Les auteurs tiennent à remercier le professeur Andrea Armani à l&#39;Université de Californie du Sud pour le soutien pendant le temps de ce protocole a été développé. Financement pour le développement initial de ce travail a été fourni par la National Science Foundation [085281 et 1028440] et l&#39;Institut national de la santé par le biais du directeur des NIH Programme Innovateur Prix Nouveau [1DP2OD007391-01]. Des informations complémentaires sont disponibles à <a href="http://web.missouri.edu/~hunthk/" target="_blank">http://web.missouri.edu/ ~ hunthk /</a> .

1. Fond La biotine est fixée à la surface de ces dispositifs par un simple, en trois étapes (figure 1). Tout d&#39;abord, on nettoie la surface et le remplir avec des groupes hydroxyles en exposant les appareils à plasma d&#39;oxygène soit ou d&#39;une solution piranha. Deuxièmement, on utilise dépôt en phase vapeur pour fixer l&#39;agent de couplage silane terminé par une amine primaire pour les groupes hydroxyle par hydrolyse et réaction de condensation. Troisièmement, nous attachons la biotine à la surface par l&#39;intermédiaire de N-hydroxysuccinimide (NHS) de la chimie ester. Nous renvoyons le lecteur intéressé à notre travail précédent pour plus d&#39;informations sur le développement de ces techniques, ainsi qu&#39;une explication de notre motivation pour le choix de ces techniques. 8 Le succès de ces réactions peut être évalué par microscopie optique et la fluorescence après l&#39;addition de l&#39;amine primaire, ainsi que, après l&#39;addition de la biotine. Alors m optiqueicroscopy peut être utilisé pour déterminer si les protocoles de fonctionnalisation de surface entraîné des dégâts à la surface des microsphères, ou même la contamination, microscopie à fluorescence est utilisée pour vérifier la qualité et l&#39;uniformité de la couverture de surface de la molécule de biotine, ainsi que la capacité de la biotine sur la surface à lier avec (strept) avidine. À évaluer la couverture d&#39;amines sur la surface, on utilise l&#39;isothiocyanate de fluorescéine (FITC) colorant fluorescent, qui réagit avec des amines primaires pour former stables, liaison thiourée covalente à la microsphère. Rouge Texas colorant fluorescent qui a été conjugué à l&#39;avidine est utilisé pour marquer les groupes biotine sur la surface à travers l&#39;interaction biotine-avidine. Dans les deux cas, les colorants ont été choisis qui peuvent interagir (par le biais soit interactions récepteur-ligand ou liaison covalente) avec les groupes fonctionnels sur la surface. Ici, l&#39;agent de couplage silane, qui a trois groupes partants et un groupe fonctionnel, fournit le pari pontWeen la surface inorganique et organique molécule sonde. La fonction amine primaire réagit quantitativement avec des esters NHS pour former des liaisons amide stables. Dans ce cas, nous utilisons une molécule sonde biotine dont la chaîne latérale valérique a été modifiée avec un groupe ester de NHS. Réaliste, une molécule sonde à laquelle un groupe ester de NHS peut être ajouté à la surface en utilisant des protocoles suivants. En outre, ces protocoles sont d&#39;ordre général, et peut être utilisé pour fonctionnaliser une surface du dispositif de silice avec de la biotine. Le principal défi de ces protocoles n&#39;est pas réellement dans la chimie elle-même, mais plutôt dans la manipulation des microsphères de silice. S&#39;il vous plaît noter que, tout au long des protocoles, les microsphères doivent être manipulés par leurs tiges grapsing légèrement avec forte à bout des pincettes. Cela permet de maintenir la pince à épiler bien loin de la microsphères eux-mêmes, et permet un transport facile entre les étapes. De nombreuses étapes dans le protocole ci-dessous sont spécifiquement conçus pour répondre à cet état de faitou. 2. Fabrication des microsphères <ol><li> Construire le boîtier de stockage pour les microsphères. <ol><li> L&#39;utilisation d&#39;un couteau exacto, couper un ¼ dans la pièce de carton épais en un 1 po x 1 po carré; la bande de ce sur une lame de verre de taille normale, et joindre un 1 dans la section de scotch, avec ses extrémités se rencontrent pour former un rouleau , sur le carton. </li><li> Cela crée une plate-forme sur laquelle la microsphère peut être élevé et isolé du milieu environnant, et prévient les dommages à leur surface. </li></ol></li><li> Avec des ciseaux, couper une section de 3 pouces de la fibre optique à partir d&#39;une bobine de fibre optique. </li><li> Utilisation d&#39;un n-Nik fibres décapant, dénuder le revêtement protecteur polymère à partir des 0,5 derniers centimètres de l&#39;extrémité de la pièce de coupe de la fibre, en laissant seulement le noyau de silice. Nettoyer la surface de n&#39;importe quel polymère restant avec un Kimwipe humidifié avec du méthanol en essuyant délicatement la fibre avec le Kimwipe. </li><li> En utilisant une fibre nue couperet, couper l&#39;extrémité dénudée afin èmeà seulement environ 1 millimètre de fibre dénudée reste sur l&#39;extrémité de la fibre. </li><li> Placer l&#39;extrémité dénudée de la fibre optique dans le trajet d&#39;un laser à CO 2, en prenant soin de la fibre aligner verticalement de telle sorte que son extrémité dénudée est orienté vers le bas. </li><li> Allumer le laser à CO 2, et la diriger vers la surface de l&#39;extrémité dénudée de la fibre optique. Le laser va fondre l&#39;extrémité dénudée de la fibre dans une sphère à l&#39;aide d&#39;environ 3,5% en puissance de 2 secondes. </li><li> Utilisation pinces, soigneusement saisir la tige (la partie non dénudée de la fibre optique) de la microsphère. Fixer la tige à la rouleau de ruban adhésif sur le boîtier de la microsphère. La lame de verre peut être lui-même stocké dans une boîte de Pétri. Cela permet pour le stockage sûr de la microsphère. </li></ol> 3. Remplissage de la surface avec des groupes hydroxyles <ol><li> Grâce à la solution piranha: <ol><li> Dans un flacon de 60 ml en polypropylène avec un bouchon à charnière, préparer une solution piranha (70:30 en volume fumant H <sub&gt; 2 SO 4: H 2 O 2 (30% en poids)) par addition de 5 ml de peroxyde d&#39;hydrogène dans le flacon, suivie par 11,6 ml d&#39;acide sulfurique fumant. ATTENTION: porter des gants résistant aux acides. </li><li> Transférer la lame de verre, contenant au moins 1 microsphère, dans le flacon. Microsphère doit être en contact avec le liquide, mais que le liquide ne doit pas toucher le carton. Réglez le volume de la solution si nécessaire. </li><li> Retirez délicatement la lame de verre du flacon, et l&#39;insérer dans un autre flacon en plastique contenant DDI H 2 O. Laissez les échantillons s&#39;asseoir dans la solution pendant 5 minutes. </li><li> Retirez délicatement la lame de verre du flacon, et placez-le au four à 80 ° C pendant 10 minutes pour sécher la surface. </li></ol></li><li> Utilisation de traitement au plasma d&#39;oxygène: <ol><li> Transférer la lame de verre contenant au moins une microsphére à la chambre de plasma d&#39;oxygène. </li><li> Régler la pression d&#39;oxygène à 200 mTorr, et la puissance à 120 W. Exposer l&#39;échantillon à plasma d&#39;oxygène pour les 2 minutes. </li><li> Retirez la lame de verre de la chambre à plasma. </li></ol></li></ol> 4. Fixation agents de couplage silane à la surface <ol><li> Placer la lame de verre, contenant au moins une microsphére, dans un dessiccateur à vide dans une hotte. </li><li> Egalement dans la hotte, ouvrir la bouteille de couplage au silane agent (dans ce cas, l&#39;aminopropyltriméthoxysilane (APTMS) a été utilisé), et placez la bouteille ouverte dans le dessiccateur. </li><li> Replacez le couvercle sur le dessiccateur à vide, et joindre le port de sortie à un aspirateur ou d&#39;une ligne vide la maison. </li><li> Allumez le vide maison ou la ligne d&#39;eau, et d&#39;évacuer le dessiccateur sous vide. Une fois une étanchéité au vide est formée entre le couvercle et la base, commence minuter la réaction. Cela déposer l&#39;agent de couplage silane sur la surface en tant que film mince. </li><li> Après 15 minutes, éteignez le vide, et ouvrir lentement le port pour laisser l&#39;air dans le dessiccateur. Pour cet agent de couplage, à 15 minutes est suffisante pour former une unifomonocouche rm sur la surface. Pour d&#39;autres agents de couplage, le temps peut être nécessaire d&#39;ajuster. </li></ol> 5. Fixation biotine à la surface <ol><li> Environ une heure avant de fixer la biotine, préparer une solution de 10 mM de N-hydroxysuccinimide de biotine (NHS-biotine) dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) anhydre dans un flacon 60 ml en polypropylène avec un bouchon à charnière. <ol><li> Si le NHS-biotine a été stockée à froid, le laisser se stabiliser à la température ambiante avant de le masser sur. </li><li> Sonication de la solution pendant 1 heure pour dissoudre complètement la poudre NHS-biotine dans le solvant. </li></ol></li><li> Transférer la lame de verre contenant de la microsphère dans un autre flacon en matière plastique, avec les microsphères au fond, et les tiges dans la partie supérieure du flacon. </li><li> Transfert, à l&#39;aide d&#39;une pipette en plastique, un volume approprié de la solution NHS-biotine sur le côté de la fiole, derrière la lame de verre (façon la solution ne touche pas la microsphère telle qu&#39;elle est ajouté à la fiole). Unejj solution suffisante pour couvrir la surface des microsphères. </li><li> Placer les flacons contenant les microsphères maintenant et NHS-biotine dans une solution DMSO sur un incubateur à bascule (plateaux basculants) pendant 30 minutes à température ambiante, avec la vitesse et l&#39;angle d&#39;inclinaison à 5 tours par minute et 5 degrés, respectivement. </li><li> Retirez délicatement la lame de verre du flacon, et doucement glisser dans un autre flacon rempli de DDI H O. 2 Placez le flacon sur le plateau d&#39;inclinaison pour un autre 10 minutes à la même vitesse et l&#39;angle d&#39;inclinaison comme avant. Répétez cette étape deux fois avec de l&#39;eau fraîche à chaque fois. Cela permet de supprimer le DMSO excès de la surface, et supprime toute la biotine physiquement adsorbée qui n&#39;a pas fait greffé à la surface. </li><li> Retirer la lame de verre de la fiole, et le placer dans une étuve à 80 ° C pendant 10 minutes, ou jusqu&#39;à ce que toutes les gouttelettes d&#39;eau sont éliminées de la surface. </li></ol> 6. Marquage fluorescent de terminaison amine de silice <ol><li> Pour étiqueter les groupes amine présents après traitement avec APTMS, préparer la solution de FITC dans une pièce sombre en dissolvant 1 mg FITC dans 1 ml de DMSO anhydre. </li><li> Diluer la solution dans 6,1 par addition de 50 pl de la solution de FITC à 1 mL de 0,1 M de tampon bicarbonate de sodium. </li><li> Placer la solution dans un flacon 60 ml en polypropylène avec un bouchon à charnière, et faites glisser doucement les microsphères à terminaison amine, logé à nouveau sur la lame de verre, dans le flacon. </li><li> Placez le flacon dans un bain de glace, et de laisser l&#39;échantillon réagissent avec la solution FITC pour un minimum de 4 heures dans l&#39;obscurité. </li><li> Retirer l&#39;excès fluorophore travers deux rinçages, 10 minute de l&#39;microsphères dans un tampon carbonate de sodium. Comme auparavant, remplir un flacon 60 ml en polypropylène avec un bouchon à charnière avec le tampon, et faites glisser doucement la lame de verre dans la solution, en prenant soin que la solution ne couvre que la microsphère, et non pas le boîtier en carton. Couvrir le flacon avec une feuille d&#39;aluminium, et placez le flacon sur un plateau d&#39;inclinaison fixé à 5 degrés et 5 tours, comme avant. </li><li> Retirez délicatement la lame de verre du flacon, et doucement glisser dans un autre flacon rempli de DDI H 2 O et recouverts d&#39;une feuille d&#39;aluminium. Placez le flacon sur le plateau d&#39;inclinaison pour un autre 10 minutes à la même vitesse et l&#39;angle d&#39;inclinaison comme avant. Répétez cette étape deux fois avec de l&#39;eau fraîche à chaque fois. Cela permet de supprimer l&#39;excédent de teinture de la surface. </li><li> Retirez délicatement la lame de verre du flacon, et au sec dans un four réglé à 80 ° C pendant 10 minutes avant l&#39;imagerie. </li></ol> 7. Marquage fluorescent de la biotine-terminée par de la silice <ol><li> Préparer une solution à 10 pg / ml du Texas-Red avidine en tampon phosphate salin. </li><li> Ajouter la solution à un flacon polypropylène 60 ml avec un couvercle articulé, et lentement coulisser la lame de verre contenant une microsphère biotine à terminaison dans la solution, de sorte que la microsphère est juste recouverte par la solution. </li><li> Réagir pendant 30 minutes à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Retirer fluorophore en excès par deux, 10 minutes de rinçages des microsphères dans du tampon PBS. <ol><li> Comme auparavant, remplir un flacon 60 ml en polypropylène avec un bouchon à charnière avec le tampon, et faites glisser doucement la lame de verre dans la solution, en prenant soin que la solution ne couvre que la microsphère, et non pas le boîtier en carton. </li><li> Couvrir le flacon avec une feuille d&#39;aluminium, et placez le flacon sur un plateau d&#39;inclinaison fixé à 5 degrés et 5 tours, comme avant. </li></ol></li><li> Retirez délicatement la lame de verre du flacon, et doucement glisser dans un autre flacon rempli de DDI H 2 O et recouverts d&#39;une feuille d&#39;aluminium. Placez le flacon sur le plateau d&#39;inclinaison pour un autre 10 minutes à la même vitesse et l&#39;angle d&#39;inclinaison comme avant. Répétez cette étape deux fois avec de l&#39;eau fraîche à chaque fois. Cela permet de supprimer l&#39;excédent de teinture de la surface. </li><li> Retirez délicatement la lame de verre du flacon, et au sec dans un four réglé à 80 ° C pendant 10 minutes avant l&#39;imagerie. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs Microsphère correctement fonctionnalisés peuvent être identifiés par microscopie optique et de fluorescence. Si la fonctionnalisation de surface est fait correctement, il devrait aboutir à une couverture homogène et dense de molécules de biotine sur la surface, et la surface doit rester défaut et exempt de contaminants après fonctionnalisation afin de maintenir leurs sensibilités élevées au cours des expériences de détection. La microscopie optique peut être utilisé pour sonder ce dernier, tandis que la microscopie fluorescente permet de sonder la qualité et l&#39;uniformité de la couverture de surface. Dans la figure 2, nous montrons des exemples de microsphères correctement fonctionnalisé. Ces images montrent qu&#39;il n&#39;y a pas endommager la surface ou la contamination due à la fonctionnalisation (fig. 2a), et que les microsphères montrent un uniforme, une couverture uniforme de groupes amine soit (fig. 2b) ou des groupes biotine (figure 2c) sur la surface . Si les microsphères ont pas été correctement fonctionnalisés, la microsphère optique des images will présentent une contamination de surface, la couverture agglutination ou non uniforme, et les défauts évidents dans la surface, comme des fissures de surface (Figure 3). Ici, nous voyons un exemple courant de la contamination de surface, résultant de l&#39;agglutination des réactifs à la surface. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma réactionnel 3-étape pour la fixation des molécules sondes à la surface de microsphères de silice. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3866/3866fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig2.jpg" /> Figure 2. Microsphères de silice. une micrographie) optique de microsphères de silice peuplée avec des groupes hydroxyles par l&#39;exposition à un plasma d&#39;oxygène; b) Micrographie fluorescent de microsphères de silice peuplée avec des amines primaires et marqué au FITC colorant; c) micrographie fluorescent de silice microsphere peuplée avec de la biotine et étiquetés au Texas Red-avidine conjuguée. Reproduit avec la permission de Soteropulos, CE, Hunt, HK &amp; Armani, AM Détermination de la cinétique de liaison en utilisant chuchotant microcavités mode de galerie. Appl. Phys. Lett. 99, 103703 à 103703 (2011). Copyright 2011, American Institute of Physics 17. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig3.jpg" /> Figure 3. Micrographie optique de la sphère mal fonctionnalisés. Ici, vous pouvez voir la poussière sur la surface en haut à droite, ainsi que la contamination s&#39;étend hors de la surface. En outre, le côté droit de la microsphère optique présente une motte de terre petite à la surface.

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	<li>Datar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cantilever+Sensors:+Nanomechanical+Tools+for+Diagnostics.">Cantilever Sensors: Nanomechanical Tools for Diagnostics.</a> MRS Bull. 34, 449-454 (2009).</li><li>Hunt, H. K., Armani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biological+and+chemical+sensors.">Label-free biological and chemical sensors.</a> Nanoscale. 2, 1544-1559 (2010).</li><li>Sundberg, F., Karlsson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+and+characterization+of+immune+responses+using+label-free+biacore+immunoassays.">Rapid detection and characterization of immune responses using label-free biacore immunoassays.</a> Immunology. 120, 46-47 (2007).</li><li>Hermanson, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioconjugate Techniques. , (2008).</li><li>Bernards, M. T., Cheng, G., Zhang, Z., Chen, S. F., Jiang, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonfouling+polymer+brushes+via+surface-initiated,+two-component+atom+transfer+radical+polymerization.">Nonfouling polymer brushes via surface-initiated, two-component atom transfer radical polymerization.</a> Macromolecules. 41, 4216-4219 (2008).</li><li>Fan, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+optical+biosensors+for+unlabeled+targets:+A+review.">Sensitive optical biosensors for unlabeled targets: A review.</a> Anal. Chim. Acta. 620, 8-26 (2008).</li><li>Qavi, A. J., Washburn, A. L., Byeon, J. Y., Bailey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+technologies+for+quantitative+multiparameter+biological+analysis.">Label-free technologies for quantitative multiparameter biological analysis.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 394, 121-135 (2009).</li><li>Hunt, H. K., Soteropulos, C., Armani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioconjugation+Strategies+for+Microtoroidal+Optical+Resonators.">Bioconjugation Strategies for Microtoroidal Optical Resonators.</a> Sensors. 10, 9317-9336 (2010).</li><li>Kalia, J., Raines, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Bioconjugation.">Advances in Bioconjugation.</a> Curr. Org. Chem. 14, 138-147 (2010).</li><li>Matsko, A. B., Savchenkov, A. A., Strekalov, D., Ilchenko, V. S., Maleki, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+Applications+of+Whispering-Gallery+Mode+Resonators+in+Photonics+and+Nonlinear+Optics.">Review of Applications of Whispering-Gallery Mode Resonators in Photonics and Nonlinear Optics.</a> IPN Progress Report. , 42-162 (2005).</li><li>Armani, A. M., Kulkarni, R. P., Fraser, S. E., Flagan, R. C., Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free,+single-molecule+detection+with+optical+microcavities.">Label-free, single-molecule detection with optical microcavities.</a> Science. 317, 783-787 (2007).</li><li>Zhu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+single+nanoparticle+detection+and+sizing+by+mode+splitting+in+an+ultrahigh-Q+microresonator.">On-chip single nanoparticle detection and sizing by mode splitting in an ultrahigh-Q microresonator.</a> Nat. Photon. 4, 122-122 (2010).</li><li>Armani, D. K., Kippenberg, T. J., Spillane, S. M., Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-Q+toroid+microcavity+on+a+chip.">Ultra-high-Q toroid microcavity on a chip.</a> Nature. 421, 925-928 (2003).</li><li>Vollmer, F., Arnold, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whispering-gallery-mode+biosensing:+label-free+detection+down+to+single+molecules.">Whispering-gallery-mode biosensing: label-free detection down to single molecules.</a> Nat. Methods. 5, 591-596 (2008).</li><li>Vollmer, F., Arnold, S., Keng, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+virus+detection+from+the+reactive+shift+of+a+whispering+gallery+mode.">Single virus detection from the reactive shift of a whispering gallery mode.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20701-20704 (2008).</li><li>Hunt, H. K., Armani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+microcavity+optical+biosensors.">Recycling microcavity optical biosensors.</a> Opt. Lett. 36, 1092-1094 (2011).</li><li>Soteropulos, C. E., Hunt, H. K., Armani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+binding+kinetics+using+whispering+gallery+mode+microcavities.">Determination of binding kinetics using whispering gallery mode microcavities.</a> Appl. Phys. Lett. 99, 103703-103703 (2011).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Comme décrit dans les protocoles, nous avons créé une plate-forme de logement qui pour transporter les microsphères de silice par leurs tiges tout au long du processus de fonctionnalisation. Cette plate-forme de logement a été créé comme une solution à la contamination de surface et les dommages qui ont résulté de la microsphère entrer en contact avec les parois des récipients divers utilisés dans le procédé de fonctionnalisation. Nous avons réalisé la principale difficulté résulte de constamment att...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Le méthanol </td><td> Pêcheur </td><td> 67-56-1 </td><td> Qualité ACS </td></tr><tr><td> Acide sulfurique </td><td> Pêcheur </td><td> 8014-95-7 </td><td> Fumant </td></tr><tr><td> Peroxyde d&#39;hydrogène </td><td> Pêcheur </td><td> 7722-84-1 </td><td> 30% en poids </td></tr><tr><td> Aminopropyltriméthoxysilane </td><td> Pêcheur </td><td> 13822-56-5 </td><td></td></tr><tr><td> NHS-biotine linker EZ </td><td> Percer </td><td> 20217 </td><td></td></tr><tr><td> Diméthylsulfoxyde </td><td> Pêcheur </td><td> 67-68-5 </td><td> Anhydre </td></tr><tr><td> Isothiocyanate de fluorescéine </td><td> Percer </td><td> 46425 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline </td><td> Pêcheur </td><td> 7647-14-5 </td><td> Concentré de poudre </td></tr><tr><td> Tampon bicarbonate de sodium </td><td> Pêcheur </td><td> NC0099321 </td><td></td></tr><tr><td> Texas Red - avidine conjugué </td><td> Percer </td><td> A820 </td><td></td></tr><tr><td> Fibre Optique </td><td> Newport </td><td> F-SC </td><td></td></tr><tr><td> Décapant fibre </td><td> Les ventes d&#39;instruments à fibre </td><td> NN-175 </td><td> Non-Nik 175 um décapant </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> Pêcheur </td><td> 06666A </td><td></td></tr><tr><td> Bare Fiber Cleaver </td><td> Ilsintech </td><td> Cl-03A </td><td></td></tr><tr><td> Lames de microscope </td><td> Pêcheur </td><td> 12-550B </td><td></td></tr><tr><td> Flacons en polypropylène </td><td> Pêcheur </td><td> 03-341-75A </td><td> 60 ml, avec bouchon à charnière </td></tr><tr><td> Incubation Rocker </td><td&gt; VWR </td><td> 12620-910 </td><td></td></tr><tr><td> Dessiccateur à vide </td><td> Pêcheur </td><td> 08-594-15B </td><td></td></tr></tbody></table>

attaching biological probes to silica optical biosensors using silane coupling agents

Pour l&#39;interface avec les milieux biologiques, les plates-formes de biocapteurs, tels que le populaire système Biacore (basé sur la résonance plasmonique de surface (SPR) technique), faire usage des diverses techniques de modification de surface, qui peuvent, par exemple, de prévenir l&#39;encrassement de surface, régler le hydrophobie / hydrophilie de la surface, de s&#39;adapter à une variété d&#39;environnements électroniques, et le plus souvent, induisent une spécificité vers une cible d&#39;intérêt. 1-5 Ces techniques d&#39;étendre les fonctionnalités de biocapteurs par ailleurs très sensibles aux applications du monde réel dans des environnements complexes, tels que le sang, l&#39;urine, et l&#39;analyse des eaux usées. 2,6-7 Alors que les plates-formes de biodétection commerciaux, tels que Biacore, ont bien compris, des techniques standard pour effectuer des modifications de surface tels, ces techniques n&#39;ont pas été traduits de manière standardisée à d&#39;autres étiquettes plates-formes libres biocapteurs, comme Whispering Gallery Mode (WGM) résonateurs optiques. 8-9 moins de<html> / P&gt; Résonateurs optiques WGM représentent une technologie prometteuse pour effectuer sans étiquette de détection d&#39;une grande variété d&#39;espèces à ultra-faibles concentrations 6,10-12 La grande sensibilité de ces plates-formes est le résultat de leurs uniques optique géométrique:. WGM optique résonateurs confinent circulation . la lumière à des fréquences de résonance spécifiques, intégrés 13 Comme les plates-formes SPR, le domaine de l&#39;optique n&#39;est pas totalement confiné au dispositif de capteur, mais evanesces; cette &quot;queue évanescente&quot; peut alors interagir avec des espèces dans le milieu environnant. Cette interaction provoque l&#39;indice de réfraction effectif du champ optique à modifier, résultant en une légère, mais détectable, décaler la fréquence de résonance du dispositif. Parce que le champ optique circule, il peut interagir plusieurs fois avec l&#39;environnement, ce qui entraîne une amplification du signal intrinsèque, et des sensibilités très élevées à des changements mineurs dans l&#39;environnement. 2,14-15 tente &quot;&gt; Pour effectuer une détection ciblée dans des environnements complexes, ces plates-formes doit être couplé avec une molécule sonde (généralement la moitié d&#39;une paire de liaison, par exemple des anticorps ou antigènes) à travers la modification de surface. 2 Bien que résonateurs optiques WGM peut être fabriqué en différentes géométries de une série de systèmes matériels, la microsphère de silice est le plus commun. ces microsphères sont généralement fabriqué sur l&#39;extrémité d&#39;une fibre optique, qui fournit une «stem» par lequel les microsphères peuvent être traitées au cours des expériences de fonctionnalisation et de détection. chimie de surface de silice peut appliquer à fixer des molécules de sonde à leurs surfaces, mais les techniques traditionnelles générés pour des substrats planes sont souvent pas suffisant pour ces structures tridimensionnelles, que toute modification apportée à la surface des microsphères (poussières, la contamination, des défauts de surface, et les revêtements inégales) peut avoir de graves, les conséquences négatives sur leurs capacités de détection. Ici, nous démontrons une approche facilepour la fonctionnalisation de surface de résonateurs de silice WGM microsphères optiques utilisant des agents de couplage silane pour combler la surface inorganique et l&#39;environnement biologique, en attachant la biotine à la surface de silice. 8,16 Bien que nous utilisions des résonateurs de silice microsphères WGM que le système de capteur dans le présent rapport, les protocoles sont générale et peut être utilisé pour fonctionnaliser la surface d&#39;un dispositif de silice avec de la biotine.

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Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

Biocapteurs s&#39;interfacer avec des environnements complexes et biologiques et effectuer une détection ciblée en combinant des capteurs très sensibles avec des sondes très spécifiques attachés à la sonde par l&#39;intermédiaire d&#39;une modification de surface. Ici, on démontrer la fonctionnalisation de la surface de capteurs optiques en silice avec de la biotine en utilisant des agents de couplage silane pour combler le capteur et le milieu biologique.

Fixation des sondes biologiques à des biocapteurs optiques de silice à l&#39;aide d&#39;agents de couplage au silane

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.8K vues.  University of Missouri. Biocapteurs s'interfacer avec des environnements complexes et biologiques et effectuer une détection ciblée en combinant des capteurs très sensibles avec des sondes très spécifiques attachés à la sonde par l'intermédiaire d'une modification de surface. Ici, on démontrer la fonctionnalisation de la surface de capteurs optiques en silice avec de la biotine en utilisant des agents de couplage silane pour combler le capteur et le milieu biologique.

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Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

Greffes d&#39;ingénierie biologique vasculaire basé sur l&#39;aide d&#39;un bioréacteur pulsatile

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Recherche

Bio-ingénierie

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Conception d&#39;un bioréacteur pour la pression cyclique Ex Vivo Étude des valves cardiaques aortiques

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the monitoring of therapeutic efficiency.1-3 The circulating low molecular weight proteome (LMWP) composed of small proteins shed from tissues and cells or peptide fragments derived from the proteolytic degradation of larger proteins, has been associated with the pathological condition in patients and likely reflects the state of disease.4,5 Despite these potential clinical applications, the use of Mass Spectrometry (MS) to profile the LMWP from biological fluids has proven to be very challenging due to the large dynamic range of protein and peptide concentrations in serum.6 Without sample pre-treatment, some of the more highly abundant proteins obscure the detection of low-abundance species in serum/plasma. Current proteomic-based approaches, such as two-dimensional polyacrylamide gel-electrophoresis (2D-PAGE) and shotgun proteomics methods are labor-intensive, low throughput and offer limited suitability for clinical applications.7-9 Therefore, a more effective strategy is needed to isolate LMWP from blood and allow the high throughput screening of clinical samples. 
Here, we present a fast, efficient and reliable multi-fractionation system based on mesoporous silica chips to specifically target and enrich LMWP.10,11 Mesoporous silica (MPS) thin films with tunable features at the nanoscale were fabricated using the triblock copolymer template pathway. Using different polymer templates and polymer concentrations in the precursor solution, various pore size distributions, pore structures, connectivity and surface properties were determined and applied for selective recovery of low mass proteins. The selective parsing of the enriched peptides into different subclasses according to their physicochemical properties will enhance the efficiency of recovery and detection of low abundance species. In combination with mass spectrometry and statistic analysis, we demonstrated the correlation between the nanophase characteristics of the mesoporous silica thin films and the specificity and efficacy of low mass proteome harvesting. The results presented herein reveal the potential of the nanotechnology-based technology to provide a powerful alternative to conventional methods for LMWP harvesting from complex biological fluids. Because of the ability to tune the material properties, the capability for low-cost production, the simplicity and rapidity of sample collection, and the greatly reduced sample requirements for analysis, this novel nanotechnology will substantially impact the field of proteomic biomarker research and clinical proteomic assessment.

We developed a technology based on mesoporous silica thin film for the selective recovery of low molecular weight proteins and peptides from human serum. The physico-chemical properties of our mesoporous chips were finely tuned to provide substantial control in peptide enrichment and consequently profile the serum proteome for diagnostic purposes.

Faible enrichissement moléculaire des protéines de poids sur les films minces de silice mésoporeuse de recherche de biomarqueurs

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive

Microelectrode arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film polymer are expected to have extended functional lifetime because the flexible material may minimize adverse tissue response caused by micromotion. However, their flexibility prevents them from being accurately inserted into neural tissue. This article demonstrates a method to temporarily attach a flexible microelectrode probe to a rigid stiffener using biodissolvable polyethylene glycol (PEG) to facilitate precise, surgical insertion of the probe. A unique stiffener design allows for uniform distribution of the PEG adhesive along the length of the probe. Flip-chip bonding, a common tool used in microelectronics packaging, enables accurate and repeatable alignment and attachment of the probe to the stiffener. The probe and stiffener are surgically implanted together, then the PEG is allowed to dissolve so that the stiffener can be extracted leaving the probe in place. Finally, an in vitro test method is used to evaluate stiffener extraction in an agarose gel model of brain tissue. This approach to implantation has proven particularly advantageous for longer flexible probes (&gt;3 mm). It also provides a feasible method to implant dual-sided flexible probes. To date, the technique has been used to obtain various in vivo recording data from the rat cortex.

Insertion of flexible neural microelectrode probes is enabled by attaching probes to rigid stiffeners with polyethylene glycol (PEG). A unique assembly process ensures uniform and repeatable attachment. After insertion into tissue, the PEG dissolves and the stiffener is extracted. An in vitro test method evaluates the technique in agarose gel.

Insertion de flexible Neural sondes utilisant renforts rigides attachés avec Biodissolvable adhésif

Microelectrode  arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film  polymer are expected to have extended functional lifetime ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Détection optique de<em&gt; E. coli</em&gt; Bactérie par mésoporeux Silicon biocapteurs

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic imaging. In medical applications, one of the major limitations of optical sensing technology is its susceptibility to environmental conditions, e.g. changes in pressure and temperature, which may saturate the detection. Additionally, the clinical environment often imposes stringent limits on the size and robustness of the sensor. In this work, the combination of pulse interferometry and fiber-based optical sensing is demonstrated for ultrasound detection. Pulse interferometry enables robust performance of the readout system in the presence of rapid variations in the environmental conditions, whereas the use of all-fiber technology leads to a mechanically flexible sensing element compatible with highly demanding medical applications such as intravascular imaging. In order to achieve a short sensor length, a pi-phase-shifted fiber Bragg grating is used, which acts as a resonator trapping light over an effective length of 350 &#181;m. To enable high bandwidth, the sensor is used for sideway detection of ultrasound, which is highly beneficial in circumferential imaging geometries such as intravascular imaging. An optoacoustic imaging setup is used to determine the response of the sensor for acoustic point sources at different positions.

Optical detection of ultrasound is impractical in many imaging scenarios because it often requires stable environmental conditions. We demonstrate an optical technique for ultrasound sensing in volatile environments with miniaturization and sensitivity levels appropriate for optoacoustic imaging in restrictive scenarios, e.g. intravascular applications.

Wideband détecteur optique des ultrasons pour les applications d&#39;imagerie médicale

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma membrane1. To regulate neuronal excitability, the biophysical properties of ion channels are modified by signaling proteins and molecules, which often bind to the channels themselves to form a heteromeric channel complex2,3. Traditional assays examining the interaction between channels and regulatory proteins require exogenous labels that can potentially alter the protein&#39;s behavior and decrease the physiological relevance of the target, while providing little information on the time course of interactions in living cells. Optical biosensors, such as the X-BODY Biosciences BIND Scanner system, use a novel label-free technology, resonance wavelength grating (RWG) optical biosensors, to detect changes in resonant reflected light near the biosensor. This assay allows the detection of the relative change in mass within the bottom portion of living cells adherent to the biosensor surface resulting from ligand induced changes in cell adhesion and spreading, toxicity, proliferation, and changes in protein-protein interactions near the plasma membrane. RWG optical biosensors have been used to detect changes in mass near the plasma membrane of cells following activation of G protein-coupled receptors (GPCRs), receptor tyrosine kinases, and other cell surface receptors. Ligand-induced changes in ion channel-protein interactions can also be studied using this assay. In this paper, we will describe the experimental procedure used to detect the modulation of Slack-B sodium-activated potassium (KNa) channels by GPCRs.

Optical biosensor techniques can detect changes in mass near the plasma membrane in living cells and allow one to follow cellular responses in both individual cells and populations of cells. This protocol will describe detection of the modulation of potassium channels by G-protein coupled receptors in intact cells using this approach.

L&#39;utilisation de biocapteurs optiques sans étiquette pour détecter la modulation de potassium par les canaux G récepteurs couplés aux protéines

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Préparation de Mica charge bicouches lipidiques pour haute résolution microscopie optique d&#39;imagerie

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Simple détection de molécule libre Label-Utilisation Microtoroid optiques résonateurs

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that implantation of a bone autograft would induce greater bone regeneration by abundant blood vessel formation. To investigate the effect of the graft on neovascularization at the defect site, we developed a micro&#8211;computed tomography (&#181;CT) approach to characterize newly forming blood vessels, which involves systemic perfusion of the animal with a polymerizing contrast agent. This method enables detailed vascular analysis of an organ in its entirety. Additionally, blood perfusion was assessed using fluorescence imaging (FLI) of a blood-borne fluorescent agent. Bone formation was quantified by FLI using a hydroxyapatite-targeted probe and &#181;CT analysis. Stem cell recruitment was monitored by bioluminescence imaging (BLI) of transgenic mice that express luciferase under the control of the osteocalcin promoter. Here we describe and demonstrate preparation of the allograft, calvarial defect surgery, &#181;CT scanning protocols for the neovascularization study and bone formation analysis (including the in vivo perfusion of contrast agent), and the protocol for data analysis.
The 3D high-resolution analysis of vasculature demonstrated significantly greater angiogenesis in animals with implanted autografts, especially with respect to arteriole formation. Accordingly, blood perfusion was significantly higher in the autograft group by the 7th day after surgery. We observed superior bone mineralization and measured greater bone formation in animals that received autografts. Autograft implantation induced resident stem cell recruitment to the graft-host bone suture, where the cells differentiated into bone-forming cells between the 7th and 10th postoperative day. This finding means that enhanced bone formation may be attributed to the augmented vascular feeding that characterizes autograft implantation. The methods depicted may serve as an optimal tool to study bone regeneration in terms of tightly bounded bone formation and neovascularization.

Implantation of autologous and allogeneic bone grafts constitute accepted approaches to treat major craniofacial bone loss. Yet the effect of graft composition on the interplay among neovascularization, cell differentiation and bone formation is unclear. We present a multimodal imaging protocol aimed to elucidate the angiogenesis-osteogenesis interdependence at the graft proximity.

Tomodensitométrie et l&#39;imagerie optique du couplage de l&#39;ostéogenèse-angiogenèse à évaluer l&#39;intégration des crâniens autogreffes et allogreffes