This work was supported by a BBSRC project grant to DMcK, DMcC and RGN (BB/K002775/1) and a PhD studentship [to JP, BB/J013854/1]. We gratefully acknowledge the fantastic advice on technical equipment and field techniques that we received throughout the project from Nozrat Mirzai (Bioelectronics Unit University of Glasgow), Ross McLeod and Matthew Clavey (ThermalVision Research) as well as SCENE for all their logistic support of the field work. We would also like to thank Debbie Kelton at Veracity for generously providing equipment used to power the thermal imaging camera in the field.

Déclaration d&#39;éthique: Le travail impliquait une méthode de piégeage systématique de libre-vivant petits passereaux approuvés par le British Trust for Ornithology et le protocole de capture susciter une léger stress chez l&#39;oiseau a été réalisée sous licences UK Home Office. 1. Set-up pour le tournage <ol><li> Créer un tournage set-up où les oiseaux sont encouragés à se positionner en face de la caméra (Figure 1). L&#39;oiseau pénètre dans le set-up à travers un trou dans une paroi d&#39;extrémité et a accès à la nourriture à proximité de la paroi d&#39;extrémité opposée. </li><li> Afin d&#39;habituer les oiseaux à la mise en place, de fournir un aliment approprié (par exemple, graines d&#39;arachide) à la mangeoire pendant plusieurs semaines avant l&#39;enregistrement. Outre la fourniture de la nourriture, quitter le set-up tranquille. Pendant cette période, placez un trépied mannequin en face de la mangeoire pour permettre aux oiseaux de se habituent également à la caméra. </li><li> Le jour de l&#39;enregistrement, de réduire le Availabilité des graines d&#39;arachide dans le set-up en supprimant tous les aliments restant dans le chargeur et de le remplacer avec de la nourriture contenue dans un récipient transparent avec seulement un petit trou au centre sur le haut à travers laquelle les oiseaux peuvent accéder à la nourriture. Position de ce récipient pour aliments dans l&#39;axe de la cage à l&#39;extrémité opposée à l&#39;orifice d&#39;entrée. </li><li> Placez un petit carré de ruban isolant noir de l&#39;émissivité connue à celle du tégument naturel dans l&#39;un des coins de la maille de la boîte de sorte qu&#39;il apparaît dans toutes les images. Attachez le ruban isolant noir à un thermocouple relié à un enregistreur de température qui enregistre la température du ruban isolant noir avec une résolution de 0,1 ° C tous les 1 sec. </li><li> Placez la caméra d&#39;imagerie thermique de 50 cm du centre de la boîte piège de sorte que tout de la boîte correspond dans le champ de vision de la caméra, et les oiseaux se nourrissant du récipient transparent sera positionné dans la zone de l&#39;appareil de mise au point. Branchez l&#39;appareil photo à un ordinateur portable, de régler l&#39;appareil<html> pour enregistrer des images à moyenne de 7,5 images par seconde (avec un timbre de temps), et envoyer des images sur le disque dur de l&#39;ordinateur portable pour y être sauvé. </li><li> Fixer une ligne de pêche à la porte tournante du set-up et de l&#39;étendre à une position où l&#39;expérimentateur est caché de la vue des oiseaux, mais le set-up peut encore être observé - environ 20 m de la set-up. </li></ol> 2. Filmer la réponse de l&#39;Oiseau à un stress aigu doux <ol><li> Une fois un oiseau entre dans la boîte d&#39;alimentation, laissez l&#39;oiseau non perturbée dans la zone pendant environ 5 sec. </li><li> Tirez la ligne de pêche après que l&#39;oiseau avait passé environ 5 secondes dans la boîte pour fermer la boîte d&#39;alimentation. Veillez à ce que l&#39;oiseau est encore à l&#39;extrémité de la boîte afin de minimiser le risque de blessures à l&#39;oiseau. </li><li> Aborder immédiatement la boîte d&#39;alimentation et restait immobile derrière la caméra pour environ 3 min. Alors récupérer l&#39;oiseau de la boîte et laissez-le aller. </li></ol>&quot;&gt; 3. Extraction de Eye-région Température d&#39;images thermiques <ol><li> Extrait température maximale de chaque trame. Note: La température maximale a été enregistrée à partir de pratiquement toujours à l&#39;intérieur de la région autour de l&#39;œil, délimité par la peau exposée de la bague periophthalmic (figure 2), et est ci-après dénommée température eye-région. <ol><li> Dans le logiciel d&#39;analyse de l&#39;imagerie thermique clic droit sur l&#39;image, «ajouter» un nouveau tracé pour le maximum d&#39;image. Ensuite, faites un clic droit sur la parcelle qui exporte les données (température oeil-région et le temps le châssis a été prise) dans un fichier CSV. </li></ol></li><li> Supprimer dans le fichier CSV toutes les lignes de cadres où l&#39;œil-région de l&#39;oiseau était pas visible. </li><li> Tracer température maximale contre le temps dans R 27, les points identifier manuellement où des pics de température&gt; 0,2 ºC entre deux lectures successives lorsque la membrane nictitante a été tiré sur l&#39;oeil (clignotant) et les points faibles avec des valeurs outside la gamme de températures de corps pour les oiseaux (soit 28, lorsque l&#39;œil-région était visible, mais brouillé par le mouvement pour de multiples trames) puis retirez les lignes concernées du fichier de données CSV produite lors de l&#39;étape 3.1. </li><li> Mesurer la température ambiante. <ol><li> Télécharger les données (temps et température de l&#39;enregistreur) de l&#39;enregistreur de température sur un ordinateur et d&#39;exportation dans un tableur. </li><li> Pour obtenir la température ambiante de l&#39;image thermique, à l&#39;image d&#39;analyse thermique Logiciels dessiner un carré sur le ruban isolant noir qui couvrait la sonde de l&#39;enregistreur de température, puis cliquez à droite sur la place et sélectionner &#39;ajouter nouveau complot »pour la température moyenne de la place. </li><li> Ensuite, cliquez à droite ce complot, d&#39;exporter les données (temps et température IRT) dans un fichier CSV. Fusionner la série de temps de deux de température résultant pour enregistreur de température et de l&#39;image correspondant thermique pour le temps dans un tableur. </li></ol></li><li> Corriger les yeux-région tempérare de la température ambiante. Export de la feuille de calcul créée à l&#39;étape 3.4 dans le fichier CSV correspondant pour le temps. Pour chaque température eye-région conservée ajouter la différence entre l&#39;enregistreur de température et les valeurs de la température d&#39;imagerie thermique dérivé (enregistreur de température - Temp IRT) mesurée en même temps. </li><li> Effectuer le filtrage automatisé pour éliminer de faibles valeurs moins précises oeil-région température en utilisant l&#39;algorithme de recherche de pointe (voir le fichier de code supplémentaire) pour extraire les points les plus élevés (et donc plus précis) dans les données automatiquement. Remarque: L&#39;algorithme de recherche de pointe réorganise les données de température dans un vecteur avec une largeur définie par l&#39;utilisateur (durée), recommandé span class = 3, l&#39;extraction de la valeur centrale dans les lignes où les numéros de chaque côté sont plus faibles, à savoir, les pics. </li><li> Utilisez interpolation linéaire pour combler les lacunes laissées par les séquences où aucun pic a été extraite, et quand l&#39;œil-région était pas visible. Utilisez la commande na.approx (zoo forfait v1.7-11 R 27) pour donner une valeur unique de température par seconde pour chaque individu. </li><li> Dans le fichier de données de CVS, ajouter une valeur de 0,2 à chaque température eye-région pour corriger l&#39;effet de la prise des images à travers un tamis. Note: Les tests ont montré que quand un corps noir, chauffée à rapprocher la température du corps d&#39;oiseau de ~ 41 ºC signifier dans sa phase active 28, mis en image par la fenêtre de maille avec le même maillage que celui utilisé dans le tournage set-up, les températures enregistrées par la caméra d&#39;imagerie thermique dans les zones non masquées par les fils étaient 0,2 ºC inférieures aux valeurs obtenues sans le maillage intervenant (différence moyenne = -0.2 ° C ± 0,085 SD, n = 30, plage de température de corps noir = 41,6 à 42,5 ºC). Note: Ceci est le facteur de correction spécifique aux conditions de cette étude et est susceptible de varier avec l&#39;instrument faire, et le type et la largeur de la maille entre l&#39;animal et l&#39;appareil photo, et dans chaque situation doit être établi pour la SPconditions d&#39;études ecific. </li><li> De les températures oeil-région maximales enregistrées à partir avant que la boîte a été fermé sélectionner la valeur la plus élevée, qui constitueront la température oeil-région de base de l&#39;oiseau sans être dérangé. Ajouter cette température oeil-région de base comme une nouvelle colonne dans le fichier CVS (de base). Puis soustraire la valeur de référence de l&#39;retenu la valeur maximale de la température oeil-région, générant une nouvelle colonne dans le fichier de données CVS. Remarque: Cette nouvelle valeur exprime maintenant la réponse de l&#39;oiseau à un stress aigu doux comme écart par rapport à sa température de base intacte. </li><li> Tracer les écarts de température maximale oeil-région à partir de la température oeil-région de base de tous les individus à partir après le piège a été fermée à l&#39;aide de la ggplot de commande (paquet ggplot2 v1.0.0 dans la R 27). Générer des intervalles de confiance à 95% bootstrap en utilisant l&#39;option mean_cl_boot (package ggplot2 v1.0.0 dans la R 27). Pour plus de détails, consultez le fichier de code supplémentaire. </li&gt; </ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Le but de cet article est de décrire la méthodologie nécessaire pour mesurer les changements dans la température de la peau d&#39;un animal vivant en liberté en réponse à un stress aigu. Cette étude a démontré que les changements rapides de la température de la peau associés à un état de stress aigu chez les oiseaux sauvages peuvent être capturés de façon non invasive utilisant IRT. Cette procédure cinq étapes importantes (1) conception de champ approprié mis en place en utilisant un système d&#39;imagerie thermique hautement portable, (2) la mesure de la température de référence, impliqué (3) l&#39;application d&#39;un stress léger impliquant la capture de l&#39;oiseau dans le set-up, (4) post hoc échantillonnage de la température oeil-région et (5) l&#39;étalonnage des données de température extraites automatisé. La méthodologie décrite ici a été appliquée à la capture de mésanges bleues sauvages. Températures oeil-région de base représentatives pouvaient être capturés en aussi peu que 5 sec. Le temps estimé nécessaire à l&#39;enregistrement d&#39;un oiseau dans le domaine était environ 1 h, avec une heure supplémentaire nécessaire pour traiter la3 min de séquences vidéo thermique. Collecte de bonnes données sur la température de l&#39;animal de la peau nécessite des images thermiques de haute qualité. Les caméras thermiques ne diffèrent fondamentalement de caméras de lumière visible en termes de la longueur d&#39;onde du rayonnement électromagnétique qu&#39;ils détectent, et donc beaucoup de concepts applicables à la photographie (par exemple, le champ de vision, profondeur de champ) sont également applicables en thermographie. Comme couramment pratiquée par les photographes de la faune, tout endroit où un visites animales prévisible, où naturels (par exemple, les sites de nidification) ou artificiels (par exemple, des mangeoires), pourraient être utilisés pour la collecte des images thermiques. Attirer les animaux à la caméra plutôt que de tenter de les suivre si leur habitat a l&#39;avantage de nous permettre de mettre en place la caméra à l&#39;avance, de recueillir des images de haute qualité avec une perturbation minimale dès que l&#39;animal est en vue. Cependant, avec cette approche, il est essentiel d&#39;examiner ou de tenir compte des effets dece contexte spécifique de la mesure sur le stress ou la température de la peau. Par exemple, ici, les oiseaux ont été mesurés dans un contexte d&#39;alimentation, et de la nourriture a été utilisé pour attirer activement mésanges bleues dans le set-up. La recherche sur les poulets suggère que des expériences positives aiguës, telles que l&#39;anticipation et de la consommation d&#39;une récompense en nourriture à un essai de l&#39;apprentissage associatif pouvez température oeil également inférieure 29. En tant que tel, «niveaux de référence» des personnes qui entrent dans cet ensemble particulier jusqu&#39;à peuvent être influencés par l&#39;association de cet acte à la récompense. Cette possibilité mérite une enquête plus approfondie, mais si présente, serait susceptible d&#39;améliorer la chute aux niveaux de référence déjà observé. En outre, la thermogenèse se produit avec la digestion des aliments, mais ne devraient pas les effets spécifiques de la nourriture consommée lors de la mesure de référence pour élever considérablement la température à l&#39;intérieur de la période de piégeage de 3 min 30. Cette limitation considéré, la mesure de tous les animaux avecdans le même contexte est aussi une grande force de cette approche. Les résultats représentatifs montré qu&#39;il y avait une grande variation de température eye-région entre les individus devant le facteur de stress aigu a été appliquée (base eye-région température). La variation de la température de l&#39;oeil de base (coefficient de variation = 3,9%) pourrait être en partie due à une erreur de mesure ou un vrai reflet de différences entre les individus. La période la caméra IRT a enregistré la température de la bande d&#39;isolation noir sur 5 sec lorsque la température de la bande n&#39;a pas changé, le coefficient de variation moyen était de 0,26% (intervalle de 0,08% à 0,59%). Bien que l&#39;erreur de mesure est susceptible d&#39;être plus grande chez un oiseau en mouvement il indique néanmoins que la plupart de cette variation de la température de référence oeil-région est en effet entre les individus. La notion de relativement petite erreur de mesure sur les oiseaux mobiles est en outre soutenu par la répétabilité élevée de la température oeil-région plus de 20 secondes pendant les mesures de référence ( <strong&gt; Figure 3). En contrôlant pour le contexte, nous pouvons nous assurer que tous les oiseaux ont été engagés dans la même activité. Nous pouvons également réduire les contributions environnementales au moment de la mesure à entre-individuelle variation de la température de la peau, par exemple, en veillant à ce que la localité est protégé du rayonnement incident confusion qui, pour l&#39;imagerie thermique, conduire à une surestimation de la température de surface de l&#39;animal . Cela peut être fait avec le travail à l&#39;ombre ou par des nuances stratégiquement placés, y compris la plupart des plastiques transparents qui bloquent infra-rouge longueur d&#39;onde. Le protocole présenté ici montre un set-up simple qui pourrait être facilement appliquée à la situation de l&#39;hivernage mésanges bleues. La mésange bleue a été filmé alors dans une boîte d&#39;alimentation avec un toit solide qui évite l&#39;exposition aux rayons directs du soleil. Cette configuration peut également être appliquée à de nombreux autres passereaux qui viennent régulièrement les mangeoires artificielles à certains moments de l&#39;année. Comme mésanges bleues sont relativement petits animaux, ilsBesoin d&#39;être filmé en gros plan pour capturer un bon niveau de détail. Comme avec appareils photographiques, se rapprocher de l&#39;objet - à la fois en termes de distance réelle, et le grossissement - réduit considérablement la profondeur de champ. Pour avoir les oiseaux aussi large que possible dans le champ de vision nécessaire de les filmer de distance de mise au point minimale de la caméra, qui dans ce cas est de 500 mm et profondeur de champ réduite à 40 mm. Par conséquent, toutes les fonctionnalités du tournage set-up doivent être conçus pour encourager les animaux à afficher leur tête dans la zone relativement étroite de netteté de la caméra particulier utilisé. En réponse à un stress aigu doux bien établie à un animal nous nous attendions à des changements rapides dans le modèle de la circulation sanguine, de la périphérie au noyau par vasoconstriction à médiation sympathique qui réduit la température de la peau 17. La région périorbitaire a été choisi comme cela a fourni la seule région du corps qui était non isolée et est associés à un riche réseau entremêlés de petits vaisseaux sanguins, l&#39;ophthalmicum rete qui peut affecter la perte de chaleur de l&#39;œil 31. Le taux de rafraîchissement rapides de la technique de à filmer thermique a pu montrer une goutte dans l&#39;œil-région température d&#39;environ 2 ° C en 10 sec suivie d&#39;une augmentation subséquente de la température à 0,5 ° C de base à moins de 3 min. Bien que le refroidissement périphérique en réponse à un stress modéré a été enregistrée antérieurement à environ 1 min d&#39;intervalle 17,26, 32, la technique ici a montré que chute maximale de la température peut être extrêmement rapide. Avec une résolution temporelle inférieure de l&#39;ampleur de cet effet peut être manqué. Cela peut être important lorsque l&#39;on compare les différences dans la réponse au stress de différents individus. La re-réchauffement de l&#39;oiseau après la «lutte ou de fuite» d&#39;intervention rapide n&#39;a pas revenir au niveau de base comme l&#39;oiseau est resté dans la boîte indiquant que l&#39;oiseau est resté physiologiquement souligné. Les oiseaux étaient de pressed de l&#39;ensemble expérimental après un point de coupure choisi arbitrairement d&#39;environ 3 min de minimiser la période de restriction d&#39;un animal vivant en liberté. Toutefois, à l&#39;avenir, les essais peuvent devoir être plus d&#39;enregistrer la réponse complète de la température jusqu&#39;à ce que l&#39;œil-région de la température de l&#39;animal est revenu à un niveau de référence, si possible sur le plan logistique. Ce nouveau protocole impliquant une série d&#39;images recueillies avant et après le stress a été appliquée permet maintenant étude détaillée de la dynamique de la réponse à un stress aigu, et les comparaisons de multiples points dans le temps entre les animaux. La répétition de ce procès dans les personnes de plus différentes saisons ou des conditions environnementales peuvent permettre que les effets de l&#39;environnement sur la base ou post-aiguë température de la peau du stress pour être différenciés, comme une avenue possible dans l&#39;évaluation de stress chronique ainsi. . La température de la peau d&#39;un oiseau dépend non seulement à la production de chaleur métabolique etle flux sanguin, mais aussi sur l&#39;échange du rayonnement solaire, la vitesse du vent et de mouillage 25 chaleur. Cela empêche des conditions humides et venteuses à partir d&#39;enregistrements thermographiques précises. La température oeil-région enregistrée par une caméra d&#39;imagerie thermique peut parfois soit être sous-estimée (erreur négative) ou surestimé (erreur positive). Erreur positive substantielle nécessiterait un apport d&#39;énergie, mais cela a été évité par l&#39;oiseau dans la boîte d&#39;alimentation étant à l&#39;abri du soleil. Une autre source d&#39;erreur positive inclus lorsque l&#39;oiseau cligna des yeux. À l&#39;occasion de l&#39;oiseau tire brièvement sa membrane nictitante-dessus de l&#39;oeil et la région telle qu&#39;elle est stockée en interne à une température proche de celle de l&#39;âme du corps, clignotant donne une lecture de température anormalement élevée quand il recouvre le globe oculaire. Ceci est, cependant, facilement détecté en sortie une signature très marqué et le cadre concerné peut être retiré. La raison principale pour une erreur négative dans nos dossiers était flou de mouvement. Tout mouvement trop rapide pour être capturé sharplis par le taux de la caméra cadre confond les données capturées à partir de la petite oeil-région chaude de l&#39;image avec celle de la zone froide (motion blur) environnante, ce qui entraîne une sous-estimation de la température oeil-région. Ainsi, après l&#39;élimination des erreurs positives ce qui rend la température maximale mesurée à partir de l&#39;œil-région, la mesure la plus précise et un filtrage automatisé en utilisant la commande de fonction des pics supprime les valeurs inférieures des températures maximales oeil-région moins probable. En outre, comme le rayonnement infrarouge est absorbé par la vapeur d&#39;eau, la température de surface enregistré sera influencée par l&#39;humidité relative de l&#39;environnement. Ceci peut être expliqué par température d&#39;air entrant, l&#39;humidité relative et la distance à l&#39;objet dans l&#39;analyse image thermique Logiciel d&#39;analyse. Cependant, une approche plus précise et efficace (comme entrepris ici) est d&#39;inclure un corps de la température et de l&#39;émissivité connue référence dans le champ de vision. Dans notre cas, cela étaitun carré de ruban isolant noir avec une émissivité de 0,97, ce qui est à peu près équivalente à celle du tégument naturelle 33. Ceci permet l&#39;étalonnage de la température eye-région en utilisant la différence entre les valeurs de température réelles dérivées de l&#39;imagerie et thermiques mesurées pour le ruban isolant. La température de surface du corps noir peut ensuite être utilisée pour étalonner des images en continu tout au long de la période de mesure. Merci aux progrès technologiques dans le développement des caméras thermiques, elles peuvent désormais être déployé en tant que petites caméras légères en mesure de recueillir de nombreuses images par seconde sur des périodes de temps prolongées. Bien que l&#39;imagerie thermique est une technique largement utilisée dans la recherche aviaire 25, la taille et le coût des systèmes d&#39;imagerie thermique ont restreint son utilisation à l&#39;état sauvage. Dans cette étude, le système était hautement portable, a coûté environ. £ 6000 et de la vidéo thermique fournie haute résolution capable de capturer de manière non invasive te précisedonnées de mpérature provenant d&#39;animaux vivant en liberté sans la nécessité de la manipulation des oiseaux. Enregistrement à de multiples images par seconde permet des mesures de haute résolution de séries chronologiques de la température périphérique et offre ainsi la possibilité d&#39;explorer la dynamique de la réponse de stress aigu. Ceci est difficile à réaliser avec le glucocorticoïde échantillon classique qui est limitée par le nombre d&#39;échantillons qui peuvent être prises dans une période de temps. Ici, nous avons extrait une série de temps de la température oeil-région avec un intervalle de 1 sec, ce qui était suffisant pour démontrer la réponse de la température oeil-région à un facteur de stress aigu (de capture), mais une résolution temporelle plus élevée serait également possible. L&#39;accumulation d&#39;un grand nombre d&#39;images, cependant, nécessite un certain niveau d&#39;automatisation dans l&#39;extraction d&#39;informations à partir des images. Le protocole décrit un procédé semi-automatisé simple pour extraire la température maximale de l&#39;image. Nous étions en mesure de faire ce que la région d&#39;intérêt, l&#39;œil-region, a toujours été l&#39;endroit le plus chaud de l&#39;image. L&#39;analyse pourrait être plus problématique si les régions d&#39;intérêt sont plus complexes et peuvent nécessiter des logiciels de reconnaissance de modèle conçu sur mesure (par exemple, 34). Dans cette étude, un certain filtrage manuel a été nécessaire pour les situations où la température oeil-région a été sur- ou sous-estimées, mais elles ont été facilement détectés, mais bien sûr, une automatisation plus poussée est souhaitable. Les mesures de refroidissement périphérique induite par le stress par imagerie thermique fournit un ajout précieux à d&#39;autres mesures physiologiques du stress et l&#39;aspect non-invasive de cette technique est très avantageuse pour d&#39;autres études portant sur des animaux captifs et sauvages. Capturer la réponse complète du stress, la thermographie infrarouge a clairement un grand potentiel comme outil pour l&#39;évaluation du stress. Pour devenir une alternative non-invasive pour hormonale établie et base des essais de température cependant, il sera nécessaire de validation croisée entre ces mesures etdéterminer si la température de la peau montre la même proportionnalité avec une intensité de stress, à savoir, la mesure de la réponse de la température de la peau peut refléter la force de l&#39;agent stressant. Les recherches futures devraient aussi aborder si la température de la peau capte le stress chronique. Alors que SIH en réponse à un stress aigu devrait être, l&#39;exposition récurrente transitoire aux facteurs de stress physiques ou psychologiques aigus peut générer élévation chronique de la température centrale du corps 35,36. Que vasoconstriction cours contribue à ce noyau élévation n&#39;a pas été testé de manière explicite. Cependant, des études de corrélation sur les humains souffrant d&#39;une maladie liée au stress chronique font montrer du doigt des températures réduites 37. Un attribut final à explorer est valence: la capacité de distinguer positive des événements négatifs. Dosages hormonaux ne peuvent pas distinguer valence 5, avec des taux de glucocorticoïdes apparaissant à refléter le niveau d&#39;excitation plutôt que le stress spécifiquement. Recherche sur le peigne humeurature de poulets domestiques exposés à un stimulus aversif et positifs suggèrent température de la peau peut être de même à l&#39;excitation générale apparente 22,29. Cependant, chez les humains, différents états émotionnels provoquent des changements spécifiques à la région de la température de la peau, par exemple le réchauffement et le refroidissement de périorbitaire joue quand sursauter 38, mais dans l&#39;ensemble diminué température de la peau en riant 39. Les comparaisons entre les différentes régions peuvent encore révéler l&#39;état émotionnel. En utilisant les recommandations énoncées dans le présent document, il sera possible de répondre à toutes ces questions, et de valider température de la peau comme un marqueur non invasif de stress.

Le stress est un concept central dans la biologie, décrivant la réponse d&#39;urgence d&#39;un organisme en réponse à un défi environnemental de tenter de rétablir l&#39;homéostasie 1,2. Sous le stress, la glycémie, les acides gras et les niveaux des acides aminés, la fréquence cardiaque, fréquence respiratoire et le taux métabolique toute augmentation, et le sang est détourné de la périphérie vers les organes de base 2. Ce modèle générique de changements physiologiques amorce l&#39;animal pour être en mesure de répondre rapidement et de manière adaptative à une série de défis sociaux et physiologiques. Tout en reconnaissant et comprendre le stress est au cœur de la pure et la recherche appliquée animale, évaluation du stress chez les animaux effrénée reste un défi. Un marqueur physiologique largement utilisé de stress est une augmentation des niveaux de circulation d&#39;hormones glucocorticoïdes, tels que le cortisol et la corticostérone 1,2. Une grande force de cette approche est que leurs concentrations augmentent in proportionnellement à l&#39;intensité facteur de stress, ce qui permet de quantifier le stress. Cependant, les glucocorticoïdes ne sont pas des hormones «stress» en soi, mais mobilisateurs de réserves d&#39;énergie 2. Comme ces niveaux de glucocorticoïdes changent également avec les besoins en énergie, moment de la journée, l&#39;âge et l&#39;état reproducteur 3,4, ainsi que, en réponse à des situations apparemment positifs, tels que l&#39;accouplement possibilité 5. Taux de glucocorticoïdes, par conséquent, doivent être interprétés avec prudence et dans un contexte. Mesure de la réponse des glucocorticoïdes au stress aigu a aussi quelques limitations. Un facteur de stress aigu déclenche une réponse dynamique de l&#39;augmentation des niveaux de glucocorticoïdes initialement et ensuite retourner à un niveau de référence de 1,2. Échantillons glucocorticoïdes sont généralement obtenus invasive, par prélèvement de sang qui est un facteur de stress en soi et ne peut donc affecter les taux de glucocorticoïdes mesurées 6. En outre les niveaux de glucocorticoïdes ne peuvent être mesurées à l&#39;une ou très peu de temps points, qui peut ne pas capturer la variation des niveaux de pointe et le calendrier ou la durée de réponse, limiter notre capacité à examiner les changements à travers le temps de la réponse au stress dynamique au sein des individus. Les méthodes non-invasives d&#39;échantillonnage de l&#39;hormone, comme des excréments 7, poils ou de plumes 8, mesurer les niveaux de glucocorticoïdes moyennes sur une échelle de temps plus longue, de jours ou de mois, bien utile pour étudier les facteurs de stress chroniques, ne sont pas applicables à l&#39;étude de stress aigu . Comme même les méthodes les mieux établies offrent seulement une perspective limitée sur la variation du stress aigu entre les individus il ya un besoin pour une autre méthode de mesures de contraintes physiologiques. Comme la réponse au stress implique un certain nombre d&#39;effets physiologiques il ya d&#39;autres candidats qui pourraient indiquer le stress. Entre autres, sympathique à médiation par les canaux de vasoconstriction artérielle à partir de la périphérie vers le centre du corps. Cette concentration de sang et donc la chaleur, avec diverses formess de la thermogenèse induite par le stress, réchauffe l&#39;âme 9. En tant que tel, le réchauffement noyau, appelé hyperthermie induite par le stress (SIH) a également été utilisé comme marqueur de stress aigu dans la recherche pharmaceutique 10. SIH soulève généralement la température du corps par 0,5-1,5 ° C dans les 10-15 min d&#39;un facteur de stress aigu 10. Il est un phénomène relativement bien documenté que un facteur de stress expérimentale communément appliqué de la capture et la manipulation d&#39;un animal peut élever la température du corps dans une gamme d&#39;espèces de mammifères et d&#39;oiseaux 11 - 17. Surtout, SIH en corrélation avec d&#39;autres indicateurs établis de stress, tels que la fréquence cardiaque 18, 19 niveaux de glucocorticoïdes et le comportement 20,21. Et comme les niveaux de glucocorticoïdes, la température centrale a été linéairement liés au stress chez certaines espèces niveau 22. Cependant, comme pour le prélèvement de sang, la mesure de la température centrale est invasive en soi, ce qui nécessite l&#39;insertion or implantation d&#39;une sonde 10. Température du noyau de base augmente progressivement à chaque fois que la manipulation ou de la sonde insertion inducteur de stress doit être répété 23. Les développements récents dans les équipements d&#39;enregistrement de la température qui permettent l&#39;accès aux données à distance peuvent fournir une solution, au moins pour les grands animaux 24. Dans le même mécanisme qui génère SIH, cependant, se trouve encore un autre marqueur potentiel de stress: la vasoconstriction périphérique qui se déplace le sang, et avec elle la chaleur, à l&#39;âme refroidit simultanément la peau 17. Contrairement à la température centrale, la température de la peau peut être mesuré entièrement non-invasive, par thermographie infrarouge (IRT). IRT convertit le rayonnement infrarouge émis par la surface d&#39;un objet en 25 température. Comme la surface d&#39;un animal a généralement quelques taches nues à partir de laquelle la température de la peau peut être dérivé directement, il exige l&#39;accès à la peau naturellement exposées (par exemple, zone autour de til œil) ou la création d&#39;un patch à nu par la coupe de fourrure ou de plumes. Fourni l&#39;accès à une zone exposée appropriée de la peau et l&#39;animal peut être conservé dans le champ de vision de la caméra, les caméras IRT peuvent être utilisés pour recueillir des mesures en continu de la température de la peau à distance, permettant éventuellement la réponse complète de la température d&#39;être filmé et rapport entre les individus . Alors qu&#39;il a déjà été démontré chez les poulets que la température de surface répond aux aigus de stress 26, la nouveauté de cette étude est qu&#39;il mesure la température du corps de surface des animaux sauvages dans une résolution plus fine temporelle que les études précédentes et montre également que la chute de la température de la peau attendue peut être détecté dans le champ où la température, l&#39;humidité et la météo sont variables. Le but de cet article est de décrire la méthodologie nécessaire pour mesurer la température de la peau d&#39;un animal sans contrainte en utilisant l&#39;imagerie thermique. Nous utilisons la capture d&#39;induire un stress aigu doux en libre-vivant mésanges bleues (Cyanistes caeruleus, Linné, 1758 </em&gt;) et décrire comment capturer des images approprié, analyser les images et traiter les données pour produire des courbes de réponse de température contre le temps qui démontrent un refroidissement significatif de la température de la peau des oiseaux en réponse au facteur de stress doux. Cela peut fournir une méthode alternative précieuse pour évaluer le stress chez les animaux sauvages en captivité et utiles à un large éventail de chercheurs de écologues, biologistes de la conservation et des physiologistes aux chercheurs de bien-être animal. L&#39;étude a été réalisée dans la période comprise entre le 17 e Décembre 2013, et 4 ème Janvier 2014 au chêne à feuilles caduques (Quercus spp.) Forêt au Scottish Centre pour l&#39;écologie et l&#39;environnement naturel (SCENE), Université de Glasgow à la rive orientale du Loch Lomond, centre-ouest de l&#39;Ecosse (56.13 ° N, 4.13 ° W). Le protocole comporte trois étapes principales: (1) Mise en place des conditions appropriées en vertu de laquelle de capturer des images thermiques d&#39;un animal en liberté, (2) applying un facteur de stress aigu tout en prenant une vidéo thermique, et (3) l&#39;extraction et le traitement des données à partir des images thermiques qui peuvent ensuite être utilisés pour caractériser la réponse de l&#39;animal à l&#39;agent stressant aiguë. Dans notre cas, nous avons attiré un libre-vivant passereau, la mésange bleue à une boîte d&#39;alimentation (le tournage de set-up) où les conditions de capture d&#39;image thermique ont été optimisés, et ensuite appliqué un effort de capture par la fermeture de la boîte d&#39;alimentation à distance lorsque l&#39;oiseau était à l&#39;intérieur . La description de la capture d&#39;image thermique et l&#39;extraction de données est spécifique à l&#39;équipement, nous avons utilisé, et peut varier entre les systèmes d&#39;imagerie thermique. Le traitement des données est décrit en utilisant un logiciel open-source.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Thermal Imaging Camera</td>
			<td>FLIR</td>
			<td>A65 (f=25mm)</td>
			<td>Compact (106 &#215; 40 &#215; 43 mm) &#38; low cost</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Image Analysis Software</td>
			<td>FLIR</td>
			<td>ResearchIR v3.4</td>
			<td>Allows high speed thermal video recording and thermal pattern analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature logger</td>
			<td>Gemini Data Loggers</td>
			<td>Tinytag Talk 2 TK-4023-PK</td>
			<td>Monitors from -40 to +125&#176;C using accompanying temperature probe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

thermal imaging to study stress non-invasively in unrestrained birds

Le stress, un concept central dans la biologie, décrit une suite de réponses d&#39;urgence aux défis. Parmi les autres réponses, le stress conduit à une modification du débit sanguin qui se traduit par un afflux net de sang vers les organes principaux et une augmentation de la température à coeur. Cette hyperthermie induite par le stress est utilisé pour évaluer le stress. Cependant, la mesure de la température centrale est invasive. Comme le flux sanguin est redirigé vers la base, la périphérie du corps peut refroidir. Ce document décrit un protocole où la température de corps périphérique est mesurée de manière non invasive dans mésanges bleues sauvages (Cyanistes caeruleus) en utilisant la thermographie infrarouge. Dans le domaine, nous avons créé un set-up amener les oiseaux à une position idéale en face de la caméra en utilisant une boîte appâté. L&#39;appareil photo prend un court enregistrement vidéo thermique de l&#39;oiseau tranquille avant d&#39;appliquer un stress léger (fermeture de la boîte et donc de capturer l&#39;oiseau), et la réponse de l&#39;oiseau à être pris au piège est enregistrée. La peau nue de l&#39;œil-région est larégion la plus chaude dans l&#39;image. Cela permet une extraction automatique de la température maximale oeil-région à partir de chaque trame d&#39;image, suivie par d&#39;autres étapes de filtrage de données manuelle suppression sources les plus fréquentes d&#39;erreurs (motion blur, clignotant). Ce protocole prévoit une série de temps de la température oeil-région avec une résolution temporelle fine qui nous permet d&#39;étudier la dynamique de la réponse au stress de façon non invasive. D&#39;autres travaux doivent démontrer l&#39;utilité de la méthode pour évaluer le stress, par exemple pour étudier si la réponse de la température oeil-région est proportionnelle à la force du facteur de stress. Si cela peut être confirmé, il fournira une méthode alternative valable de l&#39;évaluation du stress chez les animaux et sera utile à un large éventail de chercheurs de écologues, biologistes de la conservation, des physiologistes aux chercheurs de bien-être animal.

Résultats de 9 mésanges bleues vivant en liberté sont présentés, qui illustrent l&#39;information qui peut être obtenu à partir de l&#39;imagerie thermique et de démontrer que le signal prédit de stress dans l&#39;œil-région de la température de l&#39;oiseau peut être détecté dans les animaux en liberté. Chaque oiseau a été filmé pour une moyenne de 5,1 ± 0,9 s (n = 9) avant que la boîte «porte était fermée. Cela a permis le calcul de l&#39;œil-région de la température de l&#39;oiseau intact (température de base) à laquelle toutes les mesures ultérieures peut être appelé. Dans des tests effectués sur 20 sec clips vidéo thermique de mésanges bleues non perturbées arrivant et d&#39;alimentation dans un piège (n = 9 oiseaux différents de ceux utilisés pour l&#39;application d&#39;un stress léger), les corrélations de r&gt; 0,7 ont été trouvés à exister entre le maximum température oeil-région a enregistré pendant les 5 premières secondes, et le maximum enregistré dans le 10, 15 et 20 premières secondes (Figure 3). Cela a été interprété comme une indication que le VA maximaleLue enregistré dans les quelques premières secondes après l&#39;entrée du piège était représentatif du niveau à long terme, et la température moyenne oeil-région pendant environ 5 secondes précédant immédiatement la boîte de fermeture ont été utilisés comme valeur de référence. Les mésanges bleues de cet échantillon avaient un niveau de référence de la température moyenne de 38,4 ± 0,5 ° C (moyenne ± SE) eye-région et variaient de 35,8 à 39,9 ° C (n = 9). Une fois que l&#39;oiseau introduit pendant 5 secondes pour permettre le calcul de la température oculaire région de base, la porte de la boîte a été fermée par l&#39;expérimentateur. Tous les oiseaux ont remarqué la fermeture de la boîte comme en témoignent leurs vols d&#39;évacuation tentatives. Lors de la fermeture de la trappe, la température eye-région a baissé rapidement et a atteint une température eye-région minimum ~ 1,3 ° C inférieure à la température de référence après ~ 10 sec (figure 4). La figure 4 représente la courbe composite sur la base de l&#39;oculaire maximale région la température de tous les neuf personnes en moyenne pour chaque seconde. Comme letiming et l&#39;ampleur de la chute de température eye-région varie entre les individus les masques de courbe composite le véritable mesure de la réponse en température. La chute de la température moyenne calculée pour chaque individu séparément est 2,0 ± 0,2 ° C et le point le plus bas est atteint après 9,4 ± 2,8 sec (moyenne ± SE). Dès lors, la température oeil-région est revenue progressivement à la température de référence oeil-région au cours des 2-3 min après, mais n&#39;a pas tout à fait atteint le niveau de référence d&#39;ici la fin de l&#39;essai. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53184/53184fig1.jpg" /> Figure 1. L&#39;arène de tournage. Le set-up dans le domaine a été conçu pour attirer les oiseaux vers le champ de vision de la caméra où un facteur de stress aigu doux pourrait être appliqué, en utilisant une boîte d&#39;alimentation. Le set-up est composée de 25 par 14 cm et 16,5 cm de haut boîte construit à partir de contreplaqué, avec un panneau avant de treillis métallique galvanisé avec un SIZ d&#39;ouverturee de 1 par 2,5 cm. Le maillage permet rayonnement infrarouge de passer à travers, ce qui rend possible de filmer les oiseaux tandis que l&#39;intérieur du set-up. Treillis métallique a été choisi, comme le verre et la plupart des plastiques ne transmettent pas de rayonnement infrarouge. Un trou de 60 mm de diamètre a été coupé dans la paroi d&#39;extrémité gauche pour permettre oiseau entrer dans le set-up et d&#39;accéder à la nourriture placée à l&#39;extrémité droite de la boîte. Une sonde de l&#39;enregistreur de température en sandwich entre deux carrés de ruban isolant noir (indiquée par une flèche noire) est fixé à l&#39;angle supérieur droit de la face avant d&#39;enregistrer une température de référence. Le facteur de stress aigu doux est appliqué à l&#39;intérieur de l&#39;oiseau par la fermeture de la boîte. Tirer sur une ligne de pêche attaché à une porte tournante au trou d&#39;entrée acceptés l&#39;expérimentateur pour fermer la boîte quand un oiseau est à l&#39;intérieur. La caméra d&#39;imagerie thermique situé en face du piège enregistre toute la séquence des événements. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53184/53184fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande o</a>f ce chiffre. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53184/53184fig2.jpg" /> Figure 2. image thermique d&#39;une mésange bleue. La majorité des corps d&#39;un passereau est bien isolée par des plumes (ou dans une moindre mesure par des échelles de la jambe), mais la peau autour de l&#39;œil est exposé et rayonne plus de chaleur dans des circonstances normales, et est entouré par tégument refroidisseur ou de fond. Ceci est illustré dans cette image thermique par la couleur jaune (le plus élevé de température) autour de l&#39;œil, l&#39;orange, la couleur rouge, violet et bleu signifie des températures plus fraîches et plus fraîches. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53184/53184fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53184/53184fig3.jpg" /> Figure 3. répétabilités de température de base mesurées over différentes périodes de temps. Les coefficients de corrélation entre la température maximale enregistrée dans le premier 1-8 sec d&#39;un clip et la «moyenne des maximums» au sein de 0,5º de la plus haute valeur enregistrée pour le 10, 15 et 20 premières secondes de la Clip (représenté par des lignes rouges, bleus et verts, respectivement). Toutes les séquences ont une durée de 20 secondes (n = 9). Lors de l&#39;analyse initiale en utilisant un ensemble de données plus vaste, un certain nombre de «moyens de les maximums» ont été calculées à partir de seulement 1 valeur, et a donné la même valeur pour rho travers toutes les comparaisons. Ces clips ont été retirés de l&#39;analyse, ne laissant que ceux où les moyens ont été calculés à partir de plus de 3 mesures. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53184/53184fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/53184/53184fig4.jpg" /> Figure 4. Réponsede la température oeil-région au piégeage. Il est un signal très clair et prononcé de l&#39;événement de piégeage reflète dans le changement de température oeil-région au fil du temps. Pour des comparaisons entre individus qui varient dans leur température de référence, la température résiduelle eye-région, en tant que différence de la température réelle et la température de référence de cet individu, est tracée sur l&#39;axe vertical. Ceci est fonction du temps avec la fermeture du piège tendu à 0 et l&#39;oiseau éliminés du piège après 3 min. La ligne rouge montre la température moyenne résiduelle et de la bande grise représente l&#39;intervalle de confiance de 95%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53184/53184fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Thermal Imaging to Study Stress Non-invasively in Unrestrained Birds

Il existe un besoin pour une évaluation non invasive de stress. Ce document décrit un protocole simple en utilisant l&#39;imagerie thermique pour détecter une réponse significative de la température oeil-région dans les mésanges bleues sauvages à un stress aigu doux.

Imagerie thermique pour l&#39;étude de stress non-invasive chez les oiseaux illimités

Stress, a central concept in biology, describes a suite of emergency responses to challenges. Among other responses, stress leads to a change in blood ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.3K vues.  University of Glasgow.  Il existe un besoin pour une évaluation non invasive de stress. Ce document décrit un protocole simple en utilisant l'imagerie thermique pour détecter une réponse significative de la température oeil-région dans les mésanges bleues sauvages à un stress aigu doux. 

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Rapid Determination of the Thermal Nociceptive Threshold in Diabetic Rats

Painful diabetic neuropathy (PDN) is characterized by hyperalgesia i.e., increased sensitivity to noxious stimulus, and allodynia i.e., hypersensitivity to normally innocuous stimuli1. Hyperalgesia and allodynia have been studied in many different rodent models of diabetes mellitus2. However, as stated by B&ouml;lcskei et al, determination of "pain" in animal models is challenging due to its subjective nature3. Moreover, the traditional methods used to determine behavioral responses to noxious thermal stimuli usually lack reproducibility and pharmacological sensitivity3. For instance, by using the hot-plate method of Ankier4, flinch, withdrawal and/or licking of either hind- and/or fore-paws is quantified as reflex latencies at constant high thermal stimuli (52-55 &deg;C). However, animals that are hyperalgesic to thermal stimulus do not reproducibly show differences in reflex latencies using those supra-threshold temperatures3,5. As the recently described method of B&ouml;lcskei et al.6, the procedures described here allows for the rapid, sensitive and reproducible determination of thermal nociceptive thresholds (TNTs) in mice and rats. The method uses slowly increasing thermal stimulus applied mostly to the skin of mouse/rat plantar surface. The method is particularly sensitive to study anti-nociception during hyperalgesic states such as PDN. The procedures described bellow are based on the ones published in detail by Alm&aacute;si et al 5 and B&ouml;lcskei et al 3. The procedures described here have been approved the Laboratory Animal Care and Use Committee (LACUC), Wright State University.

Here, we describe a rapid reliable and simple procedure to determine the lowest temperature at which rats or mice show nocifensive behavior, i.e. the thermal nociceptive threshold (TNT). This method applies a slowly increasing thermal stimulus allowing precise and reproducible estimation of TNTs with minimum, if any, stress to the animals.

Détermination rapide du seuil thermique nociceptive chez les rats diabétiques

Painful diabetic neuropathy (PDN) is characterized by hyperalgesia i.e., increased sensitivity to noxious stimulus, and allodynia i.e., hypersensitivity ...

Recherche

Neurosciences

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a "nocifensive" aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.

Méthodes locales et globales de l&#39;évaluation de nociception thermique dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Les larves

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

Potentiel de membrane Dye Imaging de ventromédian hypothalamus neurones de souris adulte à étudier Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted area of the brain, neural stem cells proliferate and constantly generate neuroblasts that migrate tangentially in chains along the rostral migratory stream (RMS) to reach the olfactory bulb (OB). Once in the OB, neuroblasts switch to radial migration and then differentiate into mature neurons able to incorporate into the preexisting neuronal network. Proper neuroblast migration is a fundamental step in neurogenesis, ensuring the correct functional maturation of newborn neurons. Given the ability of SVZ-derived neuroblasts to target injured areas in the brain, investigating the intracellular mechanisms underlying their motility will not only enhance the understanding of neurogenesis but may also promote the development of neuroregenerative strategies.
This manuscript describes a detailed protocol for the transfection of primary rodent RMS postnatal neuroblasts and the analysis of their motility using a 3D in vitro migration assay recapitulating their mode of migration observed in vivo. Both rat and mouse neuroblasts can be quickly and efficiently transfected via nucleofection with either plasmid DNA, small hairpin (sh)RNA or short interfering (si)RNA oligos targeting genes of interest. To analyze migration, nucleofected cells are reaggregated in &#39;hanging drops&#39; and subsequently embedded in a three-dimensional matrix. Nucleofection per se does not significantly impair the migration of neuroblasts. Pharmacological treatment of nucleofected and reaggregated neuroblasts can also be performed to study the role of signaling pathways involved in neuroblast migration.

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Neuroblast migration is a crucial step in postnatal neurogenesis. The protocol described here can be used to investigate the role of candidate regulators of neuroblast migration by employing DNA/small hairpin RNA (shRNA) nucleofection and a 3D migration assay with neuroblasts isolated from the rodent postnatal rostral migratory stream.

Nucléofection de rongeurs Neuroblastes à étudier neuroblaste migrations<em&gt; In vitro</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

Augmentation de la réponse du réseau à la stimulation des cultures cellulaires neuronales sur les tableaux de microélectrodes

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which enables them to seek out their preferred thermal landscape. To define the temperature preferences of larvae over a defined linear range, we developed an assay using a temperature gradient. To establish a single-directional gradient, two aluminum blocks are connected to independent water baths, each of which controls the temperature of individual blocks. The two blocks set the lower and upper limits of the gradient. The temperature gradient is established by placing an agarose-coated aluminum plate over the two water-controlled blocks so that the plate spans the distance between them. The ends of the aluminum plate that is set on the top of the water blocks defines the minimum and maximum temperatures, and the regions in-between the two blocks form a linear temperature gradient. The gradient assay can be applied to&#160;larvae of different ages and can be used to identify mutants that exhibit phenotypes, such as those with mutations affecting genes encoding TRP channels and opsins, which are required for temperature discrimination.

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

Here, we present a protocol to determine the preferred environmental temperature of Drosophila larvae using a continuous thermal gradient.

Un dosage de Gradient de température pour déterminer les préférences thermiques de larves de drosophile

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...

Combining Behavior and EEG to Study the Effects of Mindfulness Meditation on Episodic Memory

Although there has been recent interest in how mindfulness meditation can affect episodic memory as well as brain structure and function, no study has examined the behavioral and neural effects of mindfulness meditation on episodic memory. Here we present a protocol that combines mindfulness meditation training, an episodic memory task, and EEG to examine how mindfulness meditation changes behavioral performance and the neural correlates of episodic memory. Subjects in a mindfulness meditation experimental group were compared to a waitlist control group. Subjects in the mindfulness meditation experimental group spent four weeks training and practicing mindfulness meditation. Mindfulness was measured before and after training using the Five Facet Mindfulness Questionnaire (FFMQ). Episodic memory was measured before and after training using a source recognition task. During the retrieval phase of the source recognition task, EEG was recorded. The results showed that mindfulness, source recognition behavioral performance, and EEG theta power in right frontal and left parietal channels increased following mindfulness meditation training. In addition, increases in mindfulness correlated with increases in theta power in right frontal channels. Therefore, results obtained from combining mindfulness meditation training, an episodic memory task, and EEG reveal the behavioral and neural effects of mindfulness meditation on episodic memory.

Here we present a protocol for combining mindfulness meditation training, an episodic memory task, and EEG to understand the behavioral and neural effects of mindfulness meditation on episodic memory.

Combiner le comportement et l’EEG pour étudier les effets de la méditation de pleine conscience sur la mémoire épisodique

Although there has been recent interest in how mindfulness meditation can affect episodic memory as well as brain structure and function, no study has ...

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. Imaging studies are widely used to investigate their function and plasticity in physiological and pathological conditions. Because of their size and structure, localization studies of proteins require high-resolution imaging techniques. In this protocol, we describe a procedure to study in primary neurons the co-localization of target proteins with synaptic markers at a super-resolution level using structured illumination microscopy (SIM). SIM is a patterned-light illumination technique that doubles the spatial resolution of wide-field microscopy, reaching a detail of around 100 nm. The protocol indicates the required controls and settings for robust co-localization studies and an overview of the statistical methods to analyze the imaging data properly.

This protocol shows how to employ super-resolution microscopy to study protein co-localization in primary neuronal cultures.

Imagerie super-résolution pour étudier la co-localisation des protéines et des marqueurs synaptiques dans les neurones primaires

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Imagerie du calcium chez la souris Olive inférieure

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Assessment of Sensory Thresholds in Dogs Using Mechanical and Hot Thermal Quantitative Sensory Testing

Quantitative sensory testing (QST) is used to evaluate the function of the somatosensory system in dogs by assessing the response to applied mechanical and thermal stimuli. QST is used to determine normal dogs&#39; sensory thresholds and evaluate alterations in peripheral and central sensory pathways caused by various disease states, including osteoarthritis, spinal cord injury, and cranial cruciate ligament rupture. Mechanical sensory thresholds are measured by electronic von Frey anesthesiometers and pressure algometers. They are determined as the force at which the dog exhibits a response indicating conscious stimulus perception. Hot thermal sensory thresholds are the latency to respond to a fixed or ramped temperature stimulus applied by a contact thermode.
Following a consistent protocol for performing QST and paying attention to details of the testing environment, procedure, and individual study subjects are critical for obtaining accurate QST results for dogs. Protocols for the standardized collection of QST data in dogs have not been described in detail. QST should be performed in a quiet, distraction-free environment that is comfortable for the dog, the QST operator, and the handler. Ensuring that the dog is calm, relaxed, and properly positioned for each measurement helps produce reliable, consistent responses to the stimuli and makes the testing process more manageable. The QST operator and handler should be familiar and comfortable with handling dogs and interpreting dogs&#39; behavioral responses to potentially painful stimuli to determine the endpoint of testing, reduce stress, and maintain safety during the testing process.

This work describes a standard protocol for mechanical and hot thermal quantitative sensory testing to evaluate the somatosensory system in dogs. Sensory thresholds are measured using an electronic von Frey anesthesiometer, pressure algometer, and hot contact thermode.

Évaluation des seuils sensoriels chez les chiens à l’aide de tests sensoriels quantitatifs mécaniques et thermiques chauds

Quantitative sensory testing (QST) is used to evaluate the function of the somatosensory system in dogs by assessing the response to applied mechanical ...