We thank Dr. Jordi Ochando from the Flow Cytometry Shared Resources at the Mount Sinai Medical Center for their assistance in flow cytometry analysis. We thank Dr. Rumana Huq from the Microscopy Shared Resource Facility at the Mount Sinai Medical Center for their imaging assistance. The authors thank the TJ Martell Foundation for its support in this project.

Ce protocole a été réalisée à notre institution avec l&#39;approbation du conseil institutionnel d&#39;éthique de la recherche et est en conformité avec toutes les directives institutionnelles, nationales et internationales pour le bien-être humain. 1. Collecte de sang périphérique de patients atteints de cancer de la prostate avancé Remarque: Sélectionnez les patients atteints de cancer de la prostate métastatique. Obtenir le consentement écrit du patient et enregistrer les caractéristiques cliniques des patients, y compris l&#39;âge à l&#39;isolement et une chimiothérapie antérieure et les traitements hormonaux. Les patients atteints de la maladie métastatique auront potentiellement plus forte concentration de CTC dans le sang périphérique. <ol><li> Prélever des échantillons sanguins après consentement éclairé et sous un Institutional Review Board appropriée protocole approuvé. Porter des gants en latex et une blouse de laboratoire pendant toute la procédure. </li><li> Connectez 25 G aiguille à ailettes et de tubes à porte-aiguille. Utilisez un tampon imbibé d&#39;alcool pour nettoyer la zone deveine antécubitale entre biceps et avant-bras, puis appliquer garrot sur le bras du patient. </li><li> Insérez l&#39;aiguille dans la veine de papillon coude et pousser le tube de collecte de sang dans le support de l&#39;aiguille pour commencer la collecte. Recueillir environ 10 ml de sang dans des tubes de collecte contenant de l&#39;acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pour empêcher la coagulation. </li><li> Retirer l&#39;aiguille papillon du patient et appliquer une pression avec un tampon de gaze stérile sur le site de ponction de la veine pendant 1 min. Site Couvrir avec un pansement stérile. </li></ol> 2. Isolement des cellules mononucléaires Remarque: Le sang recueilli à partir de l&#39;étape 1 contient des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) (par exemple, les lymphocytes et monocytes), en plus des CTC mononucléaires. <ol><li> Pipette sang entier dans 50 ml tube de polystyrène conique avec une pipette sérologique de 5 ml et ajouter une solution de sel équilibrée de Hanks (HBSS) dans un rapport de 1: 1. Doucement mélange de pipette pour homogénéiser. </li><li> Ajouter 15 ml d&#39;une solution préparation du commerce (Ficoll-Paque) pour séparer des composants du sang par centrifugation en gradient de densité faible à une vitesse de 50 ml polystyrène tube conique vide. </li><li> Pipette doucement le sang total et mélange HBSS, de l&#39;étape 2.1, dans le tube de polystyrène de l&#39;étape 2.2, pour former la couche supérieure distincte. Set pipette au plus bas réglage pour minimiser le mélange de solutions, ce qui garantira une séparation efficace. </li><li> Centrifuger à 400 g pendant 30 min à température ambiante (25 ° C). Réglez décélération au plus bas pour empêcher le mélange de solutions après la séparation. Accélération peut être réglé à toute vitesse. </li><li> Après centrifugation, d&#39;identifier la bande blanc-gris de la couche mince CMSP et CTC en sandwich entre le plasma sur la solution supérieure et la séparation au fond du tube. </li><li> Recueillir les cellules de la bande blanc-gris à l&#39;étape 2.5 dans un tube de 50 ml de polystyrène à l&#39;aide d&#39;une pipette de transfert en plastique. </li><li> Ajouter HBSS à 50 ml polystyrène tube conique avec CMSP et CTC et centrifuge de nouveau à 400 g pendant 10 min à RT laver. </li><li> Décanter culot liquide et remettre en suspension dans 50 ml de HBSS et centrifuger à nouveau à 400 g pendant 3 min à température ambiante pour se laver. </li><li> Jeter le surnageant, remettre le culot restant avec 5 ml de tampon de lyse de Red Blood Cell et incuber la solution pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Retirer le rouge globules tampon de lyse par centrifugation à 400 g pendant 3 minutes à température ambiante. </li><li> Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de PBS 1x complété avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS) pour bloquer avant la coloration des anticorps. </li></ol> 3. Les cellules mononucléaires coloration avec CD45-FITC anticorps pour cellulaire activé par fluorescence (FACS) <ol><li> Quantifier le nombre de cellules viables (trypan bleu-négative) de l&#39;étape (2.11) à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre ou compteur de cellules automatisé. Préparer un x 10 6 cellules / ml de suspension 1 (dans PBS 1x avec 10% de FBS) et le placer sur la glace pendant 1 heure. </li><li> Distribuer le quantifiéssuspension cellulaire de l&#39;étape précédente dans deux tubes. Tubes d&#39;étiquetage que le contrôle et CD45 coloration. </li><li> Dans le tube de commande, ajouter IgG1κ-FITC (2,5 pg / ml) à une dilution de 1: 250. Dans le tube de coloration de CD45, CD45 FITC ajouter (2,5 pg / ml) anticorps primaire conjugué à une dilution de 1: 250 et on incube les suspensions de cellules sur de la glace pendant 30 min. CD45 étiquetage d&#39;antigène est utilisée pour exclure les cellules hématopoïétiques. </li><li> Centrifuger les cellules à 400 g pendant 3 min à 4 ° C, et jeter le surnageant. </li><li> Laver les cellules deux fois, en mettant en suspension chaque culot avec 1 x PBS stérile additionné de FBS à 10% suivie d&#39;une centrifugation à 400 g pendant 3 min à 4 ° C. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans une solution de 1 ml de PBS 1X contenant 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) à une concentration de 10 ug / ml. </li><li> Filtrer la solution finale à 35 um bouchons de tamis 12 mm dans des tubes de polystyrène de 75 x mm. </li></ol> 4. Isolement de la prostate par CTCFACS Remarque: Utiliser un cytomètre de flux pour recueillir en direct CTC CD45 négatives. <ol><li> Définir les contrôles de compensation en utilisant des cellules du tube étiqueté, «contrôle». </li><li> Créer portes qui excluent les débris et amas de cellules en utilisant des paramètres de l&#39;avant-scatter et dispersion latérale appropriées. </li><li> Mettre en place la porte de la FITC en utilisant les suspensions de cellules à partir du tube marqué &quot;CD45-FITC.&quot; </li><li> (Cellules DAPI-négative) Porte viables en utilisant le bleu du Pacifique-un canal. </li><li> Recueillir CD45 démographique négative dans un tube de 15 ml polystyrène conique stérile contenant 2 ml de Roswell Institut Memorial Park (RPMI) 1640 complété avec 10% de FBS. </li><li> Centrifugeuse de la prostate de suspension de cellules tumorales triés à 400 g pendant 3 min, puis remettre en suspension les culots dans 200 - 500 pi de milieu RPMI supplémenté avec 10% de FBS. </li></ol> 5. Injection de CTC dans souris et le suivi de la croissance des xénogreffes Note:Effectuer toutes les procédures animales en conformité avec les protocoles approuvés par le comité de protection des animaux dans les institutions. Ce protocole a été réalisée à notre institution en vertu d&#39;un protocole d&#39;utilisation des animaux spécifiques approuvées par notre Comité de protection des animaux conformément et le respect de toutes les agences réglementaires et institutionnels, règlements et directives pertinentes. <ol><li> Mélanger la prostate suspension de cellules tumorales triés avec la matrice extracellulaire à un ratio de 1: 1 et le placer sur la glace. </li><li> Anesthetize souris avant l&#39;implantation sous-cutanée dans une chambre de fourniture de 5% (v / v) d&#39;isoflurane inhalées dans 1 L / min d&#39;oxygène. Assurer une anesthésie appropriée en vérifiant pour la perte du réflexe cornéen et des orteils chez la souris. </li><li> En utilisant une aiguille de 25 G et une seringue de 1 ml, injecter 250 ul de cellules de tumeur de la prostate et de la matrice extracellulaire suspension cellulaire sous-cutanée dans les deux flancs supérieurs de 8-10 semaines une ancienne souris immunodéficiente mâle. Injecter 250 ul indépendamment de la concentration CTC comme le volume d&#39;injection est le important valeur. Administration SQ maximum chez la souris a pas plus de 1 ml. &#160;</li><li> Surveiller les souris en effectuant palpation hebdomadaire des sites d&#39;injection de la souris sur la croissance de densités nodulaires sous-cutanées et par la mesure de poids des souris deux fois par semaine. </li><li> Euthanasier souris par le dioxyde de carbone asphyxie suivie par dislocation cervicale et les xénogreffes récolte du cancer de la prostate humain sous-cutanés lorsque la taille de la tumeur est supérieure à 0,5 cm et de moins de 1 cm de plus grand diamètre pour assurer un tissu tumoral suffisant pour les analyses moléculaires et des passages en série. Euthanasier les souris présentant des signes de détresse ou de perte de poids de 15% malgré l&#39;absence de tumeur est palpable. </li></ol>

<ol>
	<li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models:+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer discovery. 4, 998-1013 (2014).</li><li>Siolas, D., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+tumor+xenografts:+transforming+clinical+samples+into+mouse+models.">Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models.</a> Cancer research. 73, 5315-5319 (2013).</li><li>Joosse, S. A., Gorges, T. M., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology,+detection,+and+clinical+implications+of+circulating+tumor+cells.">Biology, detection, and clinical implications of circulating tumor cells.</a> EMBO molecular medicine. 1, 1-11 (2014).</li><li>Yu, M., Stott, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+metastatic+human+prostate+cancer+to+androgen+independence+in+immunodeficient+SCID+mice.">Progression of metastatic human prostate cancer to androgen independence in immunodeficient SCID mice.</a> Nature Medicine. 3, 402-408 (1997).</li><li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+therapy.+Ex+vivo+culture+of+circulating+breast+tumor+cells+for+individualized+testing+of+drug+susceptibility.">Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility.</a> Science. 345, 216-220 (2014).</li><li>Hodgkinson, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumorigenicity+and+genetic+profiling+of+circulating+tumor+cells+in+small-cell+lung+cancer.">Tumorigenicity and genetic profiling of circulating tumor cells in small-cell lung cancer.</a> Nature medicine. 20, 897-903 (2014).</li><li>Vidal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Targetable+GATA2-IGF2+Axis+Confers+Aggressiveness+in+Lethal+Prostate+Cancer.">A Targetable GATA2-IGF2 Axis Confers Aggressiveness in Lethal Prostate Cancer.</a> Cancer cell. 27, 223-239 (2015).</li><li>Quintana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+tumour+formation+by+single+human+melanoma+cells.">Efficient tumour formation by single human melanoma cells.</a> Nature. 456, 593-598 (2008).</li><li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology,+growth,+metastasis+and+disease+outcomes.">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature. 17, 1514-1520 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Ce manuscrit décrit un procédé pour la génération de modèles PDX cancer de la prostate à partir de CTC. L&#39;utilisation de CTC pour la génération de PDX modèles présente plusieurs avantages potentiels importants par rapport aux méthodes existantes. Tout d&#39;abord, la collecte des CTC accessible à partir de sang périphérique permet de générer des modèles expérimentaux chez le même patient à différents stades de la maladie. D&#39;autre part, la collecte de sang représente un p...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/53182">Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells</a>. There was a spelling error in one of the authors' surname. The author's name was corrected from:
Veronica Rodriquez-Bravo
to:
Veronica Rodriguez-Bravo

A correction was made to Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells.

Erratum: Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient xénogreffes dérivés sont des modèles expérimentaux de plus en plus populaires utilisés pour la recherche sur le cancer. Ils peuvent être utilisés pour la caractérisation de biomarqueurs et de voies biologiques, l&#39;évaluation pré-clinique de l&#39;efficacité des médicaments, et la création d&#39;avatars pour les thérapies personnalisés du cancer 1,2. Auparavant, les autres groupes de recherche ont développé des modèles PDX soit par implantation ou injection de suspensions de cellules tumorales uniques ou des explants tumoraux chez des souris immunodéprimées entier 1. Ces PDX modèles nécessitent collection chirurgicale de la tumeur solide frais, ascite maligne ou des épanchements pleuraux provenant d&#39;un patient subissant une intervention chirurgicale qui est à la fois coûteux et expose le patient à un risque accru de morbidité iatrogène. Un développement récent important dans la recherche sur le cancer est la détection, l&#39;isolement et la caractérisation des cellules tumorales circulantes. Ces cellules tumorales échappent à partir de la masse de la tumeur primaire et pénètrent dans la circulationoù ils jouent un rôle essentiel dans les métastases et la rechute, la cause la plus commune de cancer de la mortalité liée 3. L&#39;évaluation et la caractérisation des CTC à partir de plusieurs types de tumeurs solides ont fourni des informations cliniques pour le diagnostic, le pronostic et le suivi de la maladie résiduelle 3. Une variété d&#39;approches actuellement utilisées reposant soit sur ​​les propriétés physiques, l&#39;expression de biomarqueurs, ou des caractéristiques fonctionnelles de CTC peut être utilisé pour isoler efficacement CTC 4. Les méthodes existantes d&#39;isolation CCT macroscopique comprennent la centrifugation en gradient de densité, filtration physique avec des pores de filtrage et de séparation contre des molécules de surface. Les méthodes d&#39;isolement plus largement utilisés CCT sont basés sur la capture à base d&#39;anticorps de la CTC. Tant sélection positive et négative de marqueurs de surface cellulaire peut être utilisée pour isoler les CTC partir de sang périphérique. La sélection positive pour les CTC dans la circulation périphérique utilise couramment marqueurs épithéliaux (par exemple, un EpCAM) quire exprimé sur les cellules, mais pas CTC hématopoïétiques. L&#39;inconvénient de cette méthode est que les CTC avec un potentiel métastatique ont souvent fait l&#39;objet d&#39;épithéliale-mésenchymateuse transition (EMT), qui régule à la baisse des marqueurs de surface 3 épithéliales. Afin d&#39;isoler les CTC avec un potentiel métastatique, une méthode de sélection négative qui utilise le marqueur de surface hématopoïétiques, CD45, pour épuiser la population de cellules de leucocytes normales peut être utilisé 5. Le cancer de la prostate est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué et une cause majeure de décès liés au cancer chez les hommes 6. Les mécanismes de la progression de la tumeur et de l&#39;agressivité sont pas complètement compris et par conséquent la génération et la caractérisation des modèles expérimentaux qui récapitulent l&#39;hétérogénéité moléculaire de cancer de la prostate sont d&#39;un intérêt considérable. PDX modèles de cancer de la prostate ont été précédemment générée par la prise de greffe de cellules de cancer de la prostate humaines dans immunodépriméssouris promis 7,8. Toutefois, la production de ces modèles a été entravée par le taux de prise de greffe bas de cancer de la prostate dans des souris immunodéprimées, qui est principalement attribuable à la nature indolente de la maladie. Récemment, des CTC ont été utilisées pour générer le cancer du sein 9, le cancer du poumon et de la prostate 10 11 modèles PDX. Ces études de preuve de concept introduit la possibilité de générer des modèles PDX indépendante de la nécessité pour la collecte de l&#39;échantillon chirurgicale. Dans cet article, nous décrivons en détail un procédé pour la production de ce nouveau modèle expérimental.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning Cell Gro</td>
			<td>21-031-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml polystyrene conical tube</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>23-2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cell lysing buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>d3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Lavender Blood Collection Tubes with EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Winged Blood Collection Set with Push Button Retract Needle 23 gauge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer One Use Needle Holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Latex Tourniquet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex or non-latex gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alcohol swabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x2 cotton gauze pads</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive bandage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 gauge needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of prostate cancer patient derived xenograft models from circulating tumor cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

Ce protocole permettra à la génération de modèles de PDX isolés CD45 prostate négative CTC cancéreuses. Basé sur la méthode de sélection négative utilisée dans notre protocole, il est nécessaire d&#39;exclure les cellules mortes en utilisant DAPI tache. Le pourcentage de cellules CD45 négatives détectées par cytométrie de flux est variable et dépend de la charge tumorale du patient (figure 1A). La coloration par immunofluorescence de cellules non triées à l&#39;aide de CD45 et DAPI (...

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Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

Génération de cancer de la prostate des patients Dérivé modèles de xénogreffe de cellules tumorales circulantes

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

14.0K vues.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai. This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.