This work was supported by a BBSRC project grant to DMcK, DMcC and RGN (BB/K002775/1) and a PhD studentship [to JP, BB/J013854/1]. We gratefully acknowledge the fantastic advice on technical equipment and field techniques that we received throughout the project from Nozrat Mirzai (Bioelectronics Unit University of Glasgow), Ross McLeod and Matthew Clavey (ThermalVision Research) as well as SCENE for all their logistic support of the field work. We would also like to thank Debbie Kelton at Veracity for generously providing equipment used to power the thermal imaging camera in the field.

Declaração de Ética: O trabalho envolveu um método de armadilhagem de rotina de vida livre de pequenos pássaros aprovados pela British Trust for Ornithology eo protocolo de captura provocando um estresse leve na ave foi levada a cabo ao abrigo de licenças UK Home Office. 1. Set-up para filmagens <ol><li> Criar uma filmagem set-up onde as aves são incentivados a se posicionar na frente da câmera (Figura 1). O pássaro entra no set-up através de um buraco em uma parede final e tem acesso a comida perto da parede de extremidade oposta. </li><li> A fim de habituar as aves para o set-up, proporcionar uma alimentação adequada (por exemplo, grãos de amendoim) no alimentador de várias semanas antes da gravação. Além de prestação de alimentos, deixe o set-up sem serem incomodados. Durante este período, colocar um tripé manequim em frente do alimentador para permitir que as aves também habituar à câmara. </li><li> No dia da gravação, reduzir o availabilidade de grãos de amendoim no set-up através da remoção de todos os restantes alimentos a partir do alimentador e substituí-lo com comida contida em um recipiente transparente com apenas um pequeno buraco no centro na parte superior através do qual as aves podem acessar a comida. Posicionar este recipiente de alimento no centro da gaiola na extremidade oposta ao orifício de entrada. </li><li> Coloque um pequeno quadrado preto de fita isolante de emissividade conhecida ao do tegumento natural em um dos cantos da malha da caixa para que apareça em todas as imagens. Fixar a fita de isolamento preto para um termopar ligado a um registador de temperatura que regista a temperatura da fita de isolamento preto com uma resolução de 0,1 ° C a cada 1 segundo. </li><li> Coloque a câmara de imagem térmica 50 cm a partir do centro da armadilha de caixa, de modo que toda a caixa se encaixa dentro do campo de visão da câmara, e aves que se alimentam a partir do recipiente claro irá ser posicionada na zona da câmara de foco. Ligue a câmara a um computador portátil, configure a câmera<html> para gravar imagens em, em média, de 7,5 quadros por segundo (com um carimbo de tempo), e enviar imagens para o disco rígido do laptop para ser salvo lá. </li><li> Anexar uma linha de pesca para a porta rotativa do set-up e estendê-lo para uma posição onde o experimentador está escondido da vista dos pássaros, mas o set-up ainda pode ser observado - cerca de 20 m do set-up. </li></ol> 2. As filmagens de Resposta de Pássaro para um Estresse Agudo Mild <ol><li> Uma vez que um pássaro entra na caixa de alimentação, deixe a ave sem ser perturbado na caixa de cerca de 5 segundos. </li><li> Puxe a linha de pesca após o pássaro tinha gasto cerca de 5 segundos na caixa para fechar a caixa de alimentação. Tome cuidado para que a ave ainda está na extremidade da caixa, a fim de minimizar o risco de lesões para o pássaro. </li><li> Abordar imediatamente a caixa de alimentação e ficar imóvel por trás da câmera por cerca de 3 min. Em seguida, recuperar o pássaro da caixa e deixá-lo ir. </li></ol>&quot;&gt; 3. Extração de Eye-região Temperatura de imagens térmicas <ol><li> Extrair temperatura máxima de cada quadro. Nota: A temperatura máxima foi praticamente sempre gravada de dentro da região em torno do olho, delimitada pela pele exposta do anel periophthalmic (Figura 2), e é daqui em diante referida como temperatura de olho-região. <ol><li> Na Termografia Análise Software com o botão direito na imagem, &quot;adicionar&quot; um novo enredo para o máximo de imagem. Em seguida, clique direito sobre o enredo que exporta os dados (temperatura olho-região e do tempo o quadro foi levado) para um arquivo CSV. </li></ol></li><li> Excluir a partir do arquivo CSV todas as linhas de quadros onde o olho-região do pássaro não era visível. </li><li> Traçar temperatura máxima contra o tempo em I 27, aponta identificar manualmente onde picos de temperatura&gt; 0,2 ºC entre duas leituras sucessivas quando a membrana nictitante foi puxado sobre o olho (piscando) e pontos com baixos valores de Outside a gama de temperaturas de corpo para as aves 28 (ou seja, quando olho-região era visível, mas através do movimento borrado para vários quadros) e, em seguida, remover as linhas relevantes do arquivo de dados CSV produzido durante o passo 3.1. </li><li> Medir a temperatura ambiente. <ol><li> Faça o download dos dados (tempo e temperatura logger) do registrador de temperatura em um computador e exportação em uma planilha. </li><li> Para obter a temperatura ambiente a partir da imagem térmica, na imagem térmica Software Análise desenhar um quadrado sobre a fita isolante preta que cobria a sonda de temperatura logger, em seguida, clique direito sobre o quadrado e escolha &quot;Adicionar novo enredo&quot; para a temperatura média do quadrado. </li><li> Em seguida, clique direito que a trama, para exportar os dados (de tempo e temperatura IRT) para um arquivo CSV. Mesclar a série temporal de dois temperatura resultante de logger de temperatura e combinando imagem térmica para o tempo em uma planilha. </li></ol></li><li> Corrigir olho-região temperature contra a temperatura ambiente. Exportar a planilha criada no passo 3.4 para o arquivo CSV de harmonização para o tempo. Para cada temperatura olho-região retido adicionar a diferença entre o registrador de temperatura e os valores de temperatura derivada de imagens térmicas (logger de temperatura - temperatura IRT), medida ao mesmo tempo. </li><li> Realizar automático de filtragem para remover baixos valores menos precisos olho-região de temperatura utilizando o algoritmo de busca de pico (veja Suplementar arquivo de código) para extrair os pontos mais altos (e, portanto, mais precisos) nos dados automaticamente. Nota: O algoritmo de busca de pico reorganiza os dados de temperatura para um vector com uma largura definida pelo utilizador (extensão), extensão recomendada = 3, extraindo o valor central em linhas em que os números de ambos os lados são mais baixos, ou seja, os picos. </li><li> Use interpolação linear para fechar as lacunas deixadas por sequências quando nenhum pico foi extraído, e quando olho-região não era visível. Use o comando na.approx (zoo pacote v1.7-11 em R 27) para dar um valor único de temperatura por segundo para cada indivíduo. </li><li> No ficheiro de dados CVS, adicionar um valor de 0,2 para cada temperatura de olho-região para corrigir o efeito de tomar as imagens através de uma malha. Nota: Os testes mostraram que quando um corpo negro, aquecida para aproximar temperatura corporal média ave de ~ 41 ºC na sua fase ativa 28, foi fotografada através da janela de malha com o mesmo tamanho de malha, usado nas filmagens set-up, as temperaturas registradas por a câmera de imagem térmica em áreas não obscurecidas pelos fios foram de 0,2 ºC inferiores aos valores obtidos sem a malha interveniente (diferença média = -0,2 ºC ± 0,085 SD, n = 30, faixa de temperatura de corpo negro = 41,6-42,5 ºC). Nota: Este é o factor de correcção específico para as condições deste estudo e é susceptível de variar com o instrumento faz, eo tipo ea largura da malha entre o animal ea câmera, e em cada situação precisa ser estabelecido para o spcondições de estudo ecific. </li><li> Das temperaturas olho-região máxima registrada desde antes da caixa foi fechada selecionar o valor mais elevado, que constituirão a temperatura olho-região da linha de base da ave sem ser perturbado. Adicionar esta temperatura olho-região da linha de base como uma nova coluna para o arquivo CVS (baseline). Em seguida, subtrair o valor da linha de base de cada retido valor máximo da temperatura olho-região, gerando uma nova coluna no arquivo de dados CVS. Nota: Este novo valor agora expressar a resposta da ave ao estresse agudo leve como desvio de sua temperatura basal sem serem incomodados. </li><li> Traçar os desvios da temperatura máxima olho-região a partir da temperatura olho-região da linha de base de todos os indivíduos a partir de depois de a armadilha foi fechada usando o comando ggplot (pacote ggplot2 v1.0.0 em R 27). Gerar bootstrap intervalos de confiança de 95% usando o mean_cl_boot opção (pacote ggplot2 v1.0.0 em R 27). Para mais detalhes consulte o arquivo Código Suplementar. </li&gt; </ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

O objetivo deste artigo é descrever a metodologia necessária para medir as mudanças na temperatura da pele de um animal de vida livre em resposta a um estressor agudo. Este estudo demonstrou que variações bruscas de temperatura da pele associadas a uma resposta de estresse agudo em aves selvagens podem ser capturados de forma não invasiva usando IRT. Este procedimento envolveu cinco etapas importantes (1) Projeto de campo apropriado set-up usando um sistema de imagens térmicas altamente portátil, (2) a medição da temperatura basal, (3) a aplicação de um fator de estresse leve envolvendo capturar o pássaro no set-up, (4) post hoc de amostragem de temperatura olho-região e (5) a calibração de dados de temperatura extraídos automatizado. A metodologia aqui descrita foi aplicada à captura de tetas azul selvagem. Temperaturas olho-região de linha de base representativos podem ser capturados em tão pouco quanto 5 seg. O tempo estimado necessário para gravar um pássaro no campo foi de cerca de 1 hora, com mais uma hora necessária para processar a3 min sequência de vídeo térmica. Coletando bons dados sobre a temperatura de um animal pele requer imagens térmicas de alta qualidade. Câmeras de imagem térmica só diferem fundamentalmente das câmeras de luz visível em termos de comprimento de onda da radiação eletromagnética que eles detectam e, assim, muitos dos conceitos que se aplicam em fotografia (por exemplo, campo de visão, profundidade de campo) também se aplicam em termografia. Tal como comumente praticada por fotógrafos de vida selvagem, qualquer local que um animal Visitas previsivelmente, onde naturais (por exemplo, locais de nidificação) ou artificiais (por exemplo, alimentadores), poderia ser utilizado para a recolha de imagens térmicas. Atrair animais para a câmera ao invés de tentar segui-los embora seu habitat tem a vantagem de nos permitir configurar a câmera com antecedência, para coletar imagem de alta qualidade com o mínimo de perturbação, logo que o animal vem na vista. No entanto, com esta abordagem, é vital para examinar ou conta para os efeitos doNesse contexto específico de medição sobre o estresse ou a temperatura da pele. Por exemplo, aqui, as aves foram medidos em um contexto de alimentação, e comida foi usada para atrair ativamente mamas azuis para o set-up. Pesquisa sobre galinhas sugere que experiências positivas agudas, como a antecipação e consumo de uma recompensa alimentar em um ensaio de aprendizagem associativa pode temperatura olho também inferior 29. Como tal, &quot;níveis basais&quot; de indivíduos que entram este conjunto particular up pode ser influenciada pela associação desse ato com a recompensa. Esta possibilidade justifica investigação adicional, embora, se presente, é de esperar que aumentar a gota a partir dos níveis de base já observada. Além disso, a termogénese ocorre com a digestão dos alimentos, embora não se espera que os efeitos específicos de alimentos consumida durante a medição da linha de base para elevar significativamente a temperatura dentro do período de 3 min 30 aprisionamento. Esta limitação considerado, medindo todos os animais comno mesmo contexto também é uma grande força desta abordagem. Os resultados representativos mostraram que houve uma grande variação na temperatura olho-região entre particulares perante o estressor agudo foi aplicado (baseline temperatura olho-região). A variação da temperatura da linha de base do olho (coeficiente de variação = 3,9%) pode ser em parte devido a um erro de medição ou um reflexo verdadeiro do diferenças entre-indivíduo. O período da câmara IRT registada a temperatura da fita de isolamento preto ao longo de 5 segundos quando a temperatura da fita não se alterou, o coeficiente de variação médio era de 0,26% (intervalo de 0,08% a 0,59%). Apesar de erro de medição é provável que seja maior numa ave movê-lo, no entanto, indicam que a maior parte desta variação de temperatura olho-região de linha de base é, de facto entre indivíduos. A noção de relativamente pequeno erro de medição sobre as aves que se deslocam é ainda apoiada pela alta repetibilidade de temperatura olho-região mais de 20 segundos durante as medições da linha de base ( <strong&gt; Figura 3). Ao controlar de contexto, podemos garantir que todas as aves estavam envolvidos na mesma atividade. Nós também podemos minimizar contribuições ambientais no momento da medição para entre-se variações na temperatura da pele, por exemplo, garantindo que a localidade é protegido da radiação incidente de confusão que, por imagem térmica, levam a uma sobrestimação da temperatura da superfície do animal . Isto pode ser feito com o trabalho na sombra ou por máscaras colocadas estrategicamente, incluindo plásticos mais transparentes que bloqueiam comprimentos de onda infra-vermelho. O protocolo aqui apresentado mostra uma configuração simples que poderia ser facilmente aplicada à situação de invernada mamas azuis. A tit azul foi filmado enquanto em uma caixa de alimentação com um telhado sólido que evitar a exposição à luz solar directa. Esta configuração também pode ser aplicado a muitos outros passeriformes que regularmente vêm para alimentadores artificiais em certas épocas do ano. Como melharucos azuis são comparativamente pequenos animais, elesprecisam ser filmado close-up para capturar um bom nível de detalhe. Tal como acontece com câmeras fotográficas, ficando perto do assunto - tanto em termos de distância real, e ampliação - reduz drasticamente a profundidade de campo. Para que as aves tão grande quanto possível no campo de visão requerido a partir de filmar los distância mínima de focagem da câmara, que neste caso foi de 500 mm e profundidade de campo reduzida a 40 mm. Portanto, todos os recursos das filmagens set-up devem ser concebidos para incentivar os animais para mostrar a sua cabeça dentro da zona relativamente estreita de foco da câmera particular usado. Em resposta a um estressor aguda leve bem estabelecida a um animal que esperávamos rápidas mudanças no padrão de fluxo sanguíneo, a partir da periferia para o centro via vasoconstrição simpaticamente mediada que reduz a temperatura da pele 17. A região periorbital foi escolhido como este fornecida a única região do corpo que foi não isolada e é associados com uma rica rede entrelaçar de pequenos vasos sanguíneos, o ophthalmicum rete que pode afetar a perda de calor a partir do olho 31. A taxa de quadros rápido da técnica videoing térmica era capaz de mostrar uma queda na temperatura do olho-região de aproximadamente 2 ° C em 10 segundos, seguido por um subsequente aumento da temperatura a menos de 0,5 ° C de linha de base dentro de 3 min. Embora arrefecimento periférico em resposta ao stress moderado foi gravado anteriormente em cerca de 1 min intervalos 17,26, 32, a técnica aqui mostrou que a queda máxima de temperatura podem ser extremamente rápido. Com resolução de tempo inferior a magnitude desse efeito pode ser desperdiçada. Isto pode ser importante quando se compara as diferenças na resposta ao stress de diferentes indivíduos. A re-aquecimento da ave depois da &quot;luta ou fuga&quot; resposta rápida não retornou ao nível de base como a ave permaneceu dentro da caixa que indica que a ave permaneceu fisiologicamente estressado. As aves foram libertaçãod do experimental set-up após um ponto de corte escolhido arbitrariamente de cerca de 3 min para minimizar o período de retenção de um animal de vida livre. No entanto, no futuro, os ensaios podem ter de ser superior para gravar a resposta completa temperatura até que a temperatura do olho-região do animal regressou ao nível da linha de base, se logisticamente possível. Este novo protocolo que envolve uma série de imagens coletadas antes e após o estressor foi aplicado agora permite estudo detalhado da dinâmica da resposta ao estresse agudo, e as comparações de múltiplos pontos temporais entre animais individuais. Repetindo este julgamento dentro de indivíduos com mais diferentes épocas do ano ou condições ambientais podem permitir que os efeitos do ambiente sobre a linha de base ou temperatura pós-aguda da pele estresse a ser desembaraçada, como um possível caminho para avaliação do estresse crônico também. . A temperatura da pele de um pássaro é dependente não só sobre a produção eo calor metabólicoo fluxo de sangue, mas também na troca de calor da radiação solar, velocidade do vento e molhando 25. Isso impede piso molhado e ventoso de gravações termográficas precisos. A temperatura olho-região gravado por uma câmera de imagem térmica pode, às vezes, quer ser subestimada (erro negativo) ou superestimado (erro positivo). Erro positivo substancial exigiria entrada de energia, mas isso foi evitado pelo pássaro na caixa de alimentação que está sendo protegido do sol. Uma outra fonte de erro positivo incluídos quando o pássaro piscou. Ocasionalmente, a ave puxa brevemente sua membrana nictitante sobre o olho-região e, uma vez que é armazenada internamente a uma temperatura mais próxima da do corpo do núcleo, piscando dá uma leitura anormalmente alta temperatura quando se cobre o globo ocular. Isto é, no entanto, facilmente detectada, uma vez que deixa uma assinatura muito marcado e o quadro afectado pode ser removido. A principal razão para um erro negativo em nossos registros foi borrão de movimento. Qualquer movimento rápido demais para ser capturado sharply pela taxa de quadros da câmera confunde os dados capturados a partir do pequeno olho-região quente da imagem com a da área (motion blur) legal circundante, resultando em uma subestimação da temperatura olho-região. Assim, após a remoção de erros positivos isso faz com que a temperatura máxima medida de olho-região a medição mais precisa e uma filtragem automática utilizando o comando picos função remove as menos prováveis ​​valores mais baixos de temperaturas máximas olho-região. Além disso, como a radiação infravermelha é absorvida pelo vapor de água, a temperatura da superfície gravada será influenciado pela humidade relativa do meio ambiente. Isso pode ser explicado pela introdução da temperatura do ar, umidade relativa e distância para o objeto em análise de imagem térmica software de análise. No entanto, uma abordagem mais precisa e eficiente (como aqui realizada) é a de incluir um corpo de referência de temperatura conhecida e emissividade dentro do campo de visão. No nosso caso, este foium quadrado preto de fita isolante com uma emissividade de 0,97, que é aproximadamente equivalente ao do tegumento naturais 33. Isto permite calibrar a temperatura olho-região usando a diferença entre os valores reais e térmicos de temperatura derivada de imagiologia medidos para a fita de isolamento. A temperatura da superfície do corpo negro pode então ser usado para calibrar as imagens continuamente durante todo o período de medição. Graças aos avanços tecnológicos no desenvolvimento das câmeras térmicas podem agora ser implementados como pequenas câmeras leves, capazes de coletar muitos quadros por segundo durante longos períodos de tempo. Apesar de imagem térmica é uma técnica amplamente utilizada na pesquisa aviária 25, o tamanho ea despesa de sistemas de imagens térmicas têm restringido seu uso em estado selvagem. Neste estudo, o sistema foi altamente portátil, custa aproximadamente. £ 6.000 e vídeo térmica fornecida alta resolução capaz de forma não invasiva a captura te precisasdados mperatura de animais de vida livre, sem a necessidade de lidar com aves. Gravação em múltiplos quadros por segundo permite medições de alta resolução séries temporais de temperatura periférica e, portanto, oferece a possibilidade de explorar a dinâmica da resposta ao estresse agudo. Isto é difícil de conseguir com a amostra de glicocorticóide convencional, que é limitada pelo número de amostras que podem ser tomadas dentro de um período de tempo. Aqui nós ter extraído uma série temporal de temperatura olho-região com um intervalo de 1 segundo, o que foi suficiente para demonstrar a resposta da temperatura olho-região a um estressor agudo (captura), mas de alta resolução temporal, também seria possível. A acumulação de um grande número de imagens, no entanto, requer um certo nível de automatização na extracção de informação a partir das imagens. O protocolo descreve um processo semi-automatizado simples para extrair a temperatura máxima a partir de cada imagem. Fomos capazes de fazer isso como a região de interesse, o olho-region, sempre foi o local mais quente na imagem. Análise poderia ser mais problemático se regiões de interesse são mais complexas e podem exigir projetado software de reconhecimento de padrões (por exemplo, 34). Neste estudo alguma filtragem manual foi necessário para situações em que a temperatura olho-região estava acima ou abaixo do estimado, mas estes foram facilmente detectados, mas é claro que ainda automação é desejável. As medições de refrigeração periférica induzida pelo estresse por imagem térmica oferece uma adição valiosa para outras medidas fisiológicas de estresse e o aspecto não-invasiva desta técnica é altamente vantajoso para futuros estudos envolvendo animais em cativeiro e selvagens. Capturando a resposta completa stress, a termografia infravermelha claramente tem um grande potencial como uma ferramenta para avaliação do estresse. Para tornar-se uma alternativa não-invasiva para hormonal estabelecida e ensaios de temperatura do núcleo, porém, será necessário cross-validate entre estas medidas edeterminar se a temperatura da pele mostra a mesma proporcionalidade com intensidade estressor, ou seja, a extensão da resposta à temperatura da pele pode reflectir a força do estressor. Pesquisas futuras devem também abordar se a temperatura da pele capta estresse crônico. Enquanto SIH em resposta a um estressor agudo deverá ser transitória, a exposição recorrente a estressores agudos físicas ou psicológicas podem gerar elevação crônica da temperatura corporal 35,36. Se vasoconstrição contínua contribui para esta elevação do núcleo não foi testado explicitamente. No entanto, estudos correlatos sobre os seres humanos que sofrem de doenças relacionadas com o estresse crônico mostram reduzidas temperaturas de dedo 37. Um atributo final para explorar é valência: a capacidade de distinguir positivo de eventos negativos. Análises hormonais não pode distinguir valência 5, com níveis de glucocorticóides que aparecem para refletir o nível de excitação ao invés de estresse especificamente. Pesquisa sobre pente temperamentoature em galinhas domésticas expostas a estímulos aversivos e positivas sugerem a temperatura da pele pode ser semelhante semelhante a excitação geral 22,29. No entanto, nos seres humanos, diferentes estados emocionais provocam mudanças regional específico, temperatura da pele, por exemplo, o aquecimento e arrefecimento periorbital bochecha quando assustado 38, mas no geral a diminuição da temperatura da pele quando rindo 39. As comparações entre diferentes regiões pode ainda revelar o estado emocional. Usando as recomendações estabelecidas neste artigo, será possível abordar todas estas perguntas, e validar a temperatura da pele como um marcador não-invasivo de stress.

O stress é um conceito central na biologia, descrevendo a resposta de emergência de um organismo em resposta a um desafio ambiental tentativa de restaurar a homeostase 1,2. Sob estresse, glicemia, ácidos graxos e os teores de aminoácidos, frequência cardíaca, frequência respiratória e taxa metabólica tudo aumento, e sangue é desviado da periferia para os órgãos centrais 2. Este padrão genérico de alterações fisiológicas prepara o animal a ser capaz de responder rapidamente e de forma adaptativa a uma série de problemas sociais e fisiológicas. Embora reconhecendo e compreendendo o estresse está no coração de ambos investigação pura e aplicada animal, avaliar o estresse em animais desenfreado permanece um desafio. Um marcador amplamente utilizado fisiológica do stress é o aumento nos níveis de hormonas glucocorticóides, como o cortisol e corticosterona 1,2 circulante. A grande vantagem desta abordagem é que as suas concentrações aumentam in proporção de estressores intensidade, permitindo que o estresse de ser quantificado. No entanto, os glicocorticóides não são hormônios &#39;stress&#39; em si, mas mobilizadores de lojas de energia 2. Como tal, os níveis de glucocorticóides também mudar com os requisitos de energia, hora do dia, da idade e estado reprodutivo 3,4, bem como na resposta a situações aparentemente positivos, tais como oportunidade de acoplamento 5. Níveis de glucocorticóides, portanto, devem ser interpretados com cautela e dentro de um contexto. Medição da resposta glucocorticóide ao estresse agudo também tem algumas limitações. Um estressor aguda desencadeia uma resposta dinâmica dos níveis de glucocorticóides inicialmente crescente e, subsequentemente, voltar a um nível de linha de base de 1,2. Amostras de glucocorticóides são normalmente obtidas de forma invasiva, por meio de amostragem de sangue, que é um estressor em si mesmo e, portanto, pode afetar os níveis de glicocorticóides medidos 6. Além disso os níveis de glucocorticóides só pode ser medido em um ou muito pouco tempo points, que pode não capturar variação nos níveis de pico e tempo de resposta ou duração, limitando nossa capacidade de analisar a mudança através do tempo da resposta ao estresse dinâmico dentro dos indivíduos. Métodos não-invasivos de amostragem hormonal, como a partir de fezes 7, pêlos ou penas 8, medir os níveis de glicocorticóides médios durante uma escala de tempo mais longo, de dias ou meses, embora útil para estudar estressores crônicos, não são aplicáveis ​​ao estudo de estresse agudo . Como até mesmo os melhores métodos estabelecidos oferecem apenas uma perspectiva limitada sobre a variação em estresse agudo entre os indivíduos, há uma necessidade de uma metodologia alternativa em medições de estresse fisiológico. Como a resposta ao stress envolve uma série de efeitos fisiológicos, há outros candidatos que poderiam indicar o stress. Entre outros, simpaticamente vasoconstrição mediada por canais de sangue a partir da periferia para o centro do corpo. Esta concentração de sangue e, portanto, calor, juntamente com várias formass de termogênese induzida pelo estresse, aquece o núcleo 9. Como tal, o aquecimento central, denominado hipertermia induzida por stress (SIH) também tem sido utilizada como um marcador de stress agudo em Pharmaceutical Research 10. SIH tipicamente eleva a temperatura corporal por 0,5-1,5 ° C no prazo de 10-15 min de um estressor agudo 10. É um fenômeno relativamente bem documentado que um estressor experimental comumente aplicado de captura e manipulação de um animal pode elevar a temperatura corporal central em uma variedade de mamíferos e aves 11 - 17. É importante ressaltar que SIH correlaciona-se com outros indicadores estabelecidos de estresse, tais como freqüência cardíaca 18, os níveis de glicocorticóides 19 e comportamento 20,21. E, assim como os níveis de glucocorticóides, temperatura central foi linearmente relacionado com o nível de estresse em algumas espécies 22. No entanto, como com a amostragem de sangue, a medição da temperatura do núcleo é invasiva, em si, o que requer a inserçãoR implantação de uma sonda de 10. Temperatura do núcleo basal aumenta gradualmente cada vez que a manipulação ou sonda de inserção de indução de estresse deve ser repetido 23. Recentes desenvolvimentos no equipamento de gravação de temperatura que permitem acessar dados remotamente pode fornecer uma solução, pelo menos para animais de grande porte 24. Dentro do mesmo mecanismo que gera SIH, no entanto, encontra-se ainda um outro marcador de potencial o stress: a vasoconstrição periférica, que se move no sangue, e com ele o calor, para o núcleo arrefece simultaneamente a pele 17. Ao contrário de temperatura de núcleo, temperatura da pele pode ser medida totalmente não-invasiva, por termografia infravermelha (IRT). IRT converte a radiação infravermelha emitida a partir da superfície de um objecto para a temperatura de 25. Como a superfície de um animal normalmente tem alguns remendos a partir do qual a temperatura da pele podem ser derivadas diretamente, ele requer acesso a pele naturalmente exposto (por exemplo, área em torno de tele olho) ou a criação de um patch nua por aparar pêlos ou penas. De acesso fornecido a uma área exposta adequada da pele e o animal pode ser guardado no campo de visão da câmara, câmaras de IRT pode ser usado para recolher as medições de temperatura da pele contínuas remotamente, possivelmente permitindo que a resposta completa temperatura a ser filmado e comparadas entre indivíduos . Embora já tenha sido demonstrado em galinhas que a superfície temperatura responde à grave estresse 26, a novidade deste estudo é que ele mede a temperatura do corpo de superfície de animais selvagens em uma resolução mais fina temporais do que estudos anteriores e também mostra que a queda de temperatura da pele esperado pode ser detectada no campo onde a temperatura, umidade e tempo são variáveis. O objetivo deste artigo é descrever a metodologia necessária para medir a temperatura da pele de um animal sem restrições usando imagens térmicas. Nós usamos captura para induzir um estresse agudo leve em vida livre mamas azul (caeruleus de Cyanistes, Linnaeus 1758 </em&gt;) e descrevem como capturar imagens adequado, analisar as imagens e processar os dados para produzir curvas de resposta de temperatura em função do tempo demonstram que um arrefecimento significativo da temperatura da pele das aves em resposta ao estressor leve. Isso pode proporcionar um método alternativo valioso para avaliar o estresse em animais selvagens e em cativeiro úteis para uma ampla gama de pesquisadores de ecologistas, biólogos da conservação e fisiologistas para pesquisadores de bem-estar animal. O estudo foi realizado no período entre 17 de Dezembro de 2013 e 4 de Janeiro de 2014, em um carvalho decíduo (Quercus spp.) Floresta no Centro Escocês de Ecologia e Meio Ambiente Natural (CENA), da Universidade de Glasgow na costa oriental de Loch Lomond, centro-oeste da Escócia (56.13 ° N, 4,13 ° W). O protocolo envolve três etapas principais: (1) Criação de condições adequadas sob as quais a captura de imagens térmicas de um animal livre-variando, (2) applying de um estressor agudo, tendo um vídeo térmico, e (3) a extracção e processamento de dados a partir das imagens térmicas que podem então ser utilizados para caracterizar a resposta do animal ao estressor aguda. No nosso caso, atraiu a-viver livre passerine, o tit azul a uma caixa de alimentação (filmando set-up), onde foram otimizadas as condições de captura de imagem térmica, e depois aplicado um esforço de captura fechando a caixa de alimentação remotamente quando o pássaro estava dentro . A descrição de captura de imagem térmica e de extracção de dados é específico para o equipamento foi utilizado, e pode variar entre sistemas de imagens térmicas. O processamento de dados é descrito usando um software open-source.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Thermal Imaging Camera</td>
			<td>FLIR</td>
			<td>A65 (f=25mm)</td>
			<td>Compact (106 &#215; 40 &#215; 43 mm) &#38; low cost</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Image Analysis Software</td>
			<td>FLIR</td>
			<td>ResearchIR v3.4</td>
			<td>Allows high speed thermal video recording and thermal pattern analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature logger</td>
			<td>Gemini Data Loggers</td>
			<td>Tinytag Talk 2 TK-4023-PK</td>
			<td>Monitors from -40 to +125&#176;C using accompanying temperature probe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

thermal imaging to study stress non-invasively in unrestrained birds

Estresse, um conceito central na biologia, descreve um conjunto de respostas de emergência para os desafios. Entre outras respostas, estresse leva a uma alteração no fluxo sanguíneo que resulte num fluxo líquido de sangue para os órgãos principais e um aumento na temperatura central. Este hipertermia induzida pelo stress é utilizado para avaliar o stress. No entanto, a medição da temperatura do núcleo é invasivo. Como o fluxo de sangue é redireccionada para o núcleo, a periferia do corpo pode arrefecer. Este documento descreve um protocolo onde a temperatura corporal periférica é medida de forma não invasiva em mamas azuis selvagens (Cyanistes caeruleus), utilizando a termografia infravermelha. No campo, criamos um set-up trazer os pássaros para uma posição ideal na frente da câmera usando uma caixa de iscas. A câmera tira uma gravação de vídeo térmico curto da ave sem ser perturbado antes de aplicar um fator de estresse leve (fechar a caixa e, portanto, capturar o pássaro), e da resposta do pássaro a ser preso é gravado. A pele nua de olho-região é azona mais quente na imagem. Isto permite uma extração automática da temperatura máxima do olho-região de cada quadro de imagem, seguido por outras medidas de filtragem de dados manual removendo as fontes mais comuns de erros (borrão de movimento, piscando). Este protocolo prevê uma série temporal de temperatura olho-região com uma resolução temporal fina que nos permite estudar a dinâmica da resposta ao estresse de forma não invasiva. Mais trabalho precisa de demonstrar a utilidade do método para avaliar o stress, por exemplo, para investigar se a resposta de temperatura do olho-região é proporcional à força do estressor. Se isso pode ser confirmado, ele irá fornecer um método alternativo valiosa de avaliação do estresse em animais e será útil para uma vasta gama de pesquisadores de ecologistas, biólogos da conservação, fisiologistas para pesquisadores de bem-estar animal.

Os resultados de 9 tetas azul de vida livre são apresentados que ilustram a informação que pode ser obtida a partir de imagens térmicas e demonstram que o sinal predito de stress na temperatura olho-região da ave pode ser detectada em animais livres na natureza. Cada ave foi filmado por uma média de 5,1 ± 0,9 seg (n = 9) antes que a caixa &#39;porta estava fechada. Isto permitiu o cálculo da temperatura olho-região da ave sem ser perturbado (temperatura basal) para que todas as medidas subseqüentes podem ser referidos. Em testes realizados em 20 seg videoclipes térmica de mamas azuis não perturbadas que chegam e alimentação dentro de uma armadilha (n = 9 aves diferentes das utilizadas para a aplicação de um fator de estresse leve), correlações de r&gt; 0,7 foram encontrados a existir entre o máximo temperatura olho-região gravado durante os primeiros 5 segundos, ea máxima registrada no primeiro 10, 15 e 20 segundos (Figura 3). Isso foi interpretado como indicando que o va máximalue registrados nos poucos segundos iniciais após a entrada armadilha era representativa do nível de longo prazo, ea temperatura média olho-região durante aproximadamente 5 segundos imediatamente anterior encerramento caixa foram utilizados como valor de referência. As mamas azuis nesta amostra tinha uma temperatura olho-região basal médio de 38,4 ± 0,5 ° C (média ± SE) e variou 35,8-39,9 ° C (n = 9). Uma vez que a ave alimentados durante 5 segundos para permitir o cálculo da temperatura olho-região de linha de base, a caixa de porta foi fechada pelo experimentador. Todas as aves notado o fechamento do caixa como evidenciado por seus vôos tentativa de fuga. Após o fecho da armadilha, a temperatura do olho-região caiu rapidamente e chegou a uma temperatura mínima de olho-região ~ 1,3 ° C abaixo da temperatura da linha de base após 10 seg ~ (Figura 4). A Figura 4 mostra a curva composta com base no máximo ocular temperatura região de todos os nove indivíduos médios para cada segundo. Como ocalendário ea magnitude da queda de temperatura olho-região varia entre os indivíduos das máscaras curva composta a verdadeira extensão da resposta de temperatura. A queda de temperatura média calculada para cada indivíduo é separado de 2,0 ± 0,2 ° C e o ponto mais baixo é alcançada após 9,4 ± 2,8 segundos (média ± EP). A partir de então, a temperatura olho-região voltou gradualmente aos temperatura olho-região da linha de base sobre a seguinte 2-3 min, mas não chegou a atingir a linha de base até o final do julgamento. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53184/53184fig1.jpg" /> Figura 1. A arena filmagens. O set-up no campo foi concebida para atrair as aves para o campo de visão da câmara, onde um estressor aguda ligeira podia ser aplicado, utilizando uma caixa de alimentação. O set-up consistiu de um 25 por 14 cm e 16,5 cm de altura construído a partir da caixa de madeira compensada, com um painel frontal da tela de arame galvanizado com uma abertura size de 1 por 2,5 centímetros. A malha permite que a radiação infravermelha para passar, fazendo o possível para filmar aves, enquanto dentro do set-up. Malha de arame foi escolhido, como o vidro ea maioria dos plásticos não transmitem radiação infravermelha. Um buraco de 60 mm de diâmetro foi cortado na parede extremidade esquerda para permitir pássaro entrar no set-up e ter acesso à comida colocado na extremidade direita da caixa. A sonda de temperatura logger imprensado entre dois quadrados de fita isolante preta (marcado pela seta preta) está ligado ao canto superior direito do painel frontal para gravar uma temperatura de referência. O estressor aguda leve é ​​aplicado para a ave no interior, fechando a caixa. Puxando uma linha de pesca ligado a uma porta rotativa no orifício de entrada do experimentador permitidos para fechar a caixa, quando uma ave está dentro. A câmara de imagem térmica ajustada na frente da armadilha registra toda a seqüência de eventos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53184/53184fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior o</a>esta figura f. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53184/53184fig2.jpg" /> Figura 2. Imagem térmica de um melharuco azul. A maioria do corpo de um passeriforme é bem isolado por penas (ou, em menor medida por escalas de perna), mas a pele ao redor dos olhos é exposto e irradia mais calor em circunstâncias normais, e é cercado por tegumento refrigerador ou o fundo. Isso é mostrado nesta imagem térmica pela cor amarela (temperatura mais elevada) em torno do olho, a laranja, vermelho, roxo e azul significar temperaturas mais frias e mais frias. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53184/53184fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53184/53184fig3.jpg" /> Figura 3. As estimativas de temperatura de linha de base medidos óver diferentes períodos de tempo. Os coeficientes de correlação entre a temperatura máxima registrada na primeira 1-8 sec de um clipe eo &#39;média dos máximos&#39; dentro de 0,5º do maior valor registrado para o primeiro 10, 15 e 20 segundos do clipe (representado por linhas vermelhas, azuis e verdes, respectivamente). Todos os grampos foram 20 s de duração (n = 9). Durante a análise inicial usando um conjunto de dados maior, uma série de dos meios de os máximos &quot;foram calculados a partir de apenas um valor, e deu o mesmo valor para rho em todas as comparações. Estes clipes foram retirados da análise, deixando apenas aqueles em que as médias foram calculadas a partir de mais de 3 medições. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53184/53184fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53184/53184fig4.jpg" /> Figura 4. Respostada temperatura olho-região para trapping. Há um sinal muito claro e pronunciado da armadilhagem reflete na mudança de temperatura, olho-região ao longo do tempo. Para comparação entre os indivíduos que variam em sua temperatura inicial, a temperatura do olho-região residual, como a diferença da temperatura real e de temperatura de linha de base do indivíduo, é representada no eixo vertical. Esta é traçada em função do tempo com o fecho da armadilha definido como 0 e a ave removido da armadilha após 3 min. A linha vermelha mostra a temperatura média residual ea faixa cinzenta representa o intervalo de confiança de 95%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53184/53184fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Thermal Imaging to Study Stress Non-invasively in Unrestrained Birds

Existe uma necessidade para uma avaliação não-invasiva do stress. Este documento descreve um protocolo simples usando imagens térmicas para detectar uma resposta significativa na temperatura olho-região em mamas azuis selvagens a um estressor agudo leve.

Thermal Imaging para estudo de estresse não-invasiva em aves Unrestrained

Stress, a central concept in biology, describes a suite of emergency responses to challenges. Among other responses, stress leads to a change in blood ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.3K visualizações.  University of Glasgow.  Existe uma necessidade para uma avaliação não-invasiva do stress. Este documento descreve um protocolo simples usando imagens térmicas para detectar uma resposta significativa na temperatura olho-região em mamas azuis selvagens a um estressor agudo leve. 

Vídeo: Thermal Imaging to Study Stress Non-invasively in Unrestrained Birds

Rapid Determination of the Thermal Nociceptive Threshold in Diabetic Rats

Painful diabetic neuropathy (PDN) is characterized by hyperalgesia i.e., increased sensitivity to noxious stimulus, and allodynia i.e., hypersensitivity to normally innocuous stimuli1. Hyperalgesia and allodynia have been studied in many different rodent models of diabetes mellitus2. However, as stated by B&ouml;lcskei et al, determination of "pain" in animal models is challenging due to its subjective nature3. Moreover, the traditional methods used to determine behavioral responses to noxious thermal stimuli usually lack reproducibility and pharmacological sensitivity3. For instance, by using the hot-plate method of Ankier4, flinch, withdrawal and/or licking of either hind- and/or fore-paws is quantified as reflex latencies at constant high thermal stimuli (52-55 &deg;C). However, animals that are hyperalgesic to thermal stimulus do not reproducibly show differences in reflex latencies using those supra-threshold temperatures3,5. As the recently described method of B&ouml;lcskei et al.6, the procedures described here allows for the rapid, sensitive and reproducible determination of thermal nociceptive thresholds (TNTs) in mice and rats. The method uses slowly increasing thermal stimulus applied mostly to the skin of mouse/rat plantar surface. The method is particularly sensitive to study anti-nociception during hyperalgesic states such as PDN. The procedures described bellow are based on the ones published in detail by Alm&aacute;si et al 5 and B&ouml;lcskei et al 3. The procedures described here have been approved the Laboratory Animal Care and Use Committee (LACUC), Wright State University.

Here, we describe a rapid reliable and simple procedure to determine the lowest temperature at which rats or mice show nocifensive behavior, i.e. the thermal nociceptive threshold (TNT). This method applies a slowly increasing thermal stimulus allowing precise and reproducible estimation of TNTs with minimum, if any, stress to the animals.

Determinação rápida do limiar térmico nociceptivo em ratos diabéticos

Painful diabetic neuropathy (PDN) is characterized by hyperalgesia i.e., increased sensitivity to noxious stimulus, and allodynia i.e., hypersensitivity ...

Neurociência

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a "nocifensive" aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.

Métodos locais e globais de Avaliação nocicepção térmica em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

Sequencial de foto-branqueamento de delinear células de Schwann individuais na junção neuromuscular

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

Membrana Potencial Dye imagem de Ventromedial Hipotálamo Neurônios de camundongos adultos para estudar Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

Aumento Time-dependente na resposta da rede à estimulação de culturas de pilha neuronais em matrizes do micro-elétrodo

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which enables them to seek out their preferred thermal landscape. To define the temperature preferences of larvae over a defined linear range, we developed an assay using a temperature gradient. To establish a single-directional gradient, two aluminum blocks are connected to independent water baths, each of which controls the temperature of individual blocks. The two blocks set the lower and upper limits of the gradient. The temperature gradient is established by placing an agarose-coated aluminum plate over the two water-controlled blocks so that the plate spans the distance between them. The ends of the aluminum plate that is set on the top of the water blocks defines the minimum and maximum temperatures, and the regions in-between the two blocks form a linear temperature gradient. The gradient assay can be applied to&#160;larvae of different ages and can be used to identify mutants that exhibit phenotypes, such as those with mutations affecting genes encoding TRP channels and opsins, which are required for temperature discrimination.

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

Here, we present a protocol to determine the preferred environmental temperature of Drosophila larvae using a continuous thermal gradient.

Um gradiente de temperatura de ensaio para determinar preferências térmicas de larvas de Drosophila

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...

Combining Behavior and EEG to Study the Effects of Mindfulness Meditation on Episodic Memory

Although there has been recent interest in how mindfulness meditation can affect episodic memory as well as brain structure and function, no study has examined the behavioral and neural effects of mindfulness meditation on episodic memory. Here we present a protocol that combines mindfulness meditation training, an episodic memory task, and EEG to examine how mindfulness meditation changes behavioral performance and the neural correlates of episodic memory. Subjects in a mindfulness meditation experimental group were compared to a waitlist control group. Subjects in the mindfulness meditation experimental group spent four weeks training and practicing mindfulness meditation. Mindfulness was measured before and after training using the Five Facet Mindfulness Questionnaire (FFMQ). Episodic memory was measured before and after training using a source recognition task. During the retrieval phase of the source recognition task, EEG was recorded. The results showed that mindfulness, source recognition behavioral performance, and EEG theta power in right frontal and left parietal channels increased following mindfulness meditation training. In addition, increases in mindfulness correlated with increases in theta power in right frontal channels. Therefore, results obtained from combining mindfulness meditation training, an episodic memory task, and EEG reveal the behavioral and neural effects of mindfulness meditation on episodic memory.

Here we present a protocol for combining mindfulness meditation training, an episodic memory task, and EEG to understand the behavioral and neural effects of mindfulness meditation on episodic memory.

Combinando Comportamento e EEG para Estudar os Efeitos da Meditação Mindfulness na Memória Episódica

Although there has been recent interest in how mindfulness meditation can affect episodic memory as well as brain structure and function, no study has ...

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. Imaging studies are widely used to investigate their function and plasticity in physiological and pathological conditions. Because of their size and structure, localization studies of proteins require high-resolution imaging techniques. In this protocol, we describe a procedure to study in primary neurons the co-localization of target proteins with synaptic markers at a super-resolution level using structured illumination microscopy (SIM). SIM is a patterned-light illumination technique that doubles the spatial resolution of wide-field microscopy, reaching a detail of around 100 nm. The protocol indicates the required controls and settings for robust co-localization studies and an overview of the statistical methods to analyze the imaging data properly.

This protocol shows how to employ super-resolution microscopy to study protein co-localization in primary neuronal cultures.

Imagem de super-resolução para estudar co-localização de proteínas e marcadores sinápticos em neurônios primários

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Imagem de cálcio em rato de azeitona inferior

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Assessment of Sensory Thresholds in Dogs Using Mechanical and Hot Thermal Quantitative Sensory Testing

Quantitative sensory testing (QST) is used to evaluate the function of the somatosensory system in dogs by assessing the response to applied mechanical and thermal stimuli. QST is used to determine normal dogs&#39; sensory thresholds and evaluate alterations in peripheral and central sensory pathways caused by various disease states, including osteoarthritis, spinal cord injury, and cranial cruciate ligament rupture. Mechanical sensory thresholds are measured by electronic von Frey anesthesiometers and pressure algometers. They are determined as the force at which the dog exhibits a response indicating conscious stimulus perception. Hot thermal sensory thresholds are the latency to respond to a fixed or ramped temperature stimulus applied by a contact thermode.
Following a consistent protocol for performing QST and paying attention to details of the testing environment, procedure, and individual study subjects are critical for obtaining accurate QST results for dogs. Protocols for the standardized collection of QST data in dogs have not been described in detail. QST should be performed in a quiet, distraction-free environment that is comfortable for the dog, the QST operator, and the handler. Ensuring that the dog is calm, relaxed, and properly positioned for each measurement helps produce reliable, consistent responses to the stimuli and makes the testing process more manageable. The QST operator and handler should be familiar and comfortable with handling dogs and interpreting dogs&#39; behavioral responses to potentially painful stimuli to determine the endpoint of testing, reduce stress, and maintain safety during the testing process.

This work describes a standard protocol for mechanical and hot thermal quantitative sensory testing to evaluate the somatosensory system in dogs. Sensory thresholds are measured using an electronic von Frey anesthesiometer, pressure algometer, and hot contact thermode.

Avaliação dos Limiares Sensoriais em Cães Utilizando Testes Sensoriais Quantitativos Mecânicos e Térmicos a Quente

Quantitative sensory testing (QST) is used to evaluate the function of the somatosensory system in dogs by assessing the response to applied mechanical ...