The authors were supported by: a CancerFree KIDS Research Grant, a March of Dimes Basil O&#8217;Connor Starter Scholar Award (#5-FY14-32), a Cincinnati Children&#8217;s Hospital Medical Center (CCHMC) Trustee Grant Award; a CCHMC Research Innovation and Pilot Funding Award; and CCHMC developmental funds. Authors also acknowledge the Capel laboratory for the initial optimization of this technique.

Toutes les souris utilisées dans ces études étaient des souris CD-1 obtenues auprès de Charles River Laboratories. Précédentes expériences de culture ont également été réalisées sur d&#39;autres souches, telles que des souris C57BL / 6J (données non présentées), mais toute souche peut être utilisée. Femmes adultes enceintes sont âgés d&#39;environ 2-3 mois et ont été euthanasiés par inhalation de CO 2 suivie d&#39;une dislocation cervicale et la thoracotomie bilatérale avant le retrait de l&#39;embryon. Les souris ont été logés conformément aux directives du NIH et protocoles expérimentaux ont été approuvés par le soin et l&#39;utilisation des animaux Commission institutionnelle Hospital Medical Center de Cincinnati Children. 1. Préparation des instruments, Culture Media, et les plats <ol><li> Préparer une solution d&#39;éthanol à 70%. L&#39;eau déminéralisée autoclave (pour faire des chambres humidifiés et pour la fabrication de solutions de dilution /). Stériliser les outils de dissection (forceps, ciseaux, et 27 g d&#39;aiguilles des seringues) par pulvérisation vers le bas avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Préparer10X tampon phosphate salin (PBS) contenant du calcium et du magnésium (80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, 2,4 g de KH 2 PO 4, 6,75 ml de 1 M CaCl2, 3,75 ml de 1 M de MgCl2 ). Remuez pour dissoudre dans 1 L d&#39;eau à l&#39;autoclave stérile et puis filtrer avec un papier filtre. Diluer 10 fois avec de l&#39;eau pour faire du PBS 1X. </li><li> Inactiver la chaleur de sérum bovin fœtal (FBS) à 55 ° C pendant 30 min et stériliser par filtration avec un filtre à seringue de 0,22 um. </li><li> Préparer 38 ml 1X milieu de culture complet (appelé DMEM complet, cDMEM), constitué de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), 10% filtré dilution de chaleur FBS inactivé et 1/100 de la pénicilline-streptomycine stock. Ceci devrait être habituellement utilisée fraîche, mais peut être conservé à 4 ° C pendant 1 mois. </li><li> Reconstituer le VEGFR Kinase Inhibitor II Tyrosine (TKI II) dans le DMSO pour une concentration stock de 5 mg / ml, et diluer avec de stock cDMEM pour obtenir une solution de travail. Le con finalecentration de cette étude est de 1,875 ug / ml dans cDMEM. Selon les recommandations de la société, les solutions mères sont stables jusqu&#39;à 6 mois à -20 ° C. Quant aux solutions de travail, assurez-fraîche et utiliser le même jour. Remarque: La concentration de ce médicament dans la solution de travail doit être deux fois supérieure à la concentration finale désirée (car il sera dilué deux fois dans la goutte). Dans le même temps, préparer le même volume de cDMEM contenant le même volume de DMSO pour le traitement de &quot;contrôle&quot;. </li><li> Préparer les réactifs queue de digestion (NaOH 50 mM et 1 M de Tris-HCl [pH 8,0]) séparément dans de l&#39;eau distillée. </li><li> Faire un bilan de 25 uM des amorces PCR XY (XY Forward 5&#39;-TGA AGC TTT TGG CTT TGA G-3 &#39;et 5&#39;-XY inverse GCC CTG CCA AAT TCT TTG G-3&#39;) ensemble dans l&#39;eau sans nucléase. </li><li> Préparer tampon TAE 50X (242 g de base Trizma, 57,1 ml acide acétique glacial, 100 ml d&#39;EDTA 0,5 M, pH 8,5, et ajouter de l&#39;eau à 1 L file volume final). Préparez tampon Courir TAE 1X (20 ml 50X TAE dilué avec de l&#39;eau à 1 L de volume total). </li><li> Pour créer une solution à 2,5% d&#39;agarose (0,625 g d&#39;agarose, 0,5 ml 50X TAE Buffer, 24,5 ml d&#39;eau), une solution d&#39;agarose de chaleur au micro-ondes jusqu&#39;à ébullition, puis laisser refroidir jusqu&#39;à environ 55-65 ° C (mesure de toucher). Une fois refroidi, ajouter 2 pi de solution de bromure d&#39;éthidium à 1%, et versez gel. ATTENTION! Le bromure d&#39;éthidium est un mutagène et tératogène; s&#39;il vous plaît utiliser des gants en nitrile et le protocole de sécurité lors de la manipulation. En variante, d&#39;autres agents colorants ou de gel résoudre potentiellement moins toxiques peuvent être utilisés. </li><li> Préparer une solution de blocage (PBS avec 0,1% de Triton X-100, 10% de sérum bovin fœtal [FBS], et 3% d&#39;albumine de sérum bovin [BSA]) pour immunofluorescence. </li><li> Préparer la solution de lavage (PBS avec 0,1% de Triton X-100, 1% de FBS, et 3% de BSA) pour immunofluorescence. </li><li> Préparer PbTx (PBS avec 0,1% de Triton X-100) pour immunofluorescence. </li><li> Préparer les chambres d&#39;incubation pour culture. Remplissez de grands plats (100 mm de diamètre) de Petri avec 35 ml d&#39;eau à l&#39;autoclave. Placez près du lieu où la dissection et cultures seront effectuées. </li></ol> 2. Isolement des testicules du fœtus à partir de Mus musculus <ol><li> Vérifiez la souris femelle pour bouchons vaginaux chaque matin. Midi le jour où le bouchon vaginal est détecté est considéré E0.5. Euthanasier la souris femelle enceinte à E11.5, d&#39;une manière compatible avec les protocoles d&#39;animaux approuvés. </li><li> Pulvérisation vers le bas de l&#39;abdomen de la souris avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Ouvrez la peau du ventre et du péritoine avec une incision en forme de V à l&#39;aide de ciseaux fins et tirez lambeau de tissu pour exposer les organes intérieurs. </li><li> Repérez les ovaires aux deux extrémités de la corne utérine. Avec des ciseaux, couper à l&#39;ovaire et le tissu conjonctif de séparer l&#39;utérus contenant les embryons provenant du corps de la mère. </li><li> Ouvrez la paroi utérine en coupant doucement du côté opposé au placenta, exposant les sacs de jaune. Veillez à ne pas puncture jaune sac pour éviter d&#39;endommager ou de perdre les embryons. </li><li> Coupez près du placenta pour enlever les sacs de jaune contenant l&#39;embryon et les placer dans un plat contenant du PBS avec le calcium et le magnésium. La présence d&#39;ions calcium et magnésium permettra de molécules d&#39;adhésion cellulaire de support pour maintenir l&#39;architecture tissulaire et empêchent le tissu de coller aux outils de dissection. </li><li> Avec une pince, retirer la vésicule ombilicale et amnios de l&#39;embryon par ponction attentivement le sac jaune pour créer un trou dans lequel l&#39;embryon peut glisser. Une fois que l&#39;embryon est à l&#39;extérieur de la vésicule ombilicale, couper le cordon ombilical. </li><li> De ce point en avant, utiliser un microscope situé dans une hotte de culture de tissu stérile. Retirer la tête de l&#39;embryon et le jeter en pinçant avec des pinces de chaque côté du cou. </li><li> Retirer la queue et la placer dans nouveau tube pour l&#39;analyse PCR XY pour déterminer le sexe de l&#39;embryon. Remarque: Bien qu&#39;il est optimal de gonades de la culture dès que possible après la récolte, il est également possible pour éliminer l&#39;ADN de queue et effectuer XX / XY génotypage avant la culture, de sorte que le sexe de chaque embryon est connue et que le sexe désiré doit être mis en culture. Alors que le génotypage est fait, les embryons peuvent être tenus séparés (de sorte qu&#39;ils peuvent être suivis) à 4 ° C ou sur de la glace avant d&#39;être prêt pour la culture. Une mise en garde est que cette période en dehors in utero ou conditions de culture peut potentiellement affecter la viabilité de la culture ou le développement ultérieur au cours de la culture. </li><li> Fixez l&#39;embryon dans une position couchée sur le fond de la boîte de culture en épinglant les aisselles de l&#39;embryon avec une paire de pinces (généralement la pince détenus dans la main faible). Maintenir ces forceps en place pour maintenir l&#39;embryon encore pendant le processus de dissection entier. </li><li> Avec autre paire de pinces, retirer la peau recouvrant l&#39;abdomen et retirez délicatement le foie, les intestins et autres organes d&#39;exposer paroi arrière du corps. </li><li> Comme les gonades se trouve sur la paroi arrière du corps de chaque côté de l&#39;aorte dorsale,un grand navire de sang qui coule le long de la ligne médiane du corps, écope sous la crête urogénitale avec des pinces fermées et enlever la crête urogénitale en ouvrant la pince et soulevez. Comme les gonades seront mal fixés au mur, faites attention à ne pas tirer trop vite sans enlever ces raccordements ou les gonades peuvent étirer, causant des dommages aux organes. </li><li> Déplacez la crête urogénitale dans cDMEM dans un plat pour acclimater tissus aux médias. </li><li> Séparer le complexe gonades-mésonéphros du reste de la crête urogénitale en utilisant 27 g d&#39;aiguilles. Utilisez une aiguille pour couper en appuyant vers le bas, et utiliser l&#39;autre pour guider le tissu correctement pour permettre une séparation optimale. Évitez d&#39;utiliser un mouvement de sciage contre le fond plat, comme des aiguilles pointues vont créer des tessons de plastique qui peuvent se coller sur le tissu. Veillez à garder les mésonéphros complètement attachés à la gonade. </li></ol> 3. La culture des gonades avec un inhibiteur de petite molécule <ol><li> Placer les deux 20 μl pipettes à 15 pi de chacun. Couper environ 1-2 mm de l&#39;un des conseils barrière de pipette en utilisant une propre, stérilisé lame de rasoir pour le transfert des gonades et plus de contrôle cDMEM, tandis que l&#39;autre pipette sera utilisé uniquement pour cDMEM du traité par un médicament. </li><li> Alignez les gonades avec leur grand axe parallèle à la pointe de la pipette afin qu&#39;ils puissent facilement être pipette en utilisant la pointe de coupure. Méfiez-vous des gonades coller à l&#39;intérieur de la pointe de la pipette. </li><li> Attribuer un côté de la gouttelette de commande et l&#39;autre comme la gouttelette contenant un médicament. Seulement deux gouttelettes peuvent tenir sur un couvercle de boîte de 35 mm. Assurez-vous que les étiquettes sur les couvercles correspondent aux étiquettes sur des microtubes queue contenant le tissu. </li><li> Pipette 15 ul de cDMEM contenant un seul gonades dans une gouttelette dans le couvercle d&#39;un petit (35 mm) boîte de culture (utiliser uniquement les couvercles, car les fonds sont trop grand pour tenir dans une chambre de boîte de Pétri humidifié). Placez deux gouttelettes contenant des gonades distinctes de chaque côté de l&#39;assiette, bien séparés from une autre. Arrivée au microscope pour s&#39;assurer que les gonades ont été transférés à des gouttelettes. </li><li> Pour la gouttelette désigné comme le contrôle, ajouter un 15 pi supplémentaires de cDMEM contenant DMSO (faite à l&#39;étape 1.5) à faire une gouttelette avec un volume total de 30 pi. Utilisez uniquement le «contrôle» pipette qui ne sera pas contacter le médicament. </li><li> Pour l&#39;autre gouttelette (échantillon traité par le médicament), ajouter 15 ul de TKI-II contenant cDMEM effectuer une gouttelette d&#39;un volume total de 30 ul. Utilisez uniquement la pipette désigné pour les échantillons traités avec le médicament. </li><li> Utilisation de la pipette, étaler les gouttes selon un motif circulaire expansion jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient environ 15 à 18 mm de diamètre et la gonade se trouve à peu près au milieu. Orientez la gonade sorte qu&#39;il se trouve sur le côté et la gonade et mésonéphros sont facilement reconnaissables. Orientez le poumon de sorte que les deux lobes à plat. <ol><li> Bien que le diamètre des gouttelettes peut varier légèrement, veiller à ce que les gonades ne sont pas floating et sont maintenus en place par la tension de surface. Assurez-vous que les gouttelettes ne se touchent pas les uns les autres ou sur le côté du couvercle. Sans la tension de surface, les organes vont croître sur le couvercle pendant la culture et l&#39;aplatir, faussant ainsi la morphologie d&#39;organes. </li></ol></li><li> Placez délicatement le couvercle de la boîte de culture contenant les gouttelettes debout sur la surface de l&#39;eau dans le grand (100 mm) plat de l&#39;humidificateur. Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas de bulles emprisonnées sous le fond du couvercle et qu&#39;il soit bien à plat sur la surface de l&#39;eau. Ne pas inverser le couvercle et faire attention à ne pas laisser l&#39;eau toucher le haut du couvercle où se trouvent les gouttelettes. </li><li> Pour créer une petite chambre humide, couvrir immédiatement avec le couvercle de la boîte de l&#39;humidificateur plus grande pour enfermer les cultures des gonades. Agir aussi rapidement que possible afin de minimiser toute évaporation des médias. Veiller à ce que le plus petit plat a de la place entre lui et le couvercle de la plus grande antenne de se déplacer librement; autrement, une condensation peut faire un joint et bl&#39;échange d&#39;air verrouillage au tissu. </li><li> Une fois que deux petits couvercles sont placés dans la chambre, placer immédiatement la chambre dans l&#39;incubateur. Incuber les cultures de gouttelettes de 48 heures dans un incubateur à CO2 humidifié à 37 ° C. </li></ol> 4. Polymerase Chain Reaction pour déterminer le sexe des embryons <ol><li> Ajouter les queues embryonnaires de fond d&#39;un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. </li><li> Ajouter à chaque tube 200 ul de NaOH 50 mM. </li><li> Placez à 95 ° C pendant 15 min ou jusqu&#39;à ce que le tissu soit complètement dissous. </li><li> Ajouter 50 pi de Tris-HCl 1M et vortex légèrement et brièvement. </li><li> Dans un tube de 1,5 ml, faire un mélange maître PCR frais en multipliant chaque volume par le nombre total d&#39;échantillons: solution à 0,5 pi 25 uM d&#39;amorce, 2,5 pi 10X Taq Buffer, 0,5 pi 10 mM dNTP (nucléotides), 19,3 pi nuclease- eau libre, 0,2 ul ADN polymérase Taq. Bien mélanger. </li><li> Ajouter 23pi de PCR Master Mix PCR à tubes contenant 3 pi lysat de queues digérés. </li><li> Tubes de Flick à les mélanger, puis effectuer un essorage court pour apporter les échantillons au fond du tube. </li><li> Exécutez le programme XY (Short) PCR (Tableau 1). </li><li> Charger les échantillons (avec 5x colorant) et de l&#39;échelle dans un gel d&#39;agarose à 2,5% dans un tampon TAE 1X. </li><li> Exécutez l&#39;électrophorèse sur gel d&#39;agarose jusqu&#39;à bandes XX et XY peuvent être résolus. </li><li> L&#39;image du gel de capture d&#39;image avec de la lumière UV et. </li><li> Analyser le vs Y bandes spécifiques d&#39;un chromosome X-chromosome spécifique (chromosome X = 331 paires de bases [BP] et XY = 302 pb) 13; XY échantillons (hommes) auront deux bandes de 331 et 302 pb, tandis que les échantillons XX (femelles) apparaîtra comme une seule bande 331 pb. </li></ol> 5. Le total des immunofluorescence Mont Organ Jour 1: <ol><li> Retirez les gonades de la culture à l&#39;aide d&#39;une pipette de 1000 pi avec une pointe de coupure. Si on le désire, ils peuvent êtreplacé dans une boîte de PBS pour laver les milieux et réactifs. Placer dans PBS dans un tube de 0,5 ml à centrifuger. Le diamètre de tube inférieur permettra d&#39;économiser les réactifs et le rendre plus facile de garder une trace des échantillons dans le tube. <ol><li> Soyez sûr de garder le contrôle et les échantillons traités, ainsi que des échantillons XX et XY, dans des tubes séparés et les retirer de la culture avec des ensembles distincts de pipettes pour éviter toute contamination de la drogue. </li></ol></li><li> Laver les gonades deux fois avec PBS. De ce point sur, ce protocole peut utiliser PBS 1X manque calcium et le magnésium. Pour les laver, permettent les gonades pour couler au fond du tube (par gravité) puis retirez le liquide au-dessus. Veillez à ne pas perdre de gonades par pipetage trop près d&#39;eux. </li><li> Enlever autant que possible à partir de PBS le tube. Ajouter 250 pi de paraformaldehyde à 4% dans du PBS contenant 0,1% de Triton X-100, et laisser incuber O / N à 4 ° C sur une bascule. En variante, cette fixation peut se faire pendant 2 heures à 4 ° C sur une bascule. ATTENTION! Paraformaldehyde est une substance toxique, alors suivez le protocole de sécurité lors de la manipulation. </li></ol> Jour 2: <ol start="4"><li> Rincer les gonades deux fois dans 250 pi PbTx à TA. </li><li> Laver les gonades 3 fois avec 250 ul PbTx chacune pendant 10 minutes à température ambiante sur une bascule. </li><li> Bloquer les gonades au moins 1 heure dans 250 pi solution à la température ambiante sur une bascule de blocage. </li><li> Colorer les gonades O / N à 4 ° C sur une bascule dans 250 pi d&#39;anticorps primaire dilué dans la solution de blocage. </li></ol> Jour 3: <ol start="8"><li> Rincer les gonades deux fois dans 250 Solution de lavage ul. </li><li> Laver les gonades 3 fois avec 250 pi de la solution de lavage pendant 10 min à température ambiante chacun sur une bascule. </li><li> Bloquer les gonades 1 h dans 250 pi de solution de blocage à la température ambiante sur une bascule. </li><li> Couvrir le microtube de papier d&#39;aluminium pour protéger les anticorps secondaires fluorescents de la lumière. </li><li> Incuber les gonades 2-4 heures à température ambiante sur arocker dans 250 ul anticorps secondaire dilué dans la solution de blocage contenant Hoechst 33342. Alternativement, effectuer anticorps secondaire et Hoechst 33342 incubation O / N à 4 ° C sur la bascule. </li><li> Rincer les gonades deux fois dans 250 pi PbTx. </li><li> Laver les gonades 3 fois dans 250 pi PbTx chacune pendant 10 minutes à température ambiante sur une bascule. </li><li> En utilisant une pointe de pipette coupure, transférer gonades sur une lame de liquide minime. Retirer l&#39;excès de liquide à la pipette, mais assurez-vous que le tissu ne se dessèche pas. </li><li> Orientez les gonades dans la mode désirée avec une pince, et ajouter rapidement une goutte de milieu de montage pour monter les gonades sur la diapositive. Assurez-vous que les manteaux de médias de montage tous les échantillons complètement; il est essentiel d&#39;éviter de laisser sécher les échantillons. </li><li> Utilisez des lamelles (1.5 Numéro style) de taille appropriée pour couvrir délicatement échantillons. Laissez montage diffusion de médias pour communiquer avec toute la surface de la lamelle. Si nécessaire, appuyez très légèrement sur les coins de la lamelle couvre-objet de sorte queil n&#39;y a pas de grosses bulles d&#39;air. </li><li> Sceller les diapositives avec du vernis à ongles clair sur les bords pour réduire l&#39;évaporation des médias de montage. Magasin diapositives montées dans l&#39;obscurité à 4 ° C. </li></ol>

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Cell. 18, 175-189 (2010).</li><li>Brennan, J., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+tissue,+two+fates:+Molecular+genetic+events+that+underlie+testis+versus+ovary+development.">One tissue, two fates: Molecular genetic events that underlie testis versus ovary development.</a> Nat. Rev. Genet. 5, 509-521 (2004).</li><li>Martineau, J., Nordqvist, K., Tilmann, C., Lovell-Badge, R., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male-specific+cell+migration+into+the+developing+gonad.">Male-specific cell migration into the developing gonad.</a> Curr. Biol. 7, 958-968 (1997).</li><li>Yokonishi, T., Sato, T., Katagiri, K., Ogawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+spermatogenesis+using+an+organ+culture+technique.">In vitro spermatogenesis using an organ culture technique.</a> Methods Mol. Biol. 927, 479-488 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+production+of+functional+sperm+in+cultured+neonatal+mouse+testes.">In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes.</a> Nature. 471, 504-507 (2011).</li><li>Gohbara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+murine+spermatogenesis+in+an+organ+culture+system.">In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system.</a> Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Cette étude démontre un tout méthode de gouttelettes d&#39;organes ex vivo qui a de nombreuses applications potentielles pour étudier le développement du fœtus. Cette technique peut être utilisée pour de multiples organes, et permet au chercheur de répondre à des questions biologiques qui sont difficiles à examiner à l&#39;aide des approches in vivo en raison de l&#39;inaccessibilité des embryons et létalité embryonnaire potentiel. Cette méthode de culture a des avantages supplémentair...

La régénération des organes in vivo chez l&#39;homme est très limitée; par conséquent, l&#39;ingénierie tissulaire, le développement des tissus et organes à partir de cellules individuelles donnés par un hôte, devient une thérapie potentielle attractive pour le remplacement d&#39;organes. Cependant, pour cette stratégie thérapeutique soit couronnée de succès, les facteurs et les interactions cellulaires impliqués dans la morphogenèse de l&#39;organe doivent être soigneusement étudiés et bien compris. En raison de l&#39;incapacité d&#39;étudier le développement des organes spécifiques avec les approches traditionnelles, les chercheurs se sont tournés vers l&#39;embryon toute solution de rechange ou de cultures d&#39;organes entiers. Kalaskar et al. 1 ont montré que la culture ex vivo de l&#39;embryogenèse ensemble donne des résultats comparables (dans 58% des embryons cultivés) au développement in utero, suggérant que ex vivo des méthodes de culture sont une alternative possible pour les études de l&#39;organogenèse. Un système de culture d&#39;organe individualisé, tel que cette ex vivo droplet système de culture, pour l&#39;ensemble de l&#39;analyse permet d&#39;organe indépendant des effets systémiques, tout en permettant la manipulation d&#39;une voie de signalisation spécifique par l&#39;intermédiaire d&#39;interactions cellulaires ou addition de réactifs pharmacologiques ou des anticorps. Traditionnellement, l&#39;étude du développement des organes du fœtus a été limité à des technologies transgéniques et souris knock-out, en plus réactifs pharmacologiques livrés maternelle. Cependant, il ya des questions techniques concernant ces techniques et les traitements in vivo; la plupart des préoccupations tournent autour des effets d&#39;influencer divers organes simultanément, ce qui se traduit souvent par une létalité embryonnaire. Une inquiétude supplémentaire d&#39;études manipulant le développement du fœtus est pharmacologiquement l&#39;effet maternel de médicaments sur le développement embryonnaire in utero (par exemple, le métabolisme de la mère de la drogue avant qu&#39;elle atteigne l&#39;embryon) et si ces réactifs peuvent passer à travers la barrière placentaire. La technique de culture d&#39;organe entier décriteici a été adapté à partir d&#39;un premier protocole décrit par Maatouk et al. 2, dans laquelle les gonades fœtales entières sont mises en incubation dans des cultures ex vivo de gouttelettes verticaux. Un avantage important de la culture de gonades fœtales est que les inhibiteurs de petites molécules peuvent facilement accéder à tout l&#39;organe par simple diffusion. . DeFalco et al ont montré que l&#39;utilisation de cette méthode ex vivo gouttelette de culture conjointement avec les inhibiteurs à petites molécules peut être utilisée pour étudier les processus et les interactions qui se produisent au cours du développement des gonades 3 signalisation; ces processus serait difficile d&#39;examiner in vivo en raison de problèmes techniques (par exemple, le passage de la drogue à travers le placenta ou de létalité affectant plusieurs organes en utilisant des approches génétiques ou pharmacologiques). La culture de la gouttelette est non seulement une amélioration de certains aspects plus expérimentation in utero, mais il est aussi une amélioration par rapport in vitro et ex visystèmes vo ainsi. L&#39;utilisation de lignées de cellules pour étudier la morphogenèse est extrêmement difficile car ils ne possèdent pas les divers types de cellules, ne disposent pas des éléments essentiels matrice extracellulaire (ECM) qui permettent la formation de l&#39;architecture d&#39;organes, et peuvent présenter des artefacts dans les cascades de signalisation. Bien que l&#39;ingénierie tissulaire a apporté des améliorations significatives dans la création d&#39;échafaudages simulant ECM, le manque de connaissances à l&#39;égard de laquelle les signaux sont tenus par chaque type de cellule pendant l&#39;organogenèse, il est difficile de construire un système d&#39;organes in vitro. Autres ex vivo systèmes ont déjà été mis en place pour étudier l&#39;organogenèse, ou plus précisément la morphogenèse, et ont eu beaucoup de succès pour l&#39;imagerie en direct des organes du fœtus dans l&#39;agar 4, Transwells 5, 6, filtres et autres matrices d&#39;échafaudage 7,8. L&#39;avantage du système de culture de gouttelettes est qu&#39;il permet l&#39;étude de la morphogenèse en offrant la possibilité d&#39;utiliser moins de réactifs, qui sont des oouvent cher, mais donnant également la tension superficielle de l&#39;organe, ce qui est important pour la capacité de croissance et de signalisation 9. Chez la souris, la morphogenèse des testicules initiale a lieu entre embryonnaire (E) met en scène E11.5 et E13.5; Ces étapes comprennent la fenêtre temporelle optimale pour les facteurs qui influencent la différenciation spécifique du sexe d&#39;instruction. Parmi les processus critiques qui se produisent pendant la formation du testicule sont la génération de l&#39;architecture de la moelle testicule et la formation d&#39;un réseau vasculaire spécifique au testicule. En utilisant cette ex vivo système de culture de gouttelettes d&#39;organes ensemble, on est en mesure de modifier la vascularisation spécifique au mâle et inhiber testicule morphogenèse grâce à l&#39;utilisation d&#39;un inhibiteur à petite molécule qui bloque l&#39;activité des récepteurs de facteur de croissance vasculaire endothélial (VEGF); Remodelage vasculaire VEGF est critique pour le développement des testicules 10-12. Cette technique peut être appliquée avec succès à d&#39;autres organes et peut cibler temps spécifiquefenêtres de développement. Imagerie d&#39;organes totalité montage permet la visualisation des structures vitales ainsi que les changements structurels et cellulaires résultant de l&#39;administration de divers inhibiteurs. Surtout, ce système est avantageux en ce que le chercheur peut contourner les effets de confusion potentiels de l&#39;administration de drogues par la mère ou la perturbation systémique pendant vivo stratégies de gènes ciblés dans. Ainsi, toute cette ex vivo système de culture de gouttelettes organe peut améliorer de façon significative la capacité de comprendre les interactions et la signalisation qui se produisent spécifiquement dans des organes particuliers durant le développement fœtal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible</td>
			<td>Sally Hansen</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Strip 0.2 mL PCR Tubes &#38; Detached Flat Caps</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>T3218-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L P1000L, P200L, P20L, P10L, P2L</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C2170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C2176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;l SHARP Precision Barrier Tips</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P1096FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;l SHARP Precision Barrier Tips</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l SHARP Precision Barrier Tips</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P1122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;l SHARP Precision Barrier Tips</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe with 27gauge needles</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td>309623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>305559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;M PES syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1003-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria 35mm Easy Grip Style Cell Culture Dish</td>
			<td>Falcon/Corning</td>
			<td>353801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>CO14S-120-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td>Nuare</td>
			<td>NU-425-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-centrifuge&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-090-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioExpress GyroMixer Variable XL</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>R-3200-1XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950040015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMZ445 stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software</td>
			<td>Alpha Innotech Corporation</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute 200 proof Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2818-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S374-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S671-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2393-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion Nuclease-Free Water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9938&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY PCR Primer&#160;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2482-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Ethidium bromide solution</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1302-10</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>E-3120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>367176-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set, 100 mM Solutions</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer</td>
			<td>Denville</td>
			<td>CB-4050-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O4042-500</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorMount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Chloride (HCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A144212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td>0332-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100-nm filtered</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-600-511</td>
			<td>Heat-inactivate before using</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>676481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Sox9 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5535</td>
			<td>Use at dilution: 1:4,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553370</td>
			<td>Use at dilution: 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9661S</td>
			<td>Use at dilution: 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-1900</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate</td>
			<td>Invitrogen (Molecular Probes)</td>
			<td>H1399</td>
			<td>Use at 2ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>712-165-153</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>712-605-153</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A31572</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21208</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A31573</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using ex vivo upright droplet cultures of whole fetal organs to study developmental processes during mouse organogenesis

Enquêter organogenèse in utero est un processus techniquement difficile chez les mammifères placentaires raison de l&#39;inaccessibilité de réactifs à des embryons qui se développent dans l&#39;utérus. Une méthode ex vivo de culture vertical de gouttelettes nouvellement développé offre une alternative intéressante aux études réalisées in utero. La culture ex vivo de gouttelettes fournit la capacité d&#39;examiner et de manipuler les interactions cellulaires et des voies de signalisation divers grâce à l&#39;utilisation de divers composés blocage et d&#39;activation; en outre, les effets de divers réactifs pharmacologiques sur le développement des organes spécifiques peuvent être étudiés sans effets secondaires indésirables de l&#39;administration de médicaments systémiques in utero. Par rapport aux autres systèmes in vitro, la culture de gouttelettes permet non seulement de la capacité d&#39;étudier les interactions à trois dimensions morphogenèse et cellule-cellule, qui ne peuvent être reproduites dans des lignées cellulaires mammaliennes, mais nécessite également beaucoup moins de reagents autre que ex vivo et in vitro dans des protocoles. Ce document démontre la dissection de souris adéquat foetal des organes et des techniques de culture de gouttelettes verticaux, suivie par immunofluorescence organe entier pour démontrer l&#39;efficacité de la méthode. Le procédé ex vivo de culture de gouttelettes permet la formation de l&#39;architecture d&#39;organes comparables à ce qui est observé in vivo et peut être utilisé pour étudier les processus autrement difficiles à étudier en raison de la létalité embryonnaire dans des modèles in vivo. En tant que système d&#39;application de modèle, un inhibiteur à petite molécule sera utilisé pour sonder le rôle de la vascularisation dans la morphogenèse des testicules. Ce procédé ex vivo de la culture des gouttelettes est extensible à d&#39;autres systèmes d&#39;organes du foetus, comme les poumons et potentiellement d&#39;autres, bien que chaque organe doit être largement étudiés afin de déterminer les modifications spécifiques d&#39;organes au protocole. Ce système de culture d&#39;organe offre une flexibilité dans l&#39;expérimentation avec les organes du fœtus, et les résultats obtained en utilisant cette technique aidera les chercheurs à acquérir une meilleure compréhension du développement fœtal.

La culture ex vivo des gouttelettes permet de manipuler des organes entiers, tels que la gonade, pour étudier les interactions cellulaires et dynamique. La figure 1 montre d&#39;une façon pas à pas comment préparer une culture E11.5 gonadique de gouttelettes. Les premières étapes du protocole de culture comprennent la suppression initiale de l&#39;utérus contenant l&#39;embryon de la souris mère (Figure 1A et 1B). Après élimination de l&#39;utérus de la mère, la par...

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Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

The&#160;ex vivo&#160;upright droplet culture is an alternative to current&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo&#160;experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

Utilisation<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultures Upright gouttelettes de toute fœtus organes pour étudier les processus de développement au cours de la souris Organogenèse

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

using-ex-vivo-upright-droplet-cultures-whole-fetal-organs-to-study

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

12.4K vues.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. The ex vivo upright droplet culture is an alternative to current in vitro and in vivo experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

Vidéo: Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head and heart progenitor cell development with pharyngeal arches (also known as branchial arches) ex vivo. Using this method, we have recently described that the second pharyngeal arch contains self-renewing heart progenitors and serves as a microenvironment for expansion of the progenitors during mouse heart development. The progenitor cells remain undifferentiated and expansive inside the arch, but quickly become functional cardiomyocytes as they migrate out of the arch. We also reported that first pharyngeal arch contains muscle progenitors giving rise to myotubes after leaving the arch. Here, we demonstrate the procedure for the dissection and ex vivo culture of first and second pharyngeal arches from developing mouse embryos. The method enables one to study head and heart progenitor/muscle development, including cardiomyocyte and myotube formation in detail ex vivo.

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

Culture ex vivo des pharyngée Arches pour étudier cardiaques et musculaires progéniteurs et leur niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

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Biologie du développement

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.

The primary cilium is fundamentally important in neural progenitor cell proliferation, neuronal differentiation, and adult neuronal function. Here, we describe a method to study ciliogenesis and the trafficking of signaling proteins to cilia in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons using primary neurosphere cultures.

En utilisant les cultures primaires Neurosphère à étudier primaire Cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, especially, in plant reproductive biology. However, plant morphological, anatomical, and ultrastructural analyses traditionally involve time-consuming embedding and sectioning procedures for bright field, scanning, and electron microscopy. Recent progress in confocal fluorescence microscopy, state-of-the-art 3-D computer-aided microscopic analyses, and the continuous refinement of molecular techniques to be used on minimally processed whole-mount specimens, has led to an increased demand for developing efficient and minimal sample processing techniques. In this protocol, we describe techniques for properly dissecting Arabidopsis flowers and siliques, basic clearing techniques, and some staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

In this protocol, we describe techniques for the proper dissection of Arabidopsis flowers and siliques, some basic clearing techniques, and selected staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Entier-Montez de compensation et la coloration des Siliques et organes fleur Arabidopsis

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular mechanisms of CHDs is&#160;crucial for inventing new preventive and therapeutic strategies. Mutant mouse models are powerful tools to discover new&#160;mechanisms&#160;and environmental stress modifiers that drive cardiac development and their potential&#160;alteration in CHDs. However, efforts to establish the causality of these putative contributors have been limited to histological&#160;and molecular studies&#160;in non-survival animal experiments, in which&#160;monitoring the key physiological and hemodynamic parameters is&#160;often absent. Live imaging technology has become an essential tool to establish the&#160;etiology of CHDs. In particular,&#160;ultrasound imaging can be used prenatally without surgically exposing the fetuses,&#160;allowing maintaining&#160;their baseline physiology while monitoring the impact of environmental stress&#160;on the hemodynamic and structural aspects of cardiac chamber development. Herein, we use the High-Frequency Ultrasound (30/45)&#160;system to examine the cardiovascular system in fetal mice at E18.5 in utero at the baseline and in response to prenatal hypoxia exposure. We demonstrate the feasibility of the system to measure cardiac chamber size, morphology, ventricular function, fetal heart rate, and umbilical artery flow indices, and their alterations in fetal mice exposed to systemic chronic hypoxia in utero in real time.

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

High-frequency ultrasound imaging of the fetal mouse has improved imaging resolution and can provide precise non-invasive characterization of cardiac development and structural defects. The protocol outlined herein is designed to perform real-time fetal mice echocardiography in vivo.

Souris foetale Cardiovascular Imaging à l’aide d’un système à ultrasons de haute fréquence (30 / 45MHZ)

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. Moreover, although existing culture techniques allow biochemical perturbations, these methods do not provide a means to study the effects of mechanical force and tissue stiffness during development of the inner ear sensory organs. Here we describe a method for three-dimensional organotypic culture of the intact murine utricle and cochlea that overcomes these limitations. The technique for adjustment of a three-dimensional matrix stiffness described here permits manipulation of the elastic force opposing tissue growth. This method can therefore be used to study the role of mechanical forces during inner ear development. Additionally, the cultures permit virus-mediated gene delivery, which can be used for gain- and loss-of-function experiments. This culture method preserves innate hair cells and supporting cells and serves as a potentially superior alternative to the traditional two-dimensional culture of vestibular and auditory sensory organs.

Three-dimensional organotypic cultures of the murine utricle and cochlea in optically clear collagen I gels preserve innate tissue morphology, allow for mechanical stimulation through adjustment of matrix stiffness, and permit virus-mediated gene delivery.

Culture organotypique en trois dimensions des organes sensoriels vestibulaires et auditives

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

Une méthode In Vivo pour étudier l’intégrité barrière de sang-testicule souris

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

Analyse du développement de la chambre cardiaque durant l’embryogenèse de souris à l’aide de toute monture épifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic wound treatments are inadequate, while available pre-clinical models poorly predict the clinical efficacy of new therapies. Here we describe a high throughput, pre-clinical model to assess multiple aspects of the human skin repair response. Partial thickness wounds were created in human ex vivo skin and cultured across a healing time course. Skin wound biopsies were collected in fixative for the whole-mount staining procedure. Fixed samples were blocked and incubated in primary antibody, with detection achieved via fluorescently conjugated secondary antibody. Wounds were counterstained and imaged via confocal microscopy before calculating percentage wound closure (re-epithelialization) in each biopsy. Applying this protocol, we reveal that 2 mm excisional wounds created in healthy donor skin are fully re-epithelialized by day 4-5 post-wounding. On the contrary, closure rates of diabetic skin wounds are significantly reduced, accompanied by perturbed barrier reformation. Combining human skin wounding with a novel whole-mount staining approach allows a rapid and reproducible method to quantify ex vivo wound repair. Collectively, this protocol provides a valuable human platform to evaluate the effectiveness of potential wound therapies, transforming pre-clinical testing and validation.

Here we demonstrate an optimized technique for assessing wound repair using ex vivo human skin combined with a whole-mount staining approach. This methodology provides a pre-clinical platform for the evaluation of potential wound therapies.

Modèle de plaie ex vivo humaine et approche de coloration à montage entier pour évaluer avec précision la réparation de la peau

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic ...

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. Platforms have been recently developed for highly robust and prolonged ex utero culture of mouse embryos from egg-cylinder stages until advanced organogenesis. These platforms enable appropriate and faithful development of pregastrulating embryos (E5.5) until the hind limb formation stage (E11). Late gastrulating embryos (E7.5) are grown in rotating bottles in these settings, while extended culture from pregastrulation stages (E5.5 or E6.5) requires a combination of static and rotating bottle cultures. In addition, sensitive regulation of O2 and CO2 concentration, gas pressure, glucose levels, and the use of a specific ex utero culture medium are critical for proper embryo development. Here, a detailed step-by-step protocol for extended ex utero mouse embryo culture is provided. The ability to grow normal mouse embryos ex utero from gastrulation to organogenesis represents a valuable tool for characterizing the effect of different experimental perturbations during embryonic development.

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

An enhanced platform for whole-embryo culture allows continuous and robust ex utero development of postimplantation mouse embryos for up to six days, from pregastrulation stages until advanced organogenesis. In this protocol, we detail the standard procedure for successful embryo culture using static plates and rotating bottle systems.

Ex Utero Culture d’embryons de souris de la prégestrulation à l’organogenèse avancée

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. ...

Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis

Mammalian craniofacial development is a complex morphological process during which multiple cell populations coordinate to generate the frontonasal skeleton. These morphological changes are initiated and sustained through diverse signaling interactions, which often include protein phosphorylation by kinases. Here, two examples of physiologically-relevant contexts in which to study phosphorylation of proteins during mammalian craniofacial development are provided: mouse facial processes, in particular E11.5 maxillary processes, and cultured mouse embryonic palatal mesenchyme cells derived from E13.5 secondary palatal shelves. To overcome the common barrier of dephosphorylation during protein isolation, adaptations and modifications to standard laboratory methods that allow for isolation of phosphoproteins are discussed. Additionally, best practices are provided for proper analysis and quantification of phosphoproteins following western blotting of whole cell protein lysates. These techniques, particularly in combination with pharmacological inhibitors and/or murine genetic models, can be used to gain greater insight into the dynamics and roles of various phosphoproteins active during craniofacial development.

The protocol presents a method for isolating whole cell protein lysates from dissected mouse embryo facial processes or cultured mouse embryonic palatal mesenchyme cells and performing subsequent western blotting to assess phosphorylated protein levels.

Isolement des lysats de protéines de cellules entières à partir de processus faciaux de souris et de cellules de mésenchyme palatales cultivées pour l’analyse des phosphoprotéines

Mammalian craniofacial development is a complex morphological process during which multiple cell populations coordinate to generate the frontonasal ...