travers la fibre optique en branchant la sortie de la fibre optique en un photorécepteur auto-équilibré. Branchez la sortie du photorécepteur en un oscilloscope à l&#39;aide d&#39;un câble BNC. Observer on l&#39;oscilloscope que la longueur d&#39;onde de résonance de la microtoroid, la transmission à travers la fibre optique diminue. </li><li> Fixez la sortie du photorécepteur à l&#39;entrée principale du blocage contrôleur de rétroaction (voir la liste d&#39;équipement) via un câble fréquence. </li><li> Exécutez le contrôleur de rétroaction de verrouillage de fréquence en mode de verrouillage automatique à l&#39;aide de verrouillage avec une fréquence de vibration de 2 kHz et une amplitude de l&#39;oscillation de longueur d&#39;onde 19 fm pic haut de. Empiriquement définir les paramètres proportionnelle intégrale dérivés dans la fenêtre du logiciel en utilisant les règles de réglage de Ziegler-Nichols 14. Remarque: Ces valeurs doivent seulement être réglé une fois au début de toutes les expériences. </li><li> Auto-verrouiller la longueur d&#39;onde du laser à la longueur d&#39;onde de résonance de la microtoroid. Effectuez cette étape après remplissage de la chambre d&#39;échantillon. Remarque: Si le changement de longueur d&#39;onde est trop grand, alors le contrôleur de rétroaction perdra serrure et passe automatiquement en mode de balayage afin de localiser l&#39;emplacement de longueur d&#39;onde de résonance. Cette occurs pour décale longueur d&#39;onde supérieure à environ une largeur de raie (au moins 600 FM pour tous les systèmes étudiés ici). </li><li> Enregistrez la sortie du contrôleur de rétroaction à 20 kHz en utilisant une carte d&#39;acquisition de données 24 bits. Exporter les données dans un fichier texte via le logiciel d&#39;acquisition de données. </li></ol> 3. Traitement des données et de l&#39;analyse <ol><li> Transformée de Fourier les données dans MATLAB. </li><li> Passe-bas les données à l&#39;aide d&#39;un &quot;mur de briques&quot; filtre avec une coupure à 1 kHz pour éliminer la fréquence de vibration imposée de 2 kHz (voir code supplémentaire Fichier d&#39;écran 1). </li><li> Encoche calcul de filtrer les données en utilisant une taille de fenêtre de 16 Hz. Note: Ceci est fait pour éliminer les sources connues de bruit, dans ce cas, 60 Hz bruit de ligne électronique et ses harmoniques, ainsi 100 Hz (en venant du pilote laser) et ses harmoniques (voir code supplémentaire Fichier d&#39;écran 1). </li><li> Transformée de Fourier inverse les données dans le domaine temporel. </li><li> Filtre médian les données en utilisant une fenêtretaille de 1001 échantillons (voir code supplémentaire Fichier d&#39;écran 2). </li><li> Repérez des changements progressifs dans la longueur d&#39;onde de résonance à l&#39;aide de l&#39;algorithme de recherche de l&#39;étape-Kerssemakers et al. 15. </li><li> Générer des histogrammes de l&#39;amplitude de chaque étape de liaison. </li><li> Calculer la taille des particules en utilisant l&#39;équation. (1) (voir la discussion). </li></ol>

<ol>
	<li>Lu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+nanoparticle+detection+using+optical+microcavities.">High sensitivity nanoparticle detection using optical microcavities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 5976-5979 (2011).</li><li>Su, J., Goldberg, A. F. G., Stoltz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+detection+of+single+nanoparticles+and+biological+molecules+using+microtoroid+optical+resonators.">Label-free detection of single nanoparticles and biological molecules using microtoroid optical resonators.</a> Light: Science and Applications. , (2016).</li><li>Knight, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single molecule biology. , (2009).</li><li>Jonsson, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+biospecific+interaction+analysis+using+surface+plasmon+resonance+and+a+sensor+chip+technology.">Real-time biospecific interaction analysis using surface plasmon resonance and a sensor chip technology.</a> BioTechniques. 11, 620-627 (1991).</li><li>Vollmer, F., Arnold, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whispering-gallery-mode+biosensing:+label-free+detection+down+to+single+molecules.">Whispering-gallery-mode biosensing: label-free detection down to single molecules.</a> Nat. Methods. 5, 591-596 (2008).</li><li>Armani, D. K., Kippenberg, T. J., Spillane, S. M., Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-Q+toroid+microcavity+on+a+chip.">Ultra-high-Q toroid microcavity on a chip.</a> Nature. 421, 925-928 (2003).</li><li>Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+microcavities.">Optical microcavities.</a> Nature. 424, 839-846 (2003).</li><li>Arnold, S., Khoshsima, M., Teraoka, I., Holler, S., Vollmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shift+of+whispering-gallery+modes+in+microspheres+by+protein+adsorption.">Shift of whispering-gallery modes in microspheres by protein adsorption.</a> Opt. Lett. 28, 272-274 (2003).</li><li>Vollmer, F., Arnold, S., Keng, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+virus+detection+from+the+reactive+shift+of+a+whispering-gallery+mode.">Single virus detection from the reactive shift of a whispering-gallery mode.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 20701-20704 (2008).</li><li>He, L., Ozdemir, S. K., Zhu, J., Kim, W., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+single+viruses+and+nanoparticles+using+whispering+gallery+microlasers.">Detecting single viruses and nanoparticles using whispering gallery microlasers.</a> Nat Nano. 6, 428-432 (2011).</li><li>Dantham, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+detection+of+single+protein+using+a+nanoplasmonic-photonic+hybrid+microcavity.">Label-free detection of single protein using a nanoplasmonic-photonic hybrid microcavity.</a> Nano Lett. 13, 3347-3351 (2013).</li><li>Baaske, M. D., Foreman, M. R., Vollmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+nucleic+acid+interactions+monitored+on+a+label-free+microcavity+biosensor+platform.">Single-molecule nucleic acid interactions monitored on a label-free microcavity biosensor platform.</a> Nat Nanotechnol. 9, 933-939 (2014).</li><li>Su, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Single+Exosome+Detection+Using+Frequency-Locked+Microtoroid+Optical+Resonators.">Label-Free Single Exosome Detection Using Frequency-Locked Microtoroid Optical Resonators.</a> ACS Photonics. (9), 1241-1245 (2015).</li><li>&#197;str&#246;m, K. J., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Feedback systems : an introduction for scientists and engineers. , (2008).</li><li>Kerssemakers, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+dynamics+of+microtubules+at+molecular+resolution.">Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution.</a> Nature. 442, 709-712 (2006).</li><li>Su, T. -. T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Label-free detection of single biological molecules using microtoroid optical resonators. , (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Comme une particule se lie, la longueur d&#39;onde de résonance (λ) du tore augmente. Si une particule délie, la longueur d&#39;onde de résonance diminue en conséquence (un événement step-down). Le diamètre des particules (d) peut être déterminée par des histogrammes de l&#39;amplitude de chaque étape de longueurs d&#39;onde. La hauteur de chaque étape de la longueur d&#39;onde varie en raison de variations de la taille des particules lié et en raison de l&#39;emplacement sur le ...

Des expériences simples de détection moléculaires sont utiles pour réduire la quantité d&#39;analyte utilisé dans des biocapteurs pour la détection précoce de la maladie, et pour examiner les propriétés fondamentales des molécules 3. Ces expériences sont généralement effectuées en utilisant des étiquettes, cependant, étiquettes ne sont pas toujours possible d&#39;obtenir pour une protéine particulière, augmenter le coût, peut perturber les événements à l&#39;étude, et peut être gênant, en particulier pour le temps réel sur le site des expériences ou point de service diagnostics de soins. L&#39;étalon-or actuel biocapteurs sans étiquette est la résonance plasmonique de surface 4, mais les systèmes de résonance de plasmon de surface commerciale ont généralement une limite inférieure de détection typique de l&#39;ordre de nM. Récemment, résonateurs optiques ont émergé comme une technologie prometteuse pour sans étiquette seule molécule biodétection 5. Résonateurs optiques travail basée sur le long terme (NS) confinement de la lumière 6,7. La lumière est évanescentecouplé dans ces dispositifs typiquement via une fibre optique. Lorsque la longueur d&#39;onde de la lumière passant par la fibre correspond à la longueur d&#39;onde de résonance du résonateur, la lumière efficacement couplé au résonateur. Ceci reflète la lumière couplée intérieurement totalement à l&#39;intérieur de la cavité du résonateur à générer un champ évanescent dans le voisinage de la périphérie du résonateur. Comme particules entrent dans le champ évanescent et se lient au résonateur, la longueur d&#39;onde de résonance des changements de résonateur en proportion du volume de la particule 8. En termes de capacité de détection, résonateurs microsphères ont précédemment été utilisé pour détecter la grippe A seule particules de virus (100 nm) 9,10. Récemment, résonateurs optiques microsphères plasmonically améliorée ont été utilisées pour détecter seul sérum albumine bovine molécules oligonucléotides 11 et 8-mères 12, mais cette approche limite la zone de capture des particules à 0,3 um 2 par device. Grandes biocapteurs de la zone de capture sont idéales pour maximiser les chances de détection de particules. Les technologies actuelles à base de solution sans étiquette biocapteurs avec de grandes (&gt; 100 um 2) zones de capture ont été limitées à la détection de particules de polystyrène ≥ 25 nm. Nous avons développé un système de biocapteur sans étiquette basée sur la technologie de résonateur optique connu sous le verrouillage de fréquence optique Whispering évanescent résonateur (fleur) 13 (Figure 1) qui est capable de détecter en temps résolu de molécules simples en solution. FLEUR utilise la longue durée de vie des photons de résonateurs optiques microtoroid combinés à un verrouillage de fréquence commande de rétroaction, la détection équilibrée, et le filtrage de calcul pour détecter de petites particules jusqu&#39;à des molécules de protéines simples. L&#39;utilisation de la fréquence de verrouillage permet au système de toujours suivre la résonance de déplacement de la microtoroid que les particules se lient, sans la nécessité de balayer ou numériser la longueur d&#39;onde de laser surgrandes plages. Les principes de la fleur peuvent être utilisés pour améliorer les capacités de détection des autres techniques, y compris l&#39;amélioration plasmonique. Dans ce qui suit, les procédures pour effectuer FLEUR sont décrits.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="396">
	<tbody>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl63" height="20" style="height:15.0pt;width:99pt" width="132">Tunable diode laser</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Newport</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">TLB-6300</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl63" height="20" style="height:15.0pt;width:99pt" width="132">Laser controller</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Newport</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">TLB-6300-LN</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl63" height="40" style="height:30.0pt;width:99pt" width="132">Frequency locking feedback controller</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Toptica Photonics</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Digilock 110</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl63" height="40" style="height:30.0pt;width:99pt" width="132">Auto-balanced photoreceiver</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Newport</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Model 2007</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl63" height="40" style="height:30.0pt;width:99pt" width="132">In-line polarization controller</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">General Photonics</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">PLC-003-S-90</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl63" height="40" style="height:30.0pt;width:99pt" width="132">24-bit data acquisition card</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">National Instruments</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">NI-PCI-4461</td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl63" height="60" style="height:45.0pt;width:99pt" width="132">Recombinant human interleukin-2</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Pierce Biotechnology</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">R201520</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl63" height="40" style="height:30.0pt;width:99pt" width="132">20 nm polystyrene beads</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Thermo Scientific</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">3020A</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl63" height="40" style="height:30.0pt;width:99pt" width="132">NanoCube XYZ Piezo Stage</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Physik Instrumente</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">P-611.3</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl63" height="20" style="height:15.0pt;width:99pt" width="132">Optical table</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Newport</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">VH3660W-OPT</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl63" height="40" style="height:30.0pt;width:99pt" width="132">Objective lens for imaging column</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Navitar Machine Vision</td>
			<td class="xl64">1-60228</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl63" height="40" style="height:30.0pt;width:99pt" width="132">Imaging column (adaptor tube)</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Navitar Machine Vision</td>
			<td class="xl65">1-60228</td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl63" height="60" style="height:45.0pt;width:99pt" width="132">High-Res CCD camera for imaging column</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Edmund Industrial Optics</td>
			<td class="xl64">NT39244</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free single molecule detection using microtoroid optical resonators

Détecter de faibles concentrations de molécules jusqu&#39;à la limite de la molécule unique a un impact sur des domaines tels que la détection précoce de la maladie, et des études fondamentales sur le comportement des molécules. Techniques simples de détection de molécule utilisent couramment des labels tels que des marqueurs fluorescents ou quantum dots, cependant, les étiquettes ne sont pas toujours disponibles, augmenter le coût et la complexité, et peuvent perturber les événements étudiés. Résonateurs optiques ont émergé comme un moyen prometteur pour détecter des molécules simples, sans l&#39;utilisation d&#39;étiquettes. Actuellement, la plus petite particule détectée par un système de résonateur non-renforcée plasmonically optique nue en solution est un polystyrène 25 nm une sphère. Nous avons développé une technique connue sous le verrouillage de fréquence optique Whispering évanescent résonateur (fleur) qui peut dépasser cette limite et d&#39;atteindre seule détection de molécule sans étiquette en solution aqueuse à 2. Comme échelles force du signal avec un volume de particules, notre travail représente un&gt; 100x improvement dans le rapport signal sur bruit (SNR) sur l&#39;état actuel de la technique. Voici les procédures à l&#39;origine FLEUR sont présentés dans le but d&#39;accroître son utilisation dans le domaine.

Événements de liaison des particules sont clairement vu que les changements de pas semblable à la longueur d&#39;onde de résonance de la microtoroid au fil du temps (figure 2A). Les hauteurs de ces étapes sont présentés sous forme d&#39;histogramme à la figure 2B. Les figures 2-4 montrent des traces représentatives de la liaison des exosomes (de nanovésicules), des billes de silice de 5 nm, et simples humains interleukine-2 molécules, respect...

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Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Simple détection de molécule libre Label-Utilisation Microtoroid optiques résonateurs

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

label-free-single-molecule-detection-using-microtoroid-optical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.1K vues.  California Institute of Technology. We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented. 

Vidéo: Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

Multiplexée unique molécule mesures Protéolyse forcer l&#39;utilisation de pinces magnétiques

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

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A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

Une approche recombinaison Cre-Lox P pour la détection de la fusion cellulaire In Vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Sans contact, sans étiquette de surveillance des cellules et la matrice extracellulaire en utilisant la spectroscopie Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Détection optique de<em&gt; E. coli</em&gt; Bactérie par mésoporeux Silicon biocapteurs

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma membrane1. To regulate neuronal excitability, the biophysical properties of ion channels are modified by signaling proteins and molecules, which often bind to the channels themselves to form a heteromeric channel complex2,3. Traditional assays examining the interaction between channels and regulatory proteins require exogenous labels that can potentially alter the protein&#39;s behavior and decrease the physiological relevance of the target, while providing little information on the time course of interactions in living cells. Optical biosensors, such as the X-BODY Biosciences BIND Scanner system, use a novel label-free technology, resonance wavelength grating (RWG) optical biosensors, to detect changes in resonant reflected light near the biosensor. This assay allows the detection of the relative change in mass within the bottom portion of living cells adherent to the biosensor surface resulting from ligand induced changes in cell adhesion and spreading, toxicity, proliferation, and changes in protein-protein interactions near the plasma membrane. RWG optical biosensors have been used to detect changes in mass near the plasma membrane of cells following activation of G protein-coupled receptors (GPCRs), receptor tyrosine kinases, and other cell surface receptors. Ligand-induced changes in ion channel-protein interactions can also be studied using this assay. In this paper, we will describe the experimental procedure used to detect the modulation of Slack-B sodium-activated potassium (KNa) channels by GPCRs.

Optical biosensor techniques can detect changes in mass near the plasma membrane in living cells and allow one to follow cellular responses in both individual cells and populations of cells. This protocol will describe detection of the modulation of potassium channels by G-protein coupled receptors in intact cells using this approach.

L&#39;utilisation de biocapteurs optiques sans étiquette pour détecter la modulation de potassium par les canaux G récepteurs couplés aux protéines

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipulation de molécules d&#39;ARN simple par pinces optiques

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

Une biopuce microfluidique électrochimique à base d&#39;analyse ADN hybridation Sans étiquette

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

Une technique Label-free pour l&#39;imagerie spatio-temporelle de cellule unique sécrétions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Bilayers seule molécule microscopie à fluorescence sur Planar pris en charge

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Multicolor détection Fluorescence pour Droplet microfluidique utilisant des fibres optiques

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...